CN117568525A - 一种检测尼帕病毒的引物组、修饰引物组及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测尼帕病毒的引物组、修饰引物组及其应用，属于检验检疫技术领域。本发明对尼帕病毒的G蛋白基因和P蛋白基因进行引物设计，所设计的引物具有灵敏度高、特异性好的优势，而且能够与微流控、胶体金方法结合使用。利用微流控技术，在芯片中完成目的片段扩增，最后通过胶体金技术，实现可视化结果，具有方便、简捷、灵敏度高、重复性好的特点。本发明反应在微流控芯片反应腔内从RNA到扩增结束一步完成，省去了逆转录到扩增的两步反应，减少了开盖污染，避免出现假阳性的结果。本发明检测下限不高于1048copies/μL。

Description

一种检测尼帕病毒的引物组、修饰引物组及其应用
技术领域
本发明属于检验检疫技术领域，尤其涉及一种检测尼帕病毒的引物组、修饰引物组及其应用。
背景技术
尼帕病毒(NiV)是亨尼帕病毒属的人畜共患病原体，可引起人类脑炎和呼吸道症状，致死率高达75％。NiV是单股负链RNA病毒，基因组含有18246个核苷酸，编码6种结构蛋白，依次是核蛋白(nucleoprotein，N)、磷蛋白(phosphpprotein，P)、基质蛋白(matrix-protein，M)、融合蛋白(fusionprotein，F)、糖蛋白(glycoprotein，G)和大蛋白(1argeprotein，L)。尼帕病毒入侵宿主细胞是通过pH非依赖性的膜融合机制实现的，这其中蛋白F和G是必需的。P蛋白mRNA编码709个氨基酸，比其他的副黏病毒的P蛋白多100个氨基酸，分子量约为78ku，是P基因中编码的最大蛋白，P蛋白有两个主要的功能：一是保护病毒基因组RNA免受破坏；二是参与病毒RNA的转录和复制，它是NiV主要的免疫显性抗原，也是病毒基因组中具有最多分叉的蛋白。G蛋白mRNA编码602个氨基酸，分子量约为67ku，为病毒表面糖蛋白，能刺激机体产生中和性抗体，是主要的保护性抗原。
NiV患者的治疗和NiV疾病控制都需要具有高灵敏度和特异性的诊断测试，以便能够早期发现人类NiV感染。传统上，NiV的准确诊断依赖于血清学、分子或病毒学分析，核酸扩增试验(NAATs)，如逆转录酶PCR(RT-PCR)，是检测活动性病毒感染的首选方法。然而，NiV感染往往发生在卫生和实验室基础设施较差的地区，这些基础设施较差的地区都不具备NAATs所需的实验室基础设施。ELISA等血清学检测方法具有温度依赖性，假阳性率高，只能提供NiV感染的间接证据。仅针对NiV病原N基因检测，也会由于样品选择不当、无法区分转录子和病毒基因组等原因造成假性检测结果。因此发展一种检测速度快、使用方便、经济有效、结果准确以及能在资源匮乏的区域兼容的检测方法很有必要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能够即时检测尼帕病毒的引物组，能够与微流控胶体金检测技术相结合使用，具有方便、简捷、灵敏度适中、特异性好、准确度高的优势。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种检测尼帕病毒的引物组，所述引物组为组1引物和组2引物中的至少一组；组1引物中引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；组2引物中引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种检测尼帕病毒的修饰引物组，采用荧光基团和半抗原标记上述引物组。
优选的，所述荧光基团包括6-FAM，所述半抗原包括地高辛。
本发明还提供了上述引物组或上述修饰引物组在制备尼帕病毒检测产品中的应用。
本发明还提供了一种尼帕病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。
本发明还提供了一种尼帕病毒微流控PCR-胶体金检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的修饰引物组、微流控芯片和胶体金检测试纸条；所述胶体金检测试纸条的上样板处固定有抗荧光基团抗体，质控线处有抗荧光基团抗体的抗体，检测线设计为半抗原结合线。
本发明还提供了一种非诊断目的的尼帕病毒微流控PCR-胶体金检测方法，包括如下步骤：将含有待测样本RNA和修饰引物组的反应体系添加到微流控芯片的加样孔中，利用微流控PCR仪反应，反应结束后，采用胶体金检测试纸条进行检测，检测线和质控线均显色为阳性，仅质控线显色为阴性，若质控线未显色，则视为结果无效，需要重测。
优选的，当所述修饰引物组为组1引物的修饰引物组时，所述微流控PCR仪的反应程序为：55℃ 5min；95℃ 150s，1个循环；95℃ 5s、60℃ 20s，35个循环。
优选的，当所述修饰引物组为组2引物的修饰引物组时，所述微流控PCR仪的反应程序为：55℃ 5min；95℃ 150s，1个循环；95℃ 5s、55℃ 20s，35个循环。
优选的，所述反应体系以20μL计，包括酶混合液1μL、Buffer混合液14μL和模板5μL。
本发明的有益效果：
本发明避免选择高转录活性的尼帕病毒N基因作为靶点，同时增加低转录活性的尼帕病毒P和G双基因作为靶点，保证了病毒分子诊断的可靠性。本发明对NiV的G蛋白和P蛋白进行引物设计，所设计的引物具有准确度高、灵敏度适中、特异性好的优势，而且能够与微流控、胶体金方法结合使用。利用微流控技术，在芯片中完成目的片段扩增，最后通过胶体金技术，实现可视化结果，具有方便、简捷、灵敏度高、重复性好的特点。本发明反应在微流控芯片反应腔内从RNA到扩增结束一步完成，省去了逆转录到扩增的两步反应，减少了开盖污染，避免出现假阳性的结果。本发明检测下限不低于1048copies/μL。
本发明提供的试剂盒能即时检测，在采样现场即刻进行分析，减少了对样品复杂处理程序，快速得到检验结果，对快速控制生物危害、防止感染传播以及诊断偏远地区的传染病具有重大意义。本发明采用微流控胶体金检测技术，可在现场完成核酸提取到PCR扩增再到检测结果的整个过程，极大地压缩了诊断的时间。除此之外，微流控加上胶体金技术的诊断结果准确率极高，并且基本实现了自动检测的流程，还能做到压缩检测成本提高效率的作用。
本发明利用了微流控技术，将检测等过程集成到了几平方厘米的芯片上，实现了微型化、自动化、集成化和便携化。具有样品消耗少、检测速度快、操作简便、多功能集成、体积小和便于携带等优点，极大地拓展了现场即时诊断的应用空间。
附图说明
图1为胶体金反应原理；
图2为胶体金试纸卡盒使用流程图，由左到右分别表示揭开卡盒背面的出液口密封胶条，将芯片安装到卡盒背面的卡槽中，向外掰开卡盒正面的4个支撑柱，缓缓按压推杆到底共4个步骤；
图3为加样时芯片摆放方式；
图4为微流控PCR仪；
图5为检验结果的解释，其中1表示阳性，2表示阴性，3表示无效，4表示无效；
图6为NiV-G质粒分析；
图7为NiV-P质粒分析；
图8为革兰氏染色结果，左图为NiV-P大肠杆菌染色结果，右图为NiV-G大肠杆菌染色结果；
图9为麦康凯琼脂平板结果，左图为NiV-G结果，右图为NiV-P结果；
图10为伊红美蓝琼脂平板结果，左图为NiV-P结果，右图为NiV-G结果；
图11为不同引物对扩增结果，其中1对应对比例1的P42-168引物对结果，2对应对比例1的P9-166引物对结果，3对应实施例2引物对结果，4对应对比例2的F147-349引物对结果，5对应对比例2的F762-1009引物对结果，6对应实施例3引物对结果，M为marker；
图12为实施例2所述引物对的特异性验证结果，其中M为marker，P为阳性对照，N为阴性对照，其余为不同种类病毒；
图13为实施例3所述引物对的特异性验证结果，其中M为marker，P为阳性对照，N为阴性对照，其余为不同种类病毒；
图14为实施例6修饰引物对特异性验证结果，其中P为阳性对照，A为非洲猪瘟阳性样本，R为猪轮状病毒样本，E为PEDV阳性细胞样，D为PDCoV阳性细胞样，O为OZK93，S为PRRSV，T为TGEV，最右侧无标记的为阴性对照；
图15为微流控PCR结束后琼脂糖凝胶电泳结果，图中各字母代号表示的组别同图14；
图16为实施例7修饰引物对特异性验证结果，其中P为阳性对照，A为非洲猪瘟阳性样本，R为猪轮状病毒样本，E为PEDV阳性细胞样，D为PDCoV阳性细胞样，N为阴性对照；
图17为实施例7修饰引物对特异性验证结果，其中从左到右为阳性对照、OZK93、PRRSV、TGEV和阴性对照；
图18为微流控PCR结束后琼脂糖凝胶电泳结果，图中各字母代号表示的组别同图16；
图19为微流控PCR结束后琼脂糖凝胶电泳结果，其中S为PRRSV病毒，T为TGEV，O为OZK93，N为阴性对照，P为阳性对照；
图20为实施例2所述引物对普通PCR的敏感性验证结果，其中N为阴性对照；M为marker，1-7分别对应6.46×109copies/μL、6.46×107copies/μL、6.46×105copies/μL、6.46×103copies/μL、6.46×102copies/μL、64.6copies/μL和6.46copies/μL；
图21为实施例3所述引物对普通PCR的敏感性验证结果，其中N为阴性对照，M为marker，1-3分别对应2965copies/μL、296.5copies/μL和29.65copies/μL；
图22为实施例6所述修饰引物对灵敏度检测结果，从左到右分别为阴性对照、104.8copies/μL、1048copies/μL、10480copies/μL；
图23为实施例6所述修饰引物对微流控PCR结束后琼脂糖凝胶电泳结果，其中1-3分别对应10480copies/μL、1048copies/μL、104.8copies/μL，N为阴性对照，M为marker；
图24为实施例7所述修饰引物对灵敏度检测结果，从左到右分别为9360copies/μL、936copies/μL、93.6copies/μL、阴性对照；
图25为实施例7所述修饰引物对微流控PCR结束后琼脂糖凝胶电泳结果，其中1-4分别对应9360copies/μL、936copies/μL、93.6copies/μL和阴性对照，M为marker；
图26为尼帕病毒G蛋白和P蛋白混合样本的检测结果，其中1为实施例7引物的阴性对照，2为实施例6引物的阴性对照，3为实施例6(NiV-P)阳性结果，4为实施例7(NiV-G)阳性结果。
上述图中涉及到的Marker都是2000bp的。
具体实施方式
本发明提供了一种检测尼帕病毒的引物组，所述引物组为组1引物和组2引物中的至少一组；组1引物中引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；组2引物中引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
在本发明中，组1引物是针对尼帕病毒P蛋白基因序列设计的引物对，正向引物的核苷酸序列为TGTCGAACACCCGTGACTG(SEQ ID NO.1)，反向引物的核苷酸序列为ATCACTCCACCCTCTCTCAGG(SEQ ID NO.2)。组2引物是针对尼帕病毒G蛋白基因序列设计的引物对，正向引物的核苷酸序列为AACCCACTCCCTTTTAGAGA(SEQ ID NO.3)，反向引物的核苷酸序列为TCACCTCTGTCTAGTACCTCTCC(SEQ ID NO.4)。
本发明还提供了一种检测尼帕病毒的修饰引物组，采用荧光基团和半抗原标记上述引物组。
在本发明中，所述荧光基团优选的包括6-FAM，所述半抗原优选的包括地高辛。在本发明中，采用荧光基团和半抗原标记上述组1引物时，优选的采用地高辛标记正向引物，具体为：5’-dig-TGTCGAACACCCGTGACTG，采用FAM标记反向引物，具体为：5’6-FAM-ATCACTCCACCCTCTCTCAGG。采用荧光基团和半抗原标记上述组2引物时，优选的采用FAM标记正向引物，具体为：5’6-FAM-AACCCACTCCCTTTTAGAGA，采用地高辛标记反向引物，具体为：5’-dig-TCACCTCTGTCTAGTACCTCTCC。本发明对于FAM和地高辛的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。
本发明还提供了上述引物组或上述修饰引物组在制备尼帕病毒检测产品中的应用。在本发明中，所述产品优选的包括试剂盒。
本发明还提供了一种尼帕病毒检测试剂盒，所述试剂盒优选的包括上述引物组。本发明所述尼帕病毒检测试剂盒优选的还包括阳性参考品质粒，所述阳性参考品质粒优选的经由如下步骤制备所得：对含NiV-G和NiV-P基因序列的大肠杆菌(本发明中具体指的是生工生物工程(上海)股份有限公司合成的携带基因和puc57载体的top10大肠杆菌)提取质粒，将质粒作为模板，用Niv-g-all-f-r(SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6)、Niv-P-all-f-r(SEQID NO.7、SEQ ID NO.8)引物对目的片段进行扩增；随后跑琼脂糖凝胶电泳进行胶回收；以TransGen公司的pEasy-Blunt(CB101)为克隆载体以及Trans1-T1Phage感受态制备阳性参考品质粒。
本发明还提供了一种尼帕病毒微流控PCR-胶体金检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的修饰引物组、微流控芯片和胶体金检测试纸条；所述胶体金检测试纸条的上样板处固定有抗荧光基团抗体，质控线处有抗荧光基团抗体的抗体，检测线设计为半抗原结合线。
在本发明中，所述微流控芯片购自于北京源景泰科生物科技有限公司，进行微流控反应时，微流控芯片与微流控PCR仪需配套使用，故本发明微流控PCR仪购自于北京源景泰科生物科技有限公司。本发明所述胶体金检测试纸条交由北京源景泰科生物科技有限公司制备所得，胶体金反应原理见图1。在试纸条上样板处有着抗荧光抗体，上样的时候会和含有荧光基团的目的DNA随着液体往检测线方向流动；本发明设计修饰引物上带有两个基团，因此，所扩增出来的目的蛋白在5’端就有这两个基团。在试纸条上有半抗原(生物素/地高辛)结合线，既含有生物素/地高辛基团又含有荧光基团的目的蛋白就会结合到这个结合线上，并显色。如果上样溶液中不含标记的目的蛋白，那么，溶液中即使含有其他蛋白也不会在生物素/地高辛结合位点结合上显色。但是样板上的抗荧光基团的抗体会和质控(control)线结合并显色，结果为阴性。所以control线一定是显色的，如果不显色，那么表明试纸条有问题，需换试纸条重新检测。
在本发明中，交由北京源景泰科生物科技有限公司的胶体金检测试纸条优选的为卡盒结构，微流控PCR反应结束后，优选的将微流控芯片安装到卡盒背面的卡槽中，具体流程如图2所示。在本发明中，微流控PCR反应结束后，也可以将微流控芯片中的反应液滴加到胶体金检测试纸条的上样位置处，进行显色反应。或者取反应液，将胶体金检测试纸条的上样位置插入反应液中，进行显色反应。
本发明尼帕病毒微流控PCR-胶体金检测试剂盒优选的还包括RNA阳性参考品，所述RNA阳性参考品优选的经由如下步骤制备所得：用通用引物M13对上述阳性参考品质粒进行扩增后，进行胶回收，得到含T7启动子的目的片段，再对线性片段进行体外转录，获得该目的片段的RNA，经纯化得RNA阳性参考品，其中NiV-G的RNA阳性参考品的核苷酸序列如SEQID NO.17所示，NiV-P的RNA阳性参考品的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
本发明还提供了一种非诊断目的的尼帕病毒微流控PCR-胶体金检测方法，优选的包括如下步骤：将含有待测样本RNA和修饰引物组的反应体系添加到微流控芯片的加样孔中，利用微流控PCR仪反应，反应结束后，采用胶体金检测试纸条进行检测，检测线和质控线均显色为阳性，仅质控线显色为阴性，若质控线未显色，则视为结果无效，需要重测。
本发明对于获得待测样本RNA的具体方式没有特殊限定，采用本领域常规核酸提取方法均可。在本发明中，所述反应体系按照20μL的体积计，各原料的配比优选的如表1所示。
表1反应体系
试剂名称 体积
酶混合液 1μL
Buffer混合液 14μL
模板(待测样本) 5μL
表1中酶混合液的具体配比优选的如表2所示，表1中Buffer混合液的具体配比优选的如表3所示。
表2酶混合液(50次)配方
试剂名称 规格 体积
Taq DNA Polymerase-无甘油 5U/μL 10～15μL
Mutiscript Reverse Transcriptase II-无甘油 200U/μL 5～10μL
RNasin-无甘油 40U/μL 7～12μL
Heat-labileUracil-DNAGlycosylase-1无甘油 1U/μL 10～20μL
表3 Buffer混合液(检测缓冲液)(50次)配方
本发明对于上述各原料的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。将含有待测样本RNA和修饰引物组的反应体系添加到微流控芯片的加样孔时，微流控芯片的摆放如图3所示。本发明所采用的微流控PCR仪购自北京源景泰科生物科技有限公司，如图4所示。微流控PCR仪反应结束后，采用胶体金检测试纸条进行检测，结果判定如图5所示，若检测线(T)和质控线(C)均显色为阳性，仅质控线(C)显色为阴性，若质控线(C)未显色，则视为结果无效，需要重测。
在本发明中，采用的修饰引物组为组1引物的修饰引物组时，所述微流控PCR仪的反应程序优选的为：55℃ 5min；95℃ 150s，1个循环；95℃ 5s、60℃ 20s，35个循环。采用的修饰引物组为组2引物的修饰引物组时，所述微流控PCR仪的反应程序优选的为：55℃5min；95℃ 150s，1个循环；95℃ 5s、55℃ 20s，35个循环。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中涉及到的图中的所有Marker都是2000bp的。
实施例1
普通PCR阳性参考品的制备
委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成了含有尼帕病毒G、P两段基因序列的质粒菌种(pUC57载体的top10大肠杆菌)作为标准品，由于该公司制备的菌种不含T7启动子，后续需要进行体外转录，因此对该公司合成的含NiV-G和NiV-P基因序列的标准品提取质粒(诺唯赞，DC201-01)，将质粒作为模板，用Niv-g-all-f-r(SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6)、Niv-P-all-f-r(SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8)引物对目的片段进行扩增，扩增用KOD酶：反应体系为12.5μL：上下游引物：0.5μL，模板1μL，水10.5μL；反应程序：98℃，3min共一循环；98℃，10s，55℃，5s，68℃，7s共35循环；72℃，5min。随后跑琼脂糖凝胶电泳进行胶回收；以TransGen公司的pEasy-Blunt(CB101)为克隆载体以及Trans1-T1Phage感受态制备阳性参考品(含有目的基因的Trans T1 phage大肠杆菌)。构建好的阳性参考品用质粒提取试剂盒(诺唯赞，DC201-01)提取质粒，并送生工测序验证。测序结果用MegAlign软件进行比对分析，结果如图6和图7所示，并未发生碱基的改变。另外，进行以下方面的鉴定：
形态和生化特性为革兰氏阴性直杆菌，经革兰氏染色显微镜下观察，可见红色小杆菌，两端钝圆，大小约为0.4～0.7μm×2～3μm(图8)，符合大肠杆菌的染色特性。
生化鉴定结果如表4所示，NiV-P、NiV-G菌株三糖铁基底和斜面均呈黄色，发酵葡萄糖、产气，发酵麦芽糖、鼠李糖，尿素酶阴性，M.R.阳性，V.P.阴性，符合大肠杆菌的生化特性。
表4菌种生化鉴定特性
菌种 葡萄糖产气 麦芽糖 鼠李糖 H2S 尿素酶 M.R. V.P. TSI
NiV-P + + + - - + - 黄色
NiV-G + + + - - + - 黄色
注：“+”代表结果判为阳性；“-”代表结果判为阴性。
NiV-P、NiV-G均具有氨苄(Amp+)。培养特性NiV-P、NiV-G在LB(Amp+)液体培养基中生长较快，37℃培养12～20小时后，呈均匀浑浊，管底有黏性沉淀。在LB固体平板(称取商品化LB琼脂粉末36g，加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌至完全溶解后分装至三角瓶，121℃高压灭菌15分钟。待培养基冷却至50℃左右加入终浓度为100μg/ml Amp，混合均匀倾注无菌培养皿，凝固后4～8℃保存备用)上37℃培养24小时后，形成边缘整齐，圆形凸起，表面有光泽、湿润、光滑，半透明、灰白色的菌落，直径2～3mm。在麦康凯琼脂平板(称取商品化麦康凯琼脂粉末55g，加入蒸馏水或去离子水11，搅拌至完全溶解后分装至三角瓶，121℃高压灭菌15分钟，冷却至50℃左右倾注无菌培养皿，凝固后4～8℃保存备用)上形成黑色带金属闪光菌落，如图9所示；在伊红美蓝琼脂平板(称取商品化伊红美蓝琼脂培养基粉末37.5g，加入蒸馏水或去离子水11，搅拌至完全溶解后分装至三角瓶，121℃高压灭菌15分钟，冷却至50℃左右倾注无菌培养皿，凝固后4～8℃保存备用)上形成红色菌落，如图10所示。
分子生物学特性：分别将菌种NiV-P、NiV-G接种于LB(Amp+)液体培养基中，37℃振荡培养12小时，所获得菌液按质粒提取试剂盒说明书提取质粒(诺唯赞，DC201-01)，以质粒作为模板进行PCR以及基于胶体金的微流控法检测。经琼脂糖凝胶电泳后能够见清晰目的条带；在胶体金条上也有阳性条带。
上述鉴定结果表明，的确获得了含有NiV-P、NiV-G基因的普通PCR阳性参考品。
微流控PCR-胶体金阳性参考品的制备
对上述制备所得的普通PCR阳性参考品用通用引物M13进行扩增，后使用胶回收试剂盒(BioFlux，BSC02S1)进行胶回收，得到含T7启动子的目的片段，再用体外转录试剂盒(诺唯赞TR101-01)对线性片段进行体外转录，获得该目的片段的RNA(分别如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示)，经纯化(近岸蛋白No.：S125)作为微流控PCR-胶体金阳性参考品。
实施例2
核酸提取：将待测样品按市售病毒核酸提取试剂盒说明书提取核酸后(RNA提取试剂盒，纽基生化；M062)，直接用于检测。若样品提取后不立即检测，于-70℃保存备用，应避免反复冻融。
采用NiV-P257-F：TGTCGAACACCCGTGACTG(SEQ ID NO.1)和NiV-P414-R：ATCACTCCACCCTCTCTCAGG(SEQ ID NO.2)引物对对提取的核酸进行PCR扩增，反应程序为95℃，3min共一个循环；95℃，15s，60℃，15s，72℃，20s共35个循环；72℃，5min共一个循环，反应体系为20μL，其中Taq酶(诺唯赞)：10μL，正反向引物均为0.2μL，H2O：4.6μL，模板(待测样本)：5μL。扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，若出现条带，则表明待测样品中含有尼帕病毒，若没有出现条带，则表明待测样品中不含尼帕病毒。
实施例3
与实施例2的区别在于所用的引物对为NiV-G490-F：
AACCCACTCCCTTTTAGAGA(SEQ ID NO.3)和NiV-G779-R：
TCACCTCTGTCTAGTACCTCTCC(SEQ ID NO.4)，反应程序为95℃，3min共一个循环；95℃，15s，55℃，15s，72℃，20s共35个循环；72℃，5min共一个循环，其余均同实施例2。若出现条带，则表明待测样品中含有尼帕病毒，若没有出现条带，则表明待测样品中不含尼帕病毒。
对比例1
与实施例2的区别在于所用的引物对不同，其余均同实施例2。具体所用引物为：针对尼帕病毒P蛋白的保守区域另外设计两对引物，其中一对引物(记为P42-168)为NiV-P42-F：CCCCCTACCAAGAAGGCAAG(SEQ ID NO.9)和NiV-P 168-R：TATTTATCATCAAGTGAGTCGTTGTC(SEQ ID NO.10)，另一对引物(记为P9-166)为NiV-P9-F：
TGAAGAACAAGTTAAAGAGATCCCA(SEQ ID NO.11)和NiV-P 166-R：TCCCCTTTCTTTCTCCTTTCCC(SEQ ID NO.12)。
对比例2
与实施例3的区别在于所用的引物对不同，其余均同实施例3。具体所用引物为：针对尼帕病毒G蛋白的保守区域另外设计两对引物，其中一对引物(记为F147-349)为NiV-F147-F：AAGCAATCCTCTCACAAAAGACA(SEQ ID NO.13)和NiV-F349-R：CTGCCATTATAACTCCGGC(SEQ ID NO.14)，另一对引物(记为F762-1009)为NiV-F762-F：
TGATCTTCTAGAAAGTGACAGCA(SEQ ID NO.15)和NiV-F1009-R：TCCTCTTTGTAATTAGGCAAAATCC(SEQ ID NO.16)。
将实施例2、3和对比例1、2的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图11所示。可见，本发明实施例2和实施例3的引物对扩增效率更高。
实施例4
与实施例2的区别在于待测样本分别替换为阳性对照(实施例1所得普通PCR阳性参考品)、阴性对照(无菌水)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪轮状病毒(RV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，其余均同实施例2。结果如图12所示。表明本发明实施例2设计的引物对具有高特异性。
实施例5
与实施例3的区别在于待测样本分别替换为阳性对照(实施例1所得普通PCR阳性参考品)、阴性对照(无菌水)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪轮状病毒(RV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，其余均同实施例3。结果如图13所示。表明本发明实施例3设计的引物对具有高特异性。
实施例6
核酸提取：将待测样品按市售病毒核酸提取试剂盒说明书提取核酸后(RNA提取试剂盒，纽基生化；M062)，直接用于检测。若样品提取后不立即检测，于-70℃保存备用，应避免反复冻融。
采用地高辛和FAM标记实施例2所述引物对，为NiV-P257-F-X：5’-dig-TGTCGAACACCCGTGACTG和NiV-P414-R-X：5’6-FAM-ATCACTCCACCCTCTCTCAGG，采用修饰后的引物对进行微流控PCR胶体金法对待测样本进行检测。微流控芯片、微流控PCR仪均购自北京源景泰科生物科技有限公司，胶体金试纸条交由北京源景泰科生物科技有限公司制作，所述胶体金检测试纸条的上样板处固定有抗FAM荧光基团抗体标记的纳米金粒子，质控线处有抗FAM荧光基团抗体的抗体，检测线设计为地高辛半抗原结合线。
将含有待测样本和修饰引物的如表1所示的反应体系添加到如图3所示的微流控芯片加样孔中，打开微流控PCR仪，将芯片放在微流控PCR仪中，贴上铝膜防止挥发，盖上盖，将反应程序设定为55℃ 5min；95℃ 150s，1个循环；95℃ 5s、60℃ 20s，35个循环。反应结束后，收集芯片中的液体，采用胶体金检测试纸条进行检测。若检测线(T)和质控线(C)均显色为阳性，仅质控线(C)显色为阴性，若质控线(C)未显色，则视为结果无效，需要重测。
实施例7
与实施例6的区别在于所用的修饰引物组为对实施例3的引物进行修饰后所得，具体为NiV-G490-F：5’6-FAM-AACCCACTCCCTTTTAGAGA和NiV-G779-R：5’-dig-TCACCTCTGTCTAGTACCTCTCC，反应程序设定为55℃ 5min；95℃ 150s，1个循环；95℃ 5s、56℃ 20s，35个循环。其余均同实施例6。
实施例8
与实施例6的区别在于将待测样本分别替换为阳性对照(实施例1制备所得的RNA)、猪流行性腹泻病病毒(PEDV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪轮状病毒(RV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪口蹄疫病毒(OZK93)和阴性对照(无菌水)，其余均同实施例6。结果如图14所示。微流控PCR反应结束后，将芯片中的反应液进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图15所示。表明本发明实施例6的修饰引物对具有高特异性，且胶体金检测结果具有高度准确性。
实施例9
与实施例7的区别在于将待测样本分别替换为阳性对照(实施例1制备所得的RNA)、猪流行性腹泻病病毒(PEDV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪轮状病毒(RV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪口蹄疫病毒(OZK93)和阴性对照(无菌水)，其余均同实施例7。结果如图16和图17所示。微流控PCR反应结束后，将芯片中的反应液进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图18和图19所示。表明本发明实施例7的修饰引物对具有高特异性，且胶体金检测结果具有高度准确性。
实施例10
实施例2所述引物对的灵敏度验证
对实施例1所述培养好的阳性菌种(普通PCR阳性参考品)进行质粒提取，测浓度，十倍梯度稀释，分别作为模板，进行实施例2所述PCR扩增，查看稀释到多少倍则条带消失(阴性对照为无菌水)，转换拷贝数的公式为：
(6.02×1023copies/mol)×(浓度g/μL)×10×10-9/(MW g/mol)＝copies/μL
结果如图20所示，实施例2所述引物对的检测下限为64.6copies/μL。
实施例11
实施例3所述引物对的灵敏度验证
对实施例1所述培养好的阳性菌种(普通PCR阳性参考品)进行质粒提取，测浓度，十倍梯度稀释，分别作为模板，进行实施例3所述PCR扩增，查看稀释到多少倍则条带消失(阴性对照为无菌水)，结果如图21所示，实施例3所述引物对的检测下限为29.65copies/μL。
实施例12
实施例6所述修饰引物对进行微流控PCR胶体金检测的灵敏度
以实施例1所得微流控PCR-胶体金阳性参考品为检测样本，测浓度，十倍梯度稀释，分别作为模板，进行实施例6所述方法检测，查看稀释到多少倍则胶体金试纸条检测线不显色(阴性对照为无菌水)，结果如图22所示。微流控PCR反应结束后，将芯片中的反应液进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图23所示。实施例6所述修饰引物对的检测下限为1048copies/μL。
实施例13
实施例7所述修饰引物对进行微流控PCR胶体金检测的灵敏度
以实施例1所得微流控PCR-胶体金阳性参考品为检测样本，测浓度，十倍梯度稀释，分别作为模板，进行实施例7所述方法检测，查看稀释到多少倍则胶体金试纸条检测线不显色(阴性对照为无菌水)。结果如图24所示，微流控PCR反应结束后，将芯片中的反应液进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图25所示。实施例7所述修饰引物对的检测下限为936copies/μL。
实施例14
将实施例1所得微流控PCR-胶体金阳性参考品NiV-G、NiV-P的RNA模板稀释10-5后，按1∶1混合作为检测样本，同时进行实施例6和实施例7的检测(阴性对照为无菌水)，将反应程序设定为55℃ 5min；95℃ 150s，1个循环；95℃ 5s、58℃ 20s，35个循环。结果如图26所示。表明本发明实施例6和实施例7这两对修饰引物都可以用来检测尼帕病毒，且特异性强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测尼帕病毒的引物组，其特征在于，所述引物组为组1引物和组2引物中的至少一组；组1引物中引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；组2引物中引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
2.一种检测尼帕病毒的修饰引物组，其特征在于，采用荧光基团和半抗原标记权利要求1所述引物组。
3.根据权利要求2所述的修饰引物组，其特征在于，所述荧光基团包括6-FAM，所述半抗原包括地高辛。
4.权利要求1所述引物组或权利要求2-3任意一项所述修饰引物组在制备尼帕病毒检测产品中的应用。
5.一种尼帕病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物组。
6.一种尼帕病毒微流控PCR-胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2或3所述的修饰引物组、微流控芯片和胶体金检测试纸条；所述胶体金检测试纸条的上样板处固定有抗荧光基团抗体，质控线处有抗荧光基团抗体的抗体，检测线设计为半抗原结合线。
7.一种非诊断目的的尼帕病毒微流控PCR-胶体金检测方法，其特征在于，包括如下步骤：将含有待测样本RNA和修饰引物组的反应体系添加到微流控芯片的加样孔中，利用微流控PCR仪反应，反应结束后，采用胶体金检测试纸条进行检测，检测线和质控线均显色为阳性，仅质控线显色为阴性，若质控线未显色，则视为结果无效，需要重测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当所述修饰引物组为组1引物的修饰引物组时，所述微流控PCR仪的反应程序为：55℃ 5min；95℃ 150s，1个循环；95℃ 5s、60℃20s，35个循环。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当所述修饰引物组为组2引物的修饰引物组时，所述微流控PCR仪的反应程序为：55℃ 5min；95℃ 150s，1个循环；95℃ 5s、55℃20s，35个循环。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述反应体系以20μL计，包括酶混合液1μL、Buffer混合液14μL和模板5μL。
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