CN117604132A - 用于检测呼吸道病原体核酸的引物探针组合及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种用于检测呼吸道病原体核酸的引物探针组合及试剂盒，所述引物探针组合包括用于检测百日咳杆菌的引物探针组合、用于检测肺炎衣原体的引物探针组合和用于检测肺炎支原体的引物探针组合中的至少一种。本申请提供的引物探针组合能够鉴定出百日咳杆菌、肺炎支原体或肺炎衣原体中的至少一种，与其它呼吸道病毒、病原菌无交叉反应，不能对呼吸道合胞病毒、结核分支杆菌和军团菌进行非特异性扩增，可有效避免漏检与假阳性的情况，特异性强、灵敏度高，可实现快速检测。

Description

用于检测呼吸道病原体核酸的引物探针组合及试剂盒
技术领域
本申请涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种用于检测呼吸道病原体核酸的引物探针组合及试剂盒。
背景技术
呼吸道感染性疾病是临床常见的疾病类型，可分为上呼吸道感染和下呼吸道感染。上呼吸道感染主要累及鼻腔、咽/喉部等，而下呼吸道感染多为喉以下的气管支气管感染及肺部感染。根据世界卫生组织发布的2019年全球前10位死亡原因中，下呼吸道感染位居第4位，其导致260万人死亡；且在低、中、中高和高收入国家组中，下呼吸道感染是唯一一类均位列前10位死亡原因的感染性疾病。近年来，新型冠状病毒、禽流感病毒等呼吸道感染病原体也对儿童生命健康造成了产重威胁。明确感染病原体种类有助于呼吸道传染病的早发现、早隔离、早报告和早治疗。因此，快速准确的病原学诊断对于呼吸道常见感染性疾病的临床诊疔及防控具有重要意义。
常见的呼吸道病毒包括HRSV、HIFV、HRV、HPIV、HAdV、HMPV、CMV和HSV等，细菌包括肺炎支原体、肺炎衣原体、军团菌、百日咳杆菌和结核杆菌等。近年来，随着病原体单靶标聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、以症候群为基础的病原体多重PCR技术、微流控芯片技术、数字PCR技术、宏基因组高通量测序(mNGS)技术以及多重病原靶向测序(tNGS)技术的应用，大幅提高了呼吸道感染性疾病的病原体诊断能力，在病原体致病因子、耐药基因检测等方面也取得了重要进展。但是，针对呼吸道病原体的核酸检测的灵敏度、特异性还有待提高。
发明内容
本申请的目的在于提供一种用于检测呼吸道病原体核酸的引物探针组合及试剂盒，其特异性强、灵敏度高，可实现快速检测。具体技术方案如下：
本申请的第一方面提供了一种用于检测呼吸道病原体核酸的引物探针组合，包括：用于检测百日咳杆菌的引物探针组合、用于检测肺炎衣原体的引物探针组合和用于检测肺炎支原体的引物探针组合中的至少一种；
其中，所述用于检测百日咳杆菌的引物探针组合包括序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物BF、序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物BR和序列如SEQ ID NO：3所示的探针BP；
所述用于检测肺炎衣原体的引物探针组合包括序列如SEQ ID NO：4所示的上游引物CF、序列如SEQ ID NO：5所示的下游引物CR和序列如SEQ ID NO：6所示的探针CP；
所述用于检测肺炎支原体的引物探针组合包括序列如SEQ ID NO：7所示的上游引物MF、序列如SEQ ID NO：8所示的下游引物MR和序列如SEQ ID NO：9所示的探针MP。
在本申请的一些实施方式中，所述引物探针组合还包括用于检测人GAPDH基因的引物探针组合；所述用于检测人GAPDH基因的引物探针组合包括序列如SEQ ID NO：10所示的上游引物ICF、序列如SEQ ID NO：11所示的下游引物ICR和序列如SEQ ID NO：12所示的探针ICP。
在本申请的一些实施方式中，所述探针的5’端均标记荧光报告基团，所述探针的3’端均标记荧光淬灭基团；所述荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、ROX和CY5中的任意一种；所述荧光淬灭基团选自BHQ1和BHQ2中的任意一种。
在本申请的一些实施方式中，所述探针BP的5’端标记荧光报告基团FAM，所述探针BP的3’端标记荧光淬灭基团BHQ1；所述探针CP的5’端标记荧光报告基团VIC，所述探针CP的3’端标记荧光淬灭基团BHQ1；所述探针MP的5’端标记荧光报告基团ROX，所述探针MP的3’端标记荧光淬灭基团BHQ2；所述探针ICP的5’端标记荧光报告基团CY5，所述探针BP的3’端标记荧光淬灭基团BHQ2。
在本申请的一些实施方式中，所述引物探针组合不能对呼吸道合胞病毒、结核分支杆菌和军团菌进行扩增。
本申请的第二方面提供了本申请的第一方面所述的引物探针组合在制备用于检测呼吸道病原体核酸的试剂盒中的应用。
本申请的第三方面提供了一种用于检测呼吸道病原体核酸的试剂盒，其中，所述试剂盒包括本申请第一方面所述的引物探针组合。
在本申请的一些实施方式中，所述试剂盒还包括阴性质控品；所述阴性质控品包括含人GAPDH基因片段的重组质粒。
在本申请的一些实施方式中，所述人GAPDH基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。
在本申请的一些实施方式中，所述试剂盒还包括阳性质控品；所述阳性质控品包括含目标基因IS481片段的重组质粒、含目标基因MOMP片段的重组质粒和含目标基因16sRNA片段的重组质粒中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，所述目标基因IS481片段的核苷酸序列如SEQ IDNO：14所示。
在本申请的一些实施方式中，所述目标基因MOMP片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。
在本申请的一些实施方式中，所述目标基因16sRNA片段的核苷酸序列如SEQ IDNO：16所示。
本申请的第四方面提供了一种本申请的第一方面所述的引物探针组合或本申请第三方面所述的试剂盒在鉴定和/或检测呼吸道病原体中的应用，所述的应用为非疾病诊断目的的用途；其中，所述呼吸道病原体包括百日咳杆菌、肺炎支原体和肺炎衣原体中的至少一种。
本申请的有益效果：
本申请提供的引物探针组合能够鉴定出百日咳杆菌、肺炎支原体和肺炎衣原体中的至少一种，与其它呼吸道病毒、病原菌无交叉反应，不能对呼吸道合胞病毒、结核分支杆菌和军团菌进行非特异性扩增，可有效避免漏检与假阳性的情况，特异性强、灵敏度高(100拷贝/mL)，可实现快速检测，可以很好的为临床辅助鉴别诊断与治疗提供技术支持。本申请提供的用于检测呼吸道病原体的试剂盒检测时，特异性好、灵敏度高，操作简便，30分钟内完成检测；全程闭管检测，一管完成呼吸道病原体分型检测，避免了由于样本间的交叉污染引起的假阳性和环境污染。
当然，实施本申请的任一产品或方法并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员基于本申请所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请的第一方面提供了一种用于检测呼吸道病原体核酸的引物探针组合，包括：用于检测百日咳杆菌的引物探针组合、用于检测肺炎衣原体的引物探针组合和用于检测肺炎支原体的引物探针组合中的至少一种；
其中，所述用于检测百日咳杆菌的引物探针组合包括序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物BF、序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物BR和序列如SEQ ID NO：3所示的探针BP；
所述用于检测肺炎衣原体的引物探针组合包括序列如SEQ ID NO：4所示的上游引物CF、序列如SEQ ID NO：5所示的下游引物CR和序列如SEQ ID NO：6所示的探针CP；
所述用于检测肺炎支原体的引物探针组合包括序列如SEQ ID NO：7所示的上游引物MF、序列如SEQ ID NO：8所示的下游引物MR和序列如SEQ ID NO：9所示的探针MP。
本申请的用于检测呼吸道病原体核酸的引物探针组合，可以仅包括用于检测百日咳杆菌的引物探针组合、用于检测肺炎衣原体的引物探针组合和用于检测肺炎支原体的引物探针组合中的任意一种，其可以仅用于鉴定百日咳杆菌、肺炎衣原体或肺炎支原体中的一种病原体。
本申请的用于检测呼吸道病原体核酸的引物探针组合，也可以包括用于检测百日咳杆菌的引物探针组合、用于检测肺炎衣原体的引物探针组合和用于检测肺炎支原体的引物探针组合中的任意两种，其可以用于鉴定百日咳杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体中的两种病原体。
本申请的用于检测呼吸道病原体核酸的引物探针组合，也可以同时包括用于检测百日咳杆菌的引物探针组合、用于检测肺炎衣原体的引物探针组合和用于检测肺炎支原体的引物探针组合三种组合，其可以同时用于鉴定百日咳杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体中的三种病原体。
本申请选用百日咳杆菌、肺炎支原体和肺炎衣原体的保守基因区域进行特异性引物、探针设计，具体为：百日咳杆菌的IS481基因、肺炎衣原体的MOMP基因和肺炎支原体的16sRNA基因，得到的引物探针组合能够鉴定出百日咳杆菌、肺炎支原体或肺炎衣原体中的至少一种，与其它呼吸道病毒、病原菌无交叉反应，不能对呼吸道合胞病毒、结核分支杆菌和军团菌进行非特异性扩增，可有效避免漏检与假阳性的情况，特异性强、灵敏度高(100拷贝/mL)，可实现快速检测，可以很好的为临床辅助鉴别诊断与治疗提供技术支持。
在本申请的一些实施方式中，所述引物探针组合还包括用于检测人GAPDH基因的引物探针组合；所述用于检测人GAPDH基因的引物探针组合包括序列如SEQ ID NO：10所示的上游引物ICF、序列如SEQ ID NO：11所示的下游引物ICR和序列如SEQ ID NO：12所示的探针ICP。
本申请采用人基因组的GAPDH基因进行特异性引物、探针设计，配合阴性质控品进行使用，可以更好的进行质量控制。具体的，阴性质控品为含人GAPDH基因片段的重组质粒；在采用荧光定量PCR进行扩增时，同时选择FAM、VIC、ROX和CY5通道；如果FAM、VIC和ROX通道无扩增信号，CY5通道Ct值≤32，且扩增曲线呈典型“S”型，说明质量控制良好。
在本申请的一些实施方式中，所述探针的5’端均标记荧光报告基团，所述探针的3’端均标记荧光淬灭基团；所述荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、ROX和CY5中的任意一种；所述荧光淬灭基团选自BHQ1和BHQ2中的任意一种。在本申请中，FAM、VIC、HEX、ROX和CY5X为荧光PCR所需的常规荧光报告基团，BHQ1和BHQ2是荧光PCR所需的常规荧光淬灭基团，均可市售获得，本申请在此不做限定，例如，可以选用购自生工生物工程(上海)股份有限公司的荧光报告基团和荧光淬灭基团。
在本申请的一些实施方式中，所述探针BP的5’端标记荧光报告基团FAM，所述探针BP的3’端标记荧光淬灭基团BHQ1；所述探针CP的5’端标记荧光报告基团VIC，所述探针CP的3’端标记荧光淬灭基团BHQ1；所述探针MP的5’端标记荧光报告基团ROX，所述探针MP的3’端标记荧光淬灭基团BHQ2；所述探针ICP的5’端标记荧光报告基团CY5，所述探针BP的3’端标记荧光淬灭基团BHQ2。
在本申请的一些实施方式中，所述引物探针组合不能对呼吸道合胞病毒、结核分支杆菌和军团菌进行扩增。本申请选用百日咳杆菌、肺炎支原体和肺炎衣原体的保守基因区域进行特异性引物、探针设计，得到的引物探针组合能够鉴定出百日咳杆菌、肺炎支原体或肺炎衣原体中的至少一种，不能对呼吸道合胞病毒、结核分支杆菌和军团菌进行非特异性扩增，可有效避免假阳性的情况，特异性强。
本申请的第二方面提供了本申请的第一方面所述的引物探针组合在制备用于检测呼吸道病原体核酸的试剂盒中的应用。
本申请的第三方面提供了一种用于检测呼吸道病原体核酸的试剂盒，其中，所述试剂盒包括本申请的第一方面所述的引物探针组合。
在本申请的一些实施方式中，所述试剂盒还包括阴性质控品；所述阴性质控品包括含人GAPDH基因片段的重组质粒。本申请的阴性质控品配合用于检测人GAPDH基因的引物探针组合进行使用，可以更好的进行质量控制。具体的，在采用荧光定量PCR进行扩增时，同时选择FAM、VIC、ROX和CY5通道；如果FAM、VIC和ROX通道无扩增信号，CY5通道Ct值≤32，且扩增曲线呈典型“S”型，说明质量控制良好。
本申请对于所述的重组质粒的载体的类型没有特别限定，只要能够实现本申请的目的即可，例如可以为PUC57。
在本申请的一些实施方式中，所述人GAPDH基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。
在本申请的一些实施方式中，所述试剂盒还包括阳性质控品；所述阳性质控品包括含目标基因IS481片段的重组质粒、含目标基因MOMP片段的重组质粒和含目标基因16sRNA片段的重组质粒中的至少一种。采用阳性质控品可以更好的进行质量控制；具体的，在采用荧光定量PCR进行扩增时，同时选择FAM、VIC、ROX和CY5通道；如果FAM、VIC和ROX通道Ct值≤30，CY5通道Ct值≤32，且各通道扩增曲线呈典型“S”型，说明质量控制良好。
在本申请的一些实施方式中，所述目标基因IS481片段的核苷酸序列如SEQ IDNO：14所示。
在本申请的一些实施方式中，所述目标基因MOMP片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。
在本申请的一些实施方式中，所述目标基因16sRNA片段的核苷酸序列如SEQ IDNO：16所示。
在本申请的一些实施方式中，所述试剂盒还包括进行荧光PCR所需的试剂。在本申请中，对进行荧光PCR所需的试剂的选择没有特别限定，可以根据具体待测样品进行选择。例如，进行荧光PCR所需的试剂可以包括FastFire qPCR预混物(FastFire qPCR Premix)，也可以包括PCR反应液和Taq酶，其中，PCR反应液包括本申请所述的引物探针组合和PCR反应缓冲液；进行荧光PCR所需的试剂还可以包括DNA提取液。PCR反应缓冲液、DNA提取液、Taq酶等为PCR体系的常规通用试剂，均可市售获得，本申请在此不做限定。
本申请的第四方面提供了一种本申请第一方面所述的引物探针组合或本申请第二方面所述的试剂盒在鉴定和/或检测呼吸道病原体中的应用，所述的应用为非疾病诊断目的的用途；其中，所述呼吸道病原体包括百日咳杆菌、肺炎支原体和肺炎衣原体中的至少一种。
本申请提供的特异性引物探针组合用于检测呼吸道病原体的试剂盒检测时，特异性好、灵敏度高，操作简便，30分钟内完成检测；全程闭管检测，一管完成呼吸道病原体分型检测，避免了由于样本间的交叉污染引起的假阳性和环境污染。
用于检测检测呼吸道病原体核酸的引物探针组合及试剂盒设计
根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库分别选取百日咳杆菌、肺炎支原体和肺炎衣原体的相应保守基因，具体为：百日咳杆菌的IS481基因(GenBank：CP011448.1)、肺炎衣原体的MOMP基因(GenBank：AF131889.1)、肺炎支原体的16sRNA基因(GenBank：GenBank：AF132741.1)和人基因组的GAPDH基因(GenBank：NM_001357943.2)的核酸序列，设计用于检测检测呼吸道病原体核酸的引物探针组合，具体如下表1所示。
表1引物探针及检测靶点信息
用于检测呼吸道病原体核酸的试剂盒的具体组成如下表2所示。
表2试剂盒组成
表2中，FastFire qPCR预混物购自天根生化科技(北京)有限公司，引物探针BF、BR、BP、CF、CR、CP、MF、MR、MP、ICF、ICR和ICP由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，含人GAPDH基因片段的重组质粒、含目标基因IS481片段的重组质粒、含目标基因MOMP片段的重组质粒和含目标基因16sRNA片段的重组质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(选用的载体为PUC57，其序列如SEQ ID NO：17所示，构建方法为本领域常规的重组质粒构建方法)。其中，上述各个上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/L，探针的浓度均为10μmol/L；阴性质控品中含人GAPDH基因片段的重组质粒的浓度为5×105拷贝(copies)/mL；阳性质控品中含目标基因IS481片段的重组质粒、含目标基因MOMP片段的重组质粒和含目标基因16sRNA片段的重组质粒的浓度均为1×106拷贝/mL。
人GAPDH基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示：CAGCTCCTCTCCTACATCACCAAGGACAAGCAGACAGAGAGCCTGGTGGAAAAGCTGTGTCAGCGGTTCCGCACATCCCGGTATGCTGCCCTCCCTGAGGGTTCTTTGTGCTGAGCGGGGCCCTGCAGGGGAGAAAGGCCCATCCCTCACCCCTTCAATGCCCCCACTGTGGCATCCCTGGGACTGGGGAGGCTGATGGGGAAGGTTGAGCCTTTACTAGCTGGATCTCCCAGTTCCTCACAAAGCCCTTCCTATCTGCAGAACTGAGCGGCAGCAGCGAGACCTGGCCTACTGTGTGTCACAGCTGCCCCTCACAGAGCGAGGCCTCCGTAAGATGCTTGACAATTTTGACTGTTTTGGAGACAAACTGTCAGATGAGTCCATCTTCAGTGCTTTTTTGT。
目标基因IS481片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示：CGCCTGGGCGTGACCATCCAGCGCTTGCTCACCGACAATGGCTCGGCCTTTCGCAGCCGCGCCTTCGCCGCGCTGTGCCATGAGCTGGGCATCAAGCACCGCTTTACCCGACCTTACCGCCCACAGACCAATGGCAAGGCCGAACGCTTCATCCAGTCGGCCTTGCGTGAGTGGGCTTACGCTCACACCTACCAGAACTCCCAACACCGAGCCGATGCCATGAAATCCTGGCTACACCACTACAACTGGCATCGACCCCACCAAGGCATCGGGCGCGCTGTACCCATCTCCAGACTCAACCTGGACGAATACAACCTATTGACAGTTCACAGCTAGGGGGCGTCGTCGCCGTGACAGCCGCCAGCCTGGCC。
目标基因MOMP片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示：GCGTTCAATCTCGTTGGTTTATTCGGAGTTAAAGGTACTACTGTAAATGCAAATGAACTACCAAACGTTTCTTTAAGTAACGGAGTTGTTGAACTTTACACAGACACCTCTTTCTCTTGGAGCGTAGGCGCTCGTGGAGCCTTATGGGAATGCGGTTGTGCAACTTTGGGAGCTGAATTCCAATATGCACAGTCCAAACCTAAAGTTGAAGAACTTAATGTGATCTGTAACGTATCGCAATTCTCTGTAAACAAACCCAAGGGCTATAAAGGCGTTGCTTTCCCCTTGCCAACAGACGCTGGCGTAGCAACAGCTACTGGAACAAAGTCTGCGACCATCAATTATCATGAATGGCAAGTAGGAGCCTCTCTATCTTACAGACT。
目标基因16sRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示：TGCCAGCAGTCGCGGTAATACATAGGTCGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCAAGCGCAGGCGGATTGAAAAGTCTGGTGTTAAAGGCAGCTGCTTAACAGTTGTATGCATTGGAAACTATTAATCTAGAGTGTGGTAGGGAGTTTTGGAATTTCATGTGGAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGAAAACTTAGGCCATTACTGACGCTTAGGCTTGAAAGTGTGGGGAGCAAATAGGATTAGATACCCTAGTAGTCCACACCGTAAACGATAGATACTAGCTGTCGGGGCGATCCCCTCGGTAGTGAAGTTA。
载体PUC57的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示：TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCTCGCGAATGCATCTAGATATCGGATCCCGGGCCCGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC。
用于检测呼吸道病原体核酸的试剂盒的使用方法：
1、试剂准备
(1)按照表3制备试剂；
表3
组份 1人份用量(μL)
FastFire qPCR mix 15
上游引物BF(10μmol/L) 0.5
下游引物BR(10μmol/L) 0.5
探针BP(10μmol/L) 0.25
上游引物CF(10μmol/L) 0.4
下游引物CR(10μmol/L) 0.4
探针CP(10μmol/L) 0.2
上游引物MF(10μmol/L) 0.5
下游引物MR(10μmol/L) 0.5
探针MP(10μmol/L) 0.2
上游引物ICF(10μmol/L) 0.2
下游引物ICR(10μmol/L) 0.2
探针ICP(10μmol/L) 0.1
单蒸水(dH2O) 补齐至20μL
注：设试剂管数的理论验证数量为“N”，具体配制数量为N+2，具体配制量应以实际测试数为准。
(2)将步骤(1)配置好的试剂震荡混匀，分装20μL至八联管内，备用。
2、样本准备：利用天根生化科技(北京)有限公司的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，根据其说明书的操作对样本进行核酸提取，得到待测样本；并且对阴性质控品和阳性质控品进行核酸提取，得到阴性质控品样本和阳性质控品样本。
3、加样：分别向八联管内，每管加入10μL的待测样本或阴性质控品样本、阳性质控品样本，并拧紧管盖，瞬时离心3～5s。
4、扩增检测：
将上述八联管放入实时荧光定量PCR仪(厂商：Bio-Rad，型号CFX96)内，按照表4中的参数进行扩增。
表4
通道设定：同时选择FAM、VIC、ROX、Cy5通道。
5、质量控制
同一次实验必须同时满足以下要求：
阴性质控品：FAM、VIC和ROX通道无扩增信号，CY5通道Ct值≤32，且扩增曲线呈典型“S”型；
阳性质控品：FAM、VIC和ROX通道Ct值≤30，CY5通道Ct值≤32，且各通道扩增曲线呈典型“S”型。
6、结果判断：
每次检测在满足质量控制的基础之上再对检测结果进行分析；
阴性判定标准：FAM、VIC和ROX通道无扩增信号，且CY5通道Ct≤32；
阳性判定标准：FAM、VIC和ROX通道Ct≤37；
灰区判定标准：FAM、VIC和ROX任一通道37＜Ct≤40，需复检，若结果一致则判定为阳性。
实施例
以下，举出实施例来对本申请的实施方式进行更具体地说明。各种的试验及评价按照下述的方法进行。另外，只要无特别说明，“份”、“％”为质量基准。
实施例1：阴性质控品和阳性质控品验证
1、样本准备：根据NCBI数据库得到百日咳杆菌的IS481基因(GenBank：CP011448.1)、肺炎衣原体的MOMP基因(GenBank：AF131889.1)、肺炎支原体的16sRNA基因(GenBank：GenBank：AF132741.1)和人基因组的GAPDH基因(GenBank：NM_001357943.2)的核酸序列，并合成含目标基因IS481片段的重组质粒、含目标基因MOMP片段的重组质粒和含目标基因16sRNA片段的重组质粒和含有GAPDH基因的重组质粒，利用超纯水分别对含目标基因IS481片段的重组质粒、含目标基因MOMP片段的重组质粒和含目标基因16sRNA片段的重组质粒和含GAPDH基因的重组质粒进行稀释，分别得到含人GAPDH基因片段的重组质粒的浓度为5×105拷贝/mL的样本(阴性质控品)，以及含目标基因IS481片段的重组质粒、含目标基因MOMP片段的重组质粒和含目标基因16sRNA片段的重组质粒的浓度均为1×106拷贝/mL的样本(阳性质控品)。
2、将上述阴性质控品使用TE缓冲液进行1000倍稀释，分成五个样本Rep1、Rep2、Rep3、Rep4和Rep5。采用上述试剂盒的使用方法对样本Rep1、Rep2、Rep3、Rep4和Rep5进行验证，扩增检测Ct值见下表5。
表5
样本 FAM通道 VIC通道 ROX通道 CY5通道
Rep1 No Ct No Ct No Ct 24.15
Rep2 No Ct No Ct No Ct 24.25
Rep3 No Ct No Ct No Ct 25.01
Rep4 No Ct No Ct No Ct 24.33
Rep5 No Ct No Ct No Ct 24.17
由此可知，本申请所述的阴性质控品的FAM、VIC和ROX通道无扩增信号，CY5通道Ct值≤32，且扩增曲线呈典型“S”型，均符合质量控制要求。
3、将上述阳性质控品使用TE缓冲液进行10倍梯度稀释，得到五个样本；之后采用上述试剂盒的使用方法对样本进行验证，扩增检测Ct值见下表6。
表6
样本 FAM通道 VIC通道 ROX通道 CY5通道
103倍稀释 24.15 25.47 23.49 24.19
104倍稀释 20.89 21.36 20.24 24.22
105倍稀释 17.44 18.22 17.98 24.29
106倍稀释 13.99 13.45 14.56 24.33
107倍稀释 10.56 10.15 11.22 24.40
由此可知，本申请所述的阳性质控品的FAM、VIC和ROX通道Ct值≤30，CY5通道Ct值≤32，且各通道扩增曲线呈典型“S”型，均符合质量控制要求。
实施例2：特异性检测
根据NCBI数据库得到呼吸道合胞病毒的基因(GenBank：BD081927.1)、结核分支杆菌的基因(GenBank：GCF_000195955.2)和军团菌的基因(GenBank：NZ_BAZA00000000.1)的核酸序列，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成含呼吸道合胞病毒的基因的重组质粒、含结核分支杆菌的基因的重组质粒和含军团菌的基因的重组质粒(选用的载体为PUC57，其序列如SEQ ID NO：17所示，构建方法为本领域常规的重组质粒构建方法)，利用超纯水分别稀释含呼吸道合胞病毒的基因的重组质粒、含结核分支杆菌的基因的重组质粒和含军团菌的基因的重组质粒，使其浓度分别为3×106拷贝/mL，记为样本N1、N2和N3。
采用上述试剂盒的使用方法对试剂盒的特异性进行验证，扩增检测Ct值见下表7。
表7
样本 病原体种类 FAM通道 VIC通道 ROX通道 CY5通道 结果判定
N1 呼吸道合胞病毒 No Ct No Ct No Ct 23.14 阴性
N2 结核分支杆菌 No Ct No Ct No Ct 23.25 阴性
N3 军团菌 No Ct No Ct No Ct 23.22 阴性
从上表中可以看出，特异性样本N1-N3检测结果均为阴性，表明本申请提供的试剂盒检测呼吸道合胞病毒、结核分支杆菌和军团菌时无非特异性扩增。
实施例3：灵敏度检测
将上述阳性质控品使用TE缓冲液稀释至100拷贝/mL，分成二十个样本rep1-rep20。采用上述试剂盒的使用方法对样本rep1-rep20进行验证，扩增检测Ct值见下表8。
表8
从上表中可以看出，检测浓度为100拷贝/mL的质粒样本的阳性检出率均≥95％，即本申请提供的试剂盒的灵敏度为100拷贝/mL。
本申请提供的引物探针组合能够鉴定出百日咳杆菌、肺炎支原体和肺炎衣原体中的至少一种，与其它呼吸道病毒、病原菌无交叉反应，不能对呼吸道合胞病毒、结核分支杆菌和军团菌进行非特异性扩增，可有效避免漏检与假阳性的情况，特异性强、灵敏度高(100拷贝/mL)，可实现快速检测，可以很好的为临床辅助鉴别诊断与治疗提供技术支持。本申请提供的用于检测呼吸道病原体的试剂盒检测时，特异性好、灵敏度高，操作简便，30分钟内完成检测；全程闭管检测，一管完成呼吸道病原体分型检测，避免了由于样本间的交叉污染引起的假阳性和环境污染。
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请保护的范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测呼吸道病原体核酸的引物探针组合，包括：用于检测百日咳杆菌的引物探针组合、用于检测肺炎衣原体的引物探针组合和用于检测肺炎支原体的引物探针组合中的至少一种；
其中，所述用于检测百日咳杆菌的引物探针组合包括序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物BF、序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物BR和序列如SEQ ID NO：3所示的探针BP；
所述用于检测肺炎衣原体的引物探针组合包括序列如SEQ ID NO：4所示的上游引物CF、序列如SEQ ID NO：5所示的下游引物CR和序列如SEQ ID NO：6所示的探针CP；
所述用于检测肺炎支原体的引物探针组合包括序列如SEQ ID NO：7所示的上游引物MF、序列如SEQ ID NO：8所示的下游引物MR和序列如SEQ ID NO：9所示的探针MP。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其中，所述引物探针组合还包括用于检测人GAPDH基因的引物探针组合；所述用于检测人GAPDH基因的引物探针组合包括序列如SEQ IDNO：10所示的上游引物ICF、序列如SEQ ID NO：11所示的下游引物ICR和序列如SEQ ID NO：12所示的探针ICP。
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其中，所述探针的5’端均标记荧光报告基团，所述探针的3’端均标记荧光淬灭基团；所述荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、ROX和CY5中的任意一种；所述荧光淬灭基团选自BHQ1和BHQ2中的任意一种。
4.根据权利要求2所述的引物探针组合，其中，所述探针BP的5’端标记荧光报告基团FAM，所述探针BP的3’端标记荧光淬灭基团BHQ1；
所述探针CP的5’端标记荧光报告基团VIC，所述探针CP的3’端标记荧光淬灭基团BHQ1；
所述探针MP的5’端标记荧光报告基团ROX，所述探针MP的3’端标记荧光淬灭基团BHQ2；
所述探针ICP的5’端标记荧光报告基团CY5，所述探针BP的3’端标记荧光淬灭基团BHQ2。
5.根据权利要求1所述的引物探针组合，其中，所述引物探针组合不能对呼吸道合胞病毒、结核分支杆菌和军团菌进行扩增。
6.权利要求1-5中任一项所述的引物探针组合在制备用于检测呼吸道病原体核酸的试剂盒中的应用。
7.一种用于检测呼吸道病原体核酸的试剂盒，其中，所述试剂盒包括权利要求1-5中任一项所述的引物探针组合。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括阴性质控品；所述阴性质控品包括含人GAPDH基因片段的重组质粒；优选地，所述人GAPDH基因片段的核苷酸序列如SEQID NO：13所示。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括阳性质控品；所述阳性质控品包括含目标基因IS481片段的重组质粒、含目标基因MOMP片段的重组质粒和含目标基因16sRNA片段的重组质粒中的至少一种；
优选地，所述目标基因IS481片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；
优选地，所述目标基因MOMP片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示；
优选地，所述目标基因16sRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。
10.权利要求1-5中任一项所述的引物探针组合或权利要求7-9中任一项所述的试剂盒在鉴定和/或检测呼吸道病原体中的应用，所述的应用为非疾病诊断目的的用途；其中，所述呼吸道病原体包括百日咳杆菌、肺炎支原体和肺炎衣原体中的至少一种。
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