CN117568220B - 一种戊糖片球菌及在制备食用菌用微生物菌剂中的应用 - Google Patents

一种戊糖片球菌及在制备食用菌用微生物菌剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种戊糖片球菌及在制备食用菌用微生物菌剂中的应用，所制备的微生物菌剂中的菌株在食用菌棒内定殖后，利用食用菌棒内的营养物质进行繁殖和代谢，增强食用菌棒的抑菌能力，提高食用菌棒中营养物质释放，增加食用菌棒中被食用菌菌丝体高效利用的营养素，提高食用菌商品等级。本发明能促进菌丝体的快速均匀的生长，菌丝体布满菌棒；微生物菌剂与平菇菌丝体共培养的菌棒中的平菇多、出菇时间早、整齐；多次采摘后的平菇菌棒依然能长出商品等级高的平菇。

Description

一种戊糖片球菌及在制备食用菌用微生物菌剂中的应用
技术领域
本发明属于食用菌用微生物菌剂技术领域，具体涉及一种戊糖片球菌及在制备食用菌用微生物菌剂中的应用。
背景技术
近年来，食用菌产业正在迅速发展，总产值仅次于蔬菜行业，年产量在逐年增加。栽培模式由最初的家庭式、小作坊式逐渐向合作社、自动化、工厂化过渡。食用菌的栽培原料大多数是工农业副产品及下脚料，如棉籽壳、玉米芯、大豆秸秆、麦麸、油糠、豆粕、酒糟等，其具有来源广、价格低廉、可就地取材等特点；用完的食用菌棒可垫在牛棚供牛啃食和改善粪尿带来的牛棚潮湿泥泞环境，牛棚内的食用菌棒粪肥发酵为优良的有机肥。因此，通过食用菌的栽培可促进工农业副产物的循环利用，促进循环经济的发展。
平菇子实体营养丰富，味道鲜美，含有糖类、蛋白质、维生素、矿质元素等多种营养成分，是居民餐桌上的重要蔬菜。平菇栽培经济增收方面具显著优势，但是，平菇在工厂化生产过程中面临着商品等级参差不齐的困境。经过研究发现，一般情况下，平菇培养料最适含水量为65％，发菌阶段空气湿度保持室内湿度，出菇阶段室内空间湿度不能低于85％，一般控制在85-95％之间；在原基形成阶段，在其他条件不变的情况下，湿度过低，会推迟或抑制原基的形成；出菇阶段，空间湿度过低，将会使子实体的含水量降低，从而影响产量和生物学效率。而菌棒培养料含水量对食用菌生长发育也有重要影响，如果培养料含水量过低，将会延长平菇菌袋转茬时间，进而延长整个栽培周期。随着采摘次数的增多，菌棒内培养料的养分下降，菌棒内的湿度下降，菌棒内感染链孢霉的风险上升，这将导致平菇商品等级的下降为二级或以下，这严重制约了平菇的经济效益。
为了解决这一问题，现有技术主要是通过补水的方式来提高菌棒内湿度，然而，种植的结果显示，这并不能将平菇的商品等级提高为特级或一级。
发明内容
本发明的目是提供一种戊糖片球菌及在制备食用菌用微生物菌剂中的应用，所提供的戊糖片球菌及使用该菌株制备的食用菌用微生物菌剂能够提高平菇商品等级。
本发明首先提供一种戊糖片球菌，所述的戊糖片球菌为戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)YN22，分类名为戊糖片球菌，已保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年05月17日，保藏编号为CGMCC NO.22545。
本发明所提供的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)YN22株可用于制备用于提高养殖食用菌品质的制品；
本发明再一个方面提供一种食用菌养殖用微生物菌剂，所述的菌剂中包含有所述的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)YN22菌株；
更进一步的，所述的微生物菌剂中还包含有苏云金杆菌；
作为实施例的一个具体记载，所述的苏云金杆菌为苏云金杆菌(Bacillusthuringensis)FF05-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年05月17日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.22542。
更进一步的，所述微生物菌剂中苏云金杆菌(Bacillus thuringensis)FF05-2的浓度为1×107cfu/ml，戊糖片球菌YN22的浓度为1×105cfu/ml；
本发明还提供所述的食用菌用微生物菌剂的一种用途，是在养殖平菇中的应用；
本发明还提供一种养殖平菇的方法，是将平菇菌丝体和微生物菌剂接种到培养基质中进行共同养殖。
本发明所筛选的YN22菌株分泌的肽、乳酸、乙酸和菌体对真菌和细菌有强的抑制效果，而且还能促进磷元素和钾元素从食用菌菌棒中释放，从而促进养殖平菇的菌丝体快速均匀的生长。而制备的微生物制剂中的FF05-2菌株分泌的杀虫晶体蛋白对食用菌菌棒在菌丝体生长期间面临的虫子有一定抑制效果，还能促进菌棒中淀粉和纤维素的分解。本发明的微生物菌剂与平菇菌丝体共培养的菌棒中的平菇产量更高、出菇时间早、且生长一致性高；多次采摘后的平菇菌棒依然能长出商品等级高的平菇。
附图说明
图1为本发明筛选的YN22菌株的光学显微镜照片(放大倍数75X 40)；
图2为本发明菌株FF05-2对菌丝体的促生长效果照片图；
图3为本发明菌剂FF05-2与YN22形成的组合二对平菇促生长的效果照片；
图4为本发明多次采摘菌棒上平菇生长被菌剂促进的效果照片图。
具体实施方式
本发明在筛选获得了一株戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)YN22的基础上，构建了一种食用菌用微生物菌剂，该菌株在食用菌棒内定殖后，利用食用菌棒内的营养物质进行繁殖和代谢，增强食用菌棒的抑菌能力，提高食用菌棒中营养物质释放，增加食用菌棒中被食用菌菌丝体高效利用的营养素，提高食用菌商品等级。
本发明构建的微生物菌剂的活性成分为苏云金杆菌FF05-2和戊糖片球菌YN22；其中戊糖片球菌YN22的分类名为Pediococcus pentosaceus，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年05月17日，保藏编号为CGMCC NO.22545。苏云金杆菌FF05-2已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年05月17日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.22542。
本发明所提供的微生物菌剂在繁殖和代谢过程中，产生大量的杀虫和抑菌的代谢物，通过这些代谢物抑制或杀灭食用菌棒内的病虫病菌，减少病原菌在菌棒内的传播，降低病原菌对食用菌菌丝体的伤害，解决或缓解食用菌菌丝体发育不良问题。
所述微生物菌剂，其一种制备步骤如下：
步骤1、采用Ashby固体培养基将苏云金杆菌FF05-2活化，并采用Ashby液体培养基进行培养，得到菌株FF05-2的一级培养菌；采用MRS固体培养基将戊糖片球菌YN22活化，并采用MRS液体培养基进行培养，得到菌株YN22的一级培养菌；
步骤2、将培养得到的苏云金杆菌FF05-2和戊糖片球菌YN22按cfu比1:0、1:1或0:1进行混合，按照10％的接种量把混合菌液放入发酵液体培养基进行发酵培养，在37℃条件下培养10～12h，得到发酵的微生物菌剂。
步骤1中，取出-20℃条件下保存的苏云金杆菌FF05-2，分别用接种环蘸取少许菌液于Ashby固体培养基上划线，于37℃条件下培养10～12h；用接种环挑取该固体培养基上的单菌落，接种于Ashby液体培养基的100mL三角瓶中，于37℃条件下培养8～10h得到活化的菌株；此时，每毫升Ashby液体培养基中至少含有1×108cfu苏云金杆菌FF05-2；所述步骤一中，取出-20℃条件下保存的戊糖片球菌YN22，分别用接种环蘸取少许菌液于MRS固体培养基上划线，于37℃条件下培养10～12h；用接种环挑取该固体培养基上的单菌落，接种于MRS液体培养基的100mL三角瓶中，于37℃条件下培养8～10h得到活化的菌株；此时，每毫升MRS液体培养基中至少含有1×108cfu戊糖片球菌YN22，YN22菌液在与菌液苏云金杆菌FF05-2混合前，菌液用灭菌水稀释到浓度为1×105cfu/mL，YN22菌液在使用到食用菌棒前，也用灭菌水稀释到浓度为1×105cfu/mL。
步骤2中，发酵液体培养基每升的组成及含量为：MgSO4·7H2O 0.2g/L；NaCl 0.2g/L；甘露醇10g/L；K2HPO40.2g/L；CaCO3 2.0g/L；蛭石2.0g/L；pH值6.4，121℃灭菌15分钟。
更进一步的，所述抑虫抑菌是指抑制蚜虫、粉虱、真菌、链孢霉菌、病毒和大肠杆菌；苏云金杆菌FF05-2溶解无机磷，释放磷元素，分泌生长素和分泌杀虫的杀虫晶体蛋白；戊糖片球菌YN22溶解无机磷、有机磷和溶解不溶性钾，分泌生长素，分泌抑菌抑病毒的乳酸菌肽、乙酸、乳酸，两株菌株间协同促进生长，高效的释放营养元素以促进食用菌菌丝体的生长。
进一步的，所述微生物菌剂通过共培养平菇菌丝体、益生菌的方式来应用在平菇生产中。
更进一步的，所述微生物菌剂在平菇生产中应用的步骤如下：
步骤1、选取菌丝体颜色一致的平菇品种为菌种，接种于马铃薯培养基中，培养平菇菌丝体，以生长浓密、菌丝发达、紧贴培养基的菌丝进行菌棒的接种菌；
步骤2、将步骤1中获得的平菇菌丝体和微生物菌一起共同接种到菌棒内，接种平菇菌丝体和微生物菌的菌棒置于菌丝体培养环境中，避光培养菌丝体；
步骤3、菌棒内长满菌丝体后，菌棒移入子实体环境中，包裹菌棒的塑料袋开口，通风，平菇子实体生长，获得特级或一级平菇；
步骤4、平菇采摘后，补充含有微生物菌的溶液，控制菌棒内的湿度，通风继续培养，获得特级或一级平菇。
更进一步的，所述步骤1中，马铃薯培养基包括马铃薯200g，葡萄糖10g，甘露醇10g，琼脂15g，水1000mL，马铃薯培养基用文火加热，加热时不断搅拌，至全部融化，用纱布过滤，取其汁液，趁热分装到210mm×20mm的试管中，灭菌备用；所述步骤二中，菌丝体培养环境温度为22℃±2℃，所述步骤三中，子实体环境温度为28℃±2℃，塑料袋开口5cm，步骤四中控制菌棒内的湿度为70％±2。
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下，所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法；所使用的试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，所述百分含量或浓度，如无特殊说明均为质量百分数。
实施例1、筛选戊糖片球菌及构建微生物菌剂
1、目的菌株的分离和纯化
1)筛选同型发酵乳酸菌株
收集青岛胜利桥附近淤泥的浸出液按体积比1:1000的比例加入到无菌水中混匀进行稀释,将100微升的稀释液涂布在MRS固体培养基中，37℃恒温培养箱培养48h；
挑取透明圈直径在4cm的单菌落，该单菌落在MRS固体培养基上连续划线以得到纯的单菌落；挑取透明圈直径在4cm的单菌落于没有添加碳酸钙的MRS液体培养基中,观察是否产气，产气菌株为异型发酵乳酸菌，不产气菌株为同型发酵乳酸菌；共分离出10个纯化的同型发酵乳酸菌株；这些菌株接入MRS液体培养基中,37℃恒温培养20h,取其中的700微升菌液并加入300微升灭菌甘油,然后混匀,放入-80℃冰箱中冻存；
2)筛选具有抑菌活性的菌株
取出-80℃条件下保存的待筛选的同型发酵乳酸菌株,用接种环蘸取菌液并在MRS固体培养基上划线进行菌株活化，在温度37℃的条件下培养12～14h；用接种环挑取MRS固体培养基上的单菌落，接种于装有50mLMRS培养基的100ml三角瓶中,在温度37℃的条件下培养16～18h得到活化的乳酸菌；
按5％的接种量,将活化的乳酸菌接入不含碳酸钙MRS液体培养基的500ml三角瓶中，装液量300ml，37℃培养16～18h,此时,每毫升MRS液体培养基中至少含有0.1×109cfu乳酸菌，获得含代谢产物和乳酸菌的抑菌物；
将抑菌物用自来水按1：100(抑菌物：自来水)的体积比进行稀释，取5mL稀释的抑菌物喷洒于患有软腐病面积为25cm2的甘薯上；将抑菌物用自来水按1：100(抑菌物：自来水)的体积比进行稀释，取1mL稀释的抑菌物喷洒于长满大肠杆菌菌落的培养皿平板上。
最终筛选得到一株能完全抑制甘薯软腐病真菌和大肠杆菌生长的菌株YN22，该菌株在添加有碳酸钙的MRS固体培养基中形成直径6cm的透明圈。
2、菌株的鉴定
将上述步骤筛选得到的乳酸菌YN22分别进行生物学特性和16SrDNA序列鉴定。
菌株的生物学特性:乳酸菌YN22为革兰氏阳性菌、菌落乳白色、菌落表面光滑、细胞呈杆状、生长温度10℃～45℃、最适温度32℃～38℃、接触酶阴性、过氧化氢酶阴性、最适碳源葡萄糖、最适无机磷盐K2HPO4；菌株SN3为革兰氏阳性菌、菌落乳白色、菌落表面光滑、细胞呈短杆状、生长温度10℃～45℃、最适温度32℃～38℃、接触酶阴性、过氧化氢酶阴性、最适碳源葡萄糖、最适无机磷盐Na2HPO4。
16S rDNA的序列：乳酸菌YN22的16S rDNA的核苷酸序列与戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus strain 1931，序列号MT597748.1)的同源性最高，其同源性为99.58％。
基于以上特征，将筛选得到的菌株YN22鉴定为戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus strain 1931)，该菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年05月17日，保藏编号为CGMCC NO.22545。
3、菌株的共同培养试验.
YN22乳酸菌的活化：取出-80℃条件下保存的乳酸菌，用接种环蘸取菌液并在MRS固体培养基上划线进行菌株活化，在温度37℃的条件下培养12～14h；用接种环挑取MRS固体培养基上的单菌落，接种于装有50mLMRS培养基的100ml三角瓶中，在温度37℃的条件下培养16～18h得到活化的乳酸菌；此时,每ml的MRS液体培养基中至少含有0.5×109cfuYN22乳酸菌。
苏云金杆菌FF05-2的活化：取出-80℃条件下保存的苏云金杆菌FF05-2，用接种环蘸取菌液并在Ashby固体培养基上划线进行菌株活化，在温度37℃的条件下培养12～14h；用接种环挑取Ashby固体培养基上的单菌落，接种于装有50mLLB培养基的100ml三角瓶中,在温度37℃的条件下培养16～18h得到活化的苏云金杆菌FF05-2；此时,每mL Ashby液体培养基中至少含有0.8×109cfu苏云金杆菌FF05-2。
菌株的共同培养:将上述培养的YN22乳菌液和苏云金杆菌FF05-2按cfu比为1:1的比例进行混合得到进行菌株共同培养的种子液,按5％的接种量,将混合后的上述种子液接种于不含碳酸钙的MRS液体培养基，37℃静止培养,间隔1天测菌液浓度和培养基pH值。结果表明YN22乳酸菌和苏云金杆菌FF05-2的组合表现出增殖和存活优势，第24h时，每mL菌液浓度至少为0.5×1010cfu。pH值为4；第96h时,每mL菌液浓度至少为0.2×1010cfu，pH值为4.5。这说明共同培养时，两株菌株间有相互促进作用；pH值的升高有利于菌株存活能力的提高。
将戊糖片球菌YN22和苏云金芽孢杆菌FF05-2分别用MRS和Ashby液体培养基培养混合制成微生物菌剂，每1毫升微生物菌剂中含有1×108cfu苏云金芽孢杆菌FF05-2和1×105cfu戊糖片球菌YN22。
借助菌株间的协助作用，加快微生物菌剂在菌棒中的初始繁殖速度，菌株在食用菌棒内定殖后，将利用食用菌棒内的营养物质进行繁殖和代谢，菌株在这个过程中将产生大量的杀虫和抑菌的代谢物，这些代谢物将抑制或杀灭菌棒内的病虫病菌，从而减少害虫对病原菌的传播，降低病原菌对平菇菌丝体的伤害，解决或缓解平菇菌丝体发育不好的问题。
在苏云金芽孢杆菌FF05-2和戊糖片球菌YN22对不良微生物的抑制作用下，平菇菌丝体茁壮成长；苏云金芽孢杆菌FF05-2和戊糖片球菌YN22在菌棒中生长繁殖的代谢产物如有机氮、生长素等促进了平菇菌丝体对可吸收养分的获得；菌棒中将富集大量的苏云金芽孢杆菌FF05-2和戊糖片球菌YN22，以抵抗菌棒和空气环境里不良微生物侵染，有利于平菇菌丝体在菌棒中的健康生长，这铺垫了平菇的高等级商品性。从而有效抑制菌棒中的链孢霉菌及其他不良微生物的活动，增加菌棒中可被平菇菌丝体高效利用的营养素，提高平菇商品等级。
实施例2
作为实施例1的微生物菌剂的具体应用，操作步骤如下：
(1)果树枝条和秸秆等废弃物的收集：收集农业生产过程中形成的废弃物果树枝条、松枝、秸秆等废弃物，粉碎，装入可高温灭菌的塑料袋中以制成菌棒，菌棒在100℃下灭菌1h；
(2)平菇培养：用接种环蘸取平菇菌种，在马铃薯培养基的斜面试管上划线，试管在28℃的恒温培养箱中倒置培养5后，可看到斜面上均匀的长满菌丝体；
(3)苏云金芽孢杆菌FF05-2和戊糖片球菌YN22培养：苏云金芽孢杆菌FF05-2和戊糖片球菌YN22分别接种到Ashby(阿须贝)固体培养基和MRS固体培养基的培养皿上，培养皿上在37℃的恒温培养箱中倒置培养10-12h，可看到培养皿上长出单菌落；
(4)苏云金芽孢杆菌FF05-2和戊糖片球菌YN22的发酵：分别用接种环挑取培养皿上的单菌落，分别接种于Ashby(阿须贝)和MRS液体培养基的100mL三角瓶中，于37℃条件下培养8～10h得到活化的菌株；此时，每毫升液体培养基中至少分别含有1×108cfu苏云金芽孢杆菌FF05-2和戊糖片球菌YN22。戊糖片球菌YN22菌液在与苏云金芽孢杆菌FF05-2混合前，或者戊糖片球菌YN22菌液在单独使用前，每毫升液体培养基中的苏云金芽孢杆菌FF05-2菌液浓度用灭菌水稀释到1×108cfu，每毫升液体培养基中的戊糖片球菌YN22菌液浓度用灭菌水稀释到1×105cfu。苏云金杆菌FF05-2和戊糖片球菌YN22的液体培养物按每毫升中活菌数的cfu比1:0、1:1和0:1的三种方式组成不同的复合菌剂进行发酵，复合菌剂的发酵液体培养基每升的组成及含量为：MgSO4·7H2O0.2g/L；NaCl 0.2g/L；甘露醇10g/L；K2HPO40.2g/L；CaCO3 2.0g/L；蛭石2.0g/L；pH值6.4，121℃灭菌15分钟；
(5)平菇菌丝体、苏云金芽孢杆菌FF05-2和戊糖片球菌YN22的复合菌剂在菌棒内的共培养：在无菌室的接种箱内打开菌棒的口，依次接入平菇菌丝体(对照CK)、苏云金芽孢杆菌FF05-2和戊糖片球菌YN22的复合菌剂(YN22+FF05-2菌剂)，平菇菌丝体接种量为菌棒体积10％的添加量，苏云金芽孢杆菌FF05-2和戊糖片球菌YN22复合菌剂的接种量为菌棒体积2％的添加量，菌棒盖上盖子置于通风良好的房间内进行菌丝体培养；
(6)获得特级或一级的商品平菇:菌棒内长满菌丝体后，移入子实体环境中，包裹菌棒的塑料袋开一个5cm左右的口，通风，平菇子实体生长，获得特级或一级的商品平菇。
(7)复合微生物菌液补充到菌棒内：平菇采摘后，补充复合微生物菌液到菌棒内，控制菌棒内的湿度为70％左右，通风，继续培养，获得特级或一级的商品平菇。
表1:不同菌剂对工厂化夏天栽培平菇产量的影响
表2：不同菌剂对工厂化夏天栽培平菇(第二次出菇)品相的影响表
实施例3
作为实施例1的微生物菌剂的具体应用，操作步骤如下：
步骤一、菌丝体的生长：平菇菌种和复合菌剂在菌棒内共生长25天左右，与没有复合菌剂的菌棒(CK)相比，复合菌剂和平菇菌种共同接种的菌棒内菌丝体长满整个菌棒，密度增大，颜色变白，无杂色。这说明复合菌剂促进了菌丝体的生长，抑制了杂菌的生长。
步骤二、子实体的分化：菌棒中平菇开始出现菇柄和菇盖，菇柄和菇盖在平菇中长相较均匀，没有特别大和特别小的柄或菇盖。
步骤三、商品菇的形成：菇柄和菇盖继续生长，无杂色，长相较均匀，复合特级或一级商品菇的特征。采摘后的菌棒内加入复合菌剂，控制菌棒内湿度为70％左右，通风，继续培养，获得特级或一级的商品平菇。
从上述结果可看出，用本发明提供的微生物菌剂与平菇菌株共生，平菇在菌丝体、子实体、菇柄和菇盖的生长中均表现出优势，商品平菇的各项指标均达到了特级或一级的效果。与没有菌剂处理的平菇相对比，平菇无杂色，这将为它进入市场提供保障。

Claims (5)

1.保藏编号为CGMCC NO.22545的戊糖片球菌在制备用于食用菌养殖用的微生物菌剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的食用菌为平菇。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的微生物菌剂中包含有保藏编号为CGMCC NO.22545的戊糖片球菌和保藏编号为CGMCC NO.22542苏云金杆菌。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的微生物菌剂中苏云金杆菌的浓度为1×107 cfu/ml，戊糖片球菌的浓度为1×105 cfu/ml。
5.一种养殖平菇的方法，其特征在于，所述的方法是将平菇菌丝体和包含有保藏编号为CGMCC NO.22545的戊糖片球菌和保藏编号为CGMCC NO.22542的苏云金杆菌的食用菌养殖用微生物菌剂接种到培养基质中进行共同养殖。
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