CN117586938A - 一种高效合成乳酰-n-新四糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用 - Google Patents

一种高效合成乳酰-n-新四糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高效合成乳酰‑N‑新四糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用，通过筛选高效的β‑1,3‑乙酰葡萄糖胺转移酶及β‑1,4‑半乳糖基转移酶并异源引入大肠杆菌BL21（DE3）中，对其进行基因组多位点的基因编辑，外加受体乳糖，构建高效生产乳酰‑N‑新四糖的菌株；进而优化其前体UDP‑乙酰氨基葡萄糖和UDP‑半乳糖的供应，增强乳糖的积累进一步提高乳酰‑N‑新四糖的产量。通过重组大肠杆菌进行培养和发酵，能够高效合成得到乳酰‑N‑新四糖，并且能够进一步提高所得产物的生物安全性，适用于制备食品或药物。

Description

一种高效合成乳酰-N-新四糖的重组大肠杆菌的构建方法及 应用
技术领域
本发明属于代谢工程领域，尤其是涉及一种高效合成乳酰-N-新四糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用。
背景技术
母乳中富含人体所需的六大营养物质，且易于新生儿消化吸收，是新生儿最理想、最优质的天然食品；人乳寡糖（HMOs）是母乳中重要的活性因子，主要包括唾液酸化、岩藻糖基化和非岩藻糖基化三大类，其中非岩藻糖基化寡糖LNnT含量相对丰富，报道表明其能够保护婴幼儿肠道菌群、促进免疫系统的发育、提高认知记忆能力；因此高效合成LNnT是生产更接近母乳的配方奶粉的重要目标。
目前乳酰-N-新四糖的人工合成主要采用化学合成法和酶法，微生物合成法的应用较少，而化学法和酶法成本较高且效率低；因此，微生物合成乳酰-N-新四糖受到科研学者的广泛关注。此前，已有研究对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌进行基因改造以合成乳酰-N-新四糖，但大多数都以导入游离质粒的方式增加产量，菌株表达不稳定，基因组整合改造的报道相对较少且难以达到规模化生产的要求，因而构建更高效的工程菌株以提高乳酰-N-新四糖的产量对母乳寡糖的研究。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种高效合成乳酰-N-新四糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用。
本发明采用的技术方案是：一种高效合成乳酰-N-新四糖的重组大肠杆菌，在底盘宿主细胞中插入lgtA和lgtB基因。
优选地，敲除其基因组中lacZ, wzzE, manA, ldhA, pflB, sthA glsA, glsB基因中的一种或多种，还插入或过表达galE和/或glmU基因。
优选地，以底盘宿主大肠杆菌为出发菌株，敲除lacZ，并在此位点整合lgtA；敲除wzzE，并在此位点整合galE及lgtB；敲除manA，并在此位点过表达glmU；敲除ldhA，并在此位点过表达lgtA及lgtB；敲除pflB，并在此位点过表达lgtB；敲除sthA，并在此位点过表达glnA；敲除glsA，并在此位点过表达lgtA；敲除glsB，并在此位点过表达lgtB，得到高效合成乳酰-N-新四糖的重组大肠杆菌。
优选地，整合或过表达基因使用23100启动子进行转录。
优选地，lgtA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，lgtB核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种乳酰-N-新四糖的制备方法，通过重组大肠杆菌培养并发酵得到。
优选地，重组大肠杆菌经种子培养获得种子液，再将种子液接种于发酵体系中，获得产乳酰-N-新四糖的发酵液；
种子培养基为LB液体培养基，将种子液接入发酵体系，于37℃，180 rpm条件下，培养至OD600为12时，加入10 g/L乳糖，每12 h补加10 g/L乳糖和20 g/L甘油，培养至72 h。
优选地，发酵培养基的配方为：胰蛋白胨2 g/L，酵母提取物4 g/L，甘油20 g/L，磷酸二氢钾13.5 g/L，磷酸氢二铵1.4 g/L，柠檬酸1.7 g/L，七水硫酸镁1.5 g/L，微量元素10ml/L。
乳酰-N-新四糖的制备方法制备得到的乳酰-N-新四糖在食品或药物中的应用。
本发明具有的优点和积极效果是：选出一种高效的β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶和一种β-1,4-半乳糖基转移酶并异源引入大肠杆菌BL21（DE3）中，并表达来源于大肠杆菌MG1655的galE基因，外加受体乳糖，构建出可以合成乳酰-N-新四糖的菌株；优化其合成前体UDP-乙酰氨基葡萄糖和UDP-半乳糖的代谢途径，提高供体和受体的积累，进一步提高乳酰-N-新四糖的产量；另外，通过本发明方法制备得到的重组工程菌，发酵过程无需添加抗生素，进一步提升了制备得到的乳酰-N-新四糖的生物安全性。
附图说明
图1为本发明重组大肠杆菌合成 乳酰-N-新四糖的代谢途径；
图2为对宿主菌依次进行基因编辑后摇瓶发酵乳酰-N-新四糖的产量比较；
图3为本发明重组大肠杆菌在5L发酵罐中产物、底物动态变化以及生长曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例做出说明。
本发明涉及一种高效合成乳酰-N-新四糖的重组大肠杆菌，以大肠杆菌BL21（DE3）为底盘宿主细胞，将β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶及β-1,4-半乳糖基转移酶并异源引入大肠杆菌BL21（DE3）中，对其进行基因组多位点的基因编辑，优化其合成前体UDP-乙酰氨基葡萄糖和UDP-半乳糖的代谢途径，提高供体和受体的积累，构建高效生产乳酰-N-新四糖的菌株；外源添加受体乳糖，以甘油和乳糖为底物，对重组工程菌进行培养和发酵，能够高效获得乳酰-N-新四糖。
为了进一步优化其前体UDP-乙酰氨基葡萄糖和UDP-半乳糖的供应，增强乳糖的积累进一步提高乳酰-N-新四糖的产量，还可对旁路合成路径中的关键酶进行编辑敲除，过表达利于合成乳酰-N-新四糖的酶，提高乳酰-N-新四糖合成路径在重组工程菌中的比重，如图1所示，从而实现高效合成乳酰-N-新四糖的目的。本发明某些实施例中，可敲除其基因组中lacZ, wzzE, manA, ldhA, pflB, sthA glsA, glsB基因中的一种或多种，除了插入lgtA和lgtB外, 还可插入或过表达galE和glmU。
其中，β-半乳糖苷酶基因lacZ的ID为8181469，肠杆菌共同抗原多糖共聚酶基因wzzE的ID为8182211，甘露糖-6-磷酸异构酶基因manA的ID为8181948，D-乳酸脱氢酶基因ldhA的ID为8181329，丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB的ID为8182293，吡啶核苷酸转氢酶基因sthA的ID为8183552，谷氨酰胺酶基因glsA的ID为8179676，谷氨酰胺酶基因glsB的ID为8181212；
葡萄糖胺-1-磷酸乙酰转移酶基因glmU的ID为8183714，UDP-葡萄糖4-差向异构酶基因galE的ID为945354，谷氨酰胺合成酶基因glnA的ID为8181063；β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶LgtA来源于奈瑟氏球菌(Neisseria sp.)，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；β-1,4-半乳糖基转移酶LgtB来源于流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae），优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.1：
ATGCAGCTGCTGGTGAGCGTGCTGATTTGCGCGTATAACGTGGAAAAATATTTTGCGCAGGCGCTGGATGCGGTGGTGCGCCAGACCTGGCGCAACTTAGAAATTTTTATTGTGGATGATGGCAGCACCGATGGCACCCTGGTGATTGCGAAAGATTTTCAGAAACGCGATAGCCGCATTAAAATTCTGGCGCAGGCCCAGAACAGCGGCCTGATTCCGAGCTTGAATACTGGCCTGGAAGAGATTATTAAGAGCGGCAAAGGCGAATATATTGCGCGCACCGATGCGGATGATATTGCGAGCCCGGATTGGATTGAGAAGATTGTGAGCGCGATGGAAAAAGATCGCGATATTATTGCGATGGGCGCGTGGCTGGAAGTGCTGAGCGAAGAAGGCGATGGCAATCGCTTAGCGCGCCATCATCGTCATGGCGCGATTTGGGATAAACCGACCCGCCATGAAGATATTGCGGCGGTGTTTCCGTTTGGCAACCCGATTCATAACAACACCATGATTATGCGCCGCAGCGTGATTGAAGGCGGCCTGCGCTATGATACCGAATGCGATTGGGCGGAAGATTATAAATTTTGGTACGAAGTGAGCAAACTGGGCCGCCTGGCGTATTATCCGGAAGCGCTGGTGAAATATCGCTTTCATGCGAACCAGGTTAGCAGCAAATATAGCACCCGCCAGCATGAAACCGCGCAGGGCATTCAGAAGACCATTCGCAACGATTTTCTGCAAAGCATTGGCTTTAAAACCCGCTTTGATAGCCTGGAATATCGCCAGACCAAAGCGGTGGCGTATGAACTGCTGGAAAAGGATCTGCCGGAAGATGACTTTGAACGCGTGCGCCATTTTCTGTATCAGTGCTTTAAATGGACCGATACCCCGCCGAGCAACGCATGGTTAGATTTTGCGGCGGATGGCAAAATGCGCCGCCTGTTTACCATGCGCCAGTATTTTAGCATTCTGCGCCGCCTGCTGAAAAACCGCTAA
SEQ ID NO.2：
ATGAGCGCGATTGAGAACATCGTCATCAGCATGGAAAACGCGACCGAACGTCGTAAACACATCACCAAGCAGTTCGAGAGCAAGAACCTGAGCTTCAGCTTCTTCAACGCGTACACCTACCAGAGCATTAACCAGAGCATCAACCAGAGCATCAACCAGAGCAACAGCATCCTGCACAACATCGAAGAGAGCCGTATTCTGACCAAAGGCGAGAAAGGTTGCCTGATTAGCCACTTCCTGCTGTGGAACAAGTGCGTTAACGAGAACCTGGAGTACCTGAAAATTTTTGAGGACGACGTTATTCTGGGCGAAAACGCAGAAGTCTTCCTGAACCAGAACGAGTGGCTGAAAACCCGCTTCGACTTCAACGACATCTTCATCATCCGCCTGGAAACCTTTCTGCGTCCGGTTAAACTGGAGAAGCAGACCAAAATCCCGCCGTTTAACAGCCGCAACTTCGATATCCTGAAAAGCACCCACTGGGGTACCGCAGGTTATATCATTAGCCAGGGCGCAGCGAAATACGTCATCGAATATCTGAAGAACATCCCGAGCGACGAAATTGTTGCGGTCGACGAACTGATCTTCAACAAGCTGGTCGACGTCGACAACTACATCGTCTACCAGCTGAACCCGGCAATTTGTATCCAGGAACTGCAGGCGAACCAGAGTAAAAGCGTTCTGACCTCTGGCCTGGAAAAAGAACGTCAGAAACGTCCGAAGATCCGCAAGAAGAAGACCCTGAAACAGCGTCTGACCCGCATCAAAGAGAACATCATCCGCGCACTGAACCGTAAAAAGTGGAAAGAACAGCAGCGCATCAAAGAGATGCAGGGCAAAGAAATCGTTCGCTTCATGTAA
构建重组大肠杆菌时，采用两步同源重组方法进行基因编辑，实现无痕敲除。使用氯霉素抗性基因与蔗糖敏感基因sacB通过重叠延伸PCR进行融合，第一步将cat-sacB片段整合到缺失基因位点，筛选出能够在氯霉素平板上生长的菌落进行PCR鉴定；第二步利用sacB基因的蔗糖聚合致死作用反筛出不含cat-sacB片段的菌株，再次进行PCR鉴定并测序验证，得到目的基因整合成功的菌株。上述第二步同源重组的片段通过重叠延伸PCR进行融合，将待敲除基因上游300-500bp和下游300-500bp分别融合到待插入基因片段的上游和下游，再通过重叠延伸PCR进行待敲除基因的敲除以及待插入基因片段的插入，其中待插入基因片段可包括一个基因或多个基因，还可在其5`端插入23100启动子；
以wzzE位点过表达galE和lgtB为例，取wzzE基因上游500bp同源臂与23100-galE融合，lgtB与wzzE基因下游500bp同源臂融合，再将两段产物再次融合即可。通过这样的构建方法，能够避免影响底盘宿主其他功能，有目的的进行敲除和整合，避免由于外源基因的介入，影响大肠杆菌内其他功能。
本发明某些实施例中，为了进一步确保整合的基因或过表达的基因能够高效表达，所有整合位点过表达的基因均使用23100启动子进行转录，23100启动子序列如SEQ IDNO.3所示。
SEQ ID NO.3：ttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagcaaggagatatact
构建得到的重组大肠杆菌能够用于高效合成乳酰-N-新四糖，经种子培养获得种子液，再将种子液接种于发酵体系中，获得产乳酰-N-新四糖的发酵液。发酵体系中的碳源为甘油，以乳糖为底物合成乳酰-N-新四糖；种子培养基为LB液体培养基，种子培养的条件为37℃，180 rpm，摇瓶培养14 h；将种子液接入发酵体系，于37℃，180 rpm条件下，培养至OD600为12时，加入10 g/L乳糖，每12 h补加10 g/L乳糖和20 g/L甘油，培养至72 h。
发酵培养基配方为：胰蛋白胨2 g/L，酵母提取物4 g/L，甘油20 g/L，磷酸二氢钾13.5 g/L，磷酸氢二铵1.4 g/L，柠檬酸1.7 g/L，七水硫酸镁1.5 g/L，微量元素10 ml/L。微量金属元素中含有水硫酸锌2.25 g/L，硫酸亚铁10 g/L，一水硫酸锰0.35 g/L，无水硫酸铜1.0 g/L，十水硼酸钠0.23 g/L，二水氯化钙2.0 g/L，钼酸铵0.11 g/L。
在摇瓶实验中，大肠杆菌生产乳酰-N-新四糖的能力提升至5.47 g/L，在5 L发酵罐中，产量达到36.46 g / L，为乳酰-N-新四糖的工业化生产奠定了基础。
下面结合附图对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。
实施例1：高效合成乳酰-N-新四糖的重组大肠杆菌的构建
1.1 重叠延伸PCR扩增片段
(1)lgtA、lgtB基因片段的获得：NCBI下载基因序列，委托苏州金唯智生物科技有限公司进行质粒合成，以合成质粒为模板，设计引物进行PCR扩增。
(2)galE基因片段的获得：以大肠杆菌MG1655基因组为模板，设计引物扩增。
(3)glmU、glnA基因片段的获得：以大肠杆菌BL21基因组为模板，设计引物进行扩增。
1.2 基因敲除与整合
使用λ-Red同源重组进行基因敲除，首先需要在宿主菌BL21（DE3）中导入pKD46质粒，诱导重组酶表达；进而使用含有重组酶的菌进行两步同源重组，使用氯霉素抗性基因与蔗糖敏感基因sacB通过重叠延伸PCR进行融合，第一步用cat-sacB片段置换待缺失基因，电转后涂布氯霉素和庆大霉素双抗平板，筛选出能在平板生长的菌落进行PCR鉴定；第二步利用sacB基因的蔗糖聚合致死作用反筛出不含cat-sacB片段的菌株，再次进行PCR鉴定并测序验证，得到目的基因整合成功的菌株。
利用上述基因编辑方法依次敲除大肠杆菌BL21（DE3）中lacZ, wzzE, manA, ldhA, pflB, sthA glsA, glsB基因，并依次基因组整合表达lgtA, galE-lgtB, glmU,lgtA-lgtB, lgtB, glnA, lgtA, lgtB，最后37℃消除pKD46质粒，得到最终的高产菌株。具体步骤如下：
以BL21(DE3)为出发菌株，敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ的表达，并在此位点整合β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶基因lgtA，获得菌株E0；在菌株E0的基础上，敲除大肠杆菌共同抗原多糖共聚酶基因wzzE的表达，并在此位点整合UDP-葡萄糖4-差向异构酶基因galE及β-1,4-半乳糖基转移酶基因lgtB，得到菌株E1；在菌株E1基础上，敲除甘露糖-6-磷酸异构酶基因manA，并在此位点过表达葡萄糖胺-1-磷酸乙酰转移酶基因glmU，得到菌株E2；在菌株E2基础上，敲除D-乳酸脱氢酶基因ldhA，并在此位点过表达β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶基因lgtA及β-1,4-半乳糖基转移酶基因lgtB，的的菌株E3；在菌株E3基础上，敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB，并在此位点过表达β-1,4-半乳糖基转移酶基因lgtB，得到菌株E4；在菌株E4基础上，敲除吡啶核苷酸转氢酶基因sthA，并在此位点过表达谷氨酰胺合成酶基因glnA，得到菌株E5；在菌株E5基础上，敲除谷氨酰胺酶基因glsA，并在此位点过表达β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶基因lgtA，得到菌株E6；在菌株E6基础上，敲除谷氨酰胺酶基因glsB，并在此位点过表达β-1,4-半乳糖基转移酶基因lgtB，得到菌株E7。其中获得的菌株E0-E7组成如表1所示，构建各个菌株使用的引物如表2所示。
表1 构建高产乳酰-N-新四糖的重组大肠杆菌过程菌
表2 构建高产乳酰-N-新四糖的重组大肠杆菌所用引物
实施例2：重组工程菌发酵合成乳酰-N-新四糖
分别对实施例1构建得到的E0-E7菌株进行培养和发酵，分别将重组菌株的种子液以5%的接种量接入发酵培养基中，37℃，180 rpm培养，发酵培养基的配方为：胰蛋白胨2 g/L，酵母提取物4 g/L，甘油20 g/L，磷酸二氢钾13.5 g/L，磷酸氢二铵1.4 g/L，柠檬酸1.7g/L，七水硫酸镁1.5 g/L，微量元素10 ml/L，当OD值达到12时，加入10 g/L乳糖，每12 h补加10 g/L乳糖和20 g/L甘油，发酵72 h。微量金属元素中含有水硫酸锌2.25 g/L，硫酸亚铁10 g/L，一水硫酸锰0.35 g/L，无水硫酸铜1.0 g/L，十水硼酸钠0.23 g/L，二水氯化钙2.0g/L，钼酸铵0.11 g/L。
发酵结束后，使用高效液相色谱仪对发酵液中的乳酰-N-新四糖的产量进行测定，乳酰-N-新四糖利用高效液相色谱仪进行检测：HPLC (Waterse2695)；色谱柱：Carbohydrate Analysis column(Rezex ROA-organic acid H+(8％)300×7.8 mm)；流动相：5 mM H2SO4；流速：0.5 mL/min；检测器：示差检测器；柱温60℃；进样量：10 μL。
高产乳酰-N-新四糖的重组大肠杆菌E0-E7菌株，在摇瓶体系和发酵罐体系中乳酰-N-新四糖表达情况如表3和图3所示，从数据能看出，通过对大肠杆菌的改造，能够显著提升重组大肠杆菌表达乳酰-N-新四糖（LNnT）的能力，尤其是菌株E7，5L发酵罐中重组菌株的乳酰-N-新四糖产量达到36.46 g/L。如图3所示是菌株E7在5L发酵罐中产物、底物动态变化以及生长曲线，从图中能够看出，重组工程菌能够不断消耗底物甘油和乳糖，并随着菌株OD值得升高，目标物乳酰-N-新四糖的表达量显著提升，证明构建得到的重组大肠杆菌能够高产乳酰-N-新四糖。
表3
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (8)

1.一种高效合成乳酰-N-新四糖的重组大肠杆菌，其特征在于：在底盘宿主细胞中插入lgtA和lgtB基因；
敲除其基因组中lacZ, wzzE manA, ldhA, pflB, sthA glsA, glsB基因中的一种或多种，还插入或过表达galE和/或glmU基因。
2.根据权利要求1所述的高效合成乳酰-N-新四糖的重组大肠杆菌，其特征在于：以底盘宿主大肠杆菌为出发菌株，敲除lacZ，并在此位点整合lgtA；敲除wzzE，并在此位点整合galE及lgtB；敲除manA，并在此位点过表达glmU；敲除ldhA，并在此位点过表达lgtA及lgtB；敲除pflB，并在此位点过表达lgtB；敲除sthA，并在此位点过表达glnA；敲除glsA，并在此位点过表达lgtA；敲除glsB，并在此位点过表达lgtB，得到高效合成乳酰-N-新四糖的重组大肠杆菌。
3.根据权利要求2所述的高效合成乳酰-N-新四糖的重组大肠杆菌，其特征在于：整合或过表达基因使用23100启动子进行转录。
4.根据权利要求1-3中任一所述的高效合成乳酰-N-新四糖的重组大肠杆菌，其特征在于：lgtA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，lgtB核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.一种乳酰-N-新四糖的制备方法，其特征在于：通过权利要求1-4中任一所述的重组大肠杆菌培养并发酵得到。
6.根据权利要求5所述的乳酰-N-新四糖的制备方法，其特征在于：重组大肠杆菌经种子培养获得种子液，再将种子液接种于发酵体系中，获得产乳酰-N-新四糖的发酵液；
种子培养基为LB液体培养基，将种子液接入发酵体系，于37℃，180 rpm条件下，培养至OD600为12时，加入10 g/L乳糖，每12 h补加10 g/L乳糖和20 g/L甘油，培养至72 h。
7.根据权利要求6所述的乳酰-N-新四糖的制备方法，其特征在于：发酵培养基的配方为：胰蛋白胨2 g/L，酵母提取物4 g/L，甘油20 g/L，磷酸二氢钾13.5 g/L，磷酸氢二铵1.4g/L，柠檬酸1.7 g/L，七水硫酸镁1.5 g/L，微量元素10 ml/L。
8.权利要求5-7中任一所述的乳酰-N-新四糖的制备方法制备得到的乳酰-N-新四糖在食品或药物中的应用。
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