CN117562887A - 一种4-辛基衣康酸在制备治疗猪肠道冠状病毒感染药物和/或饲料添加剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种4‑辛基衣康酸在制备治疗猪肠道冠状病毒感染药物和/或饲料添加剂中的应用。本发明首次发现4‑辛基衣康酸对猪肠道冠状病毒在复制阶段具显著的抑制作用，当浓度在0.25mM～0.4mM之间没有表现出细胞毒性，且抗病毒效果与浓度成正比。
Description
技术领域
本发明涉及一种4-辛基衣康酸在制备治疗猪肠道冠状病毒感染药物和/或饲料添加剂中的应用，属于医药技术领域。
背景技术
在如今规模化、集约化的养殖条件下，猪的腹泻病一直困扰着养猪业，其中猪病毒性腹泻病严重威胁养猪业的发展，并造成巨大的经济损失。猪肠道冠状病毒中的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，猪流行性腹泻病毒(PEDV)，猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)是造成猪肠道冠状病毒性腹泻的主要病原，它们都是有囊膜的单股正链RNA病毒，均属于套氏病毒目，冠状病毒科。猪肠道冠状病毒可感染不同日龄的猪，且主要感染猪的小肠组织，并通过消化道(粪便-口腔途径)传播。临床表现为严重的呕吐、水样腹泻、脱水等症状，且新生仔猪发病最严重，死亡率高。目前，尚无快速、高效、安全的预防或治疗猪肠道冠状病毒性腹泻病的药物和/或饲料添加剂。
4-辛基衣康酸是一种可以渗透细胞的衣康酸酯衍生物，具有缓解原发性硬化性胆管炎，减轻脓毒血症产生的损伤等作用。目前还没有4-辛基衣康酸抗猪肠道冠状病毒的研究报道。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供了一种4-辛基衣康酸新的应用，用于制备治疗猪肠道冠状病毒感染药物和/或饲料添加剂。
技术方案：本发明的一种4-辛基衣康酸在制备治疗猪肠道冠状病毒感染药物和/或饲料添加剂中的应用。
具体的，4-辛基衣康酸分子式为C13H22O4，结构式为：
其中的，4-辛基衣康酸的抗病毒作用阶段为病毒的复制阶段。
其中的，所述猪肠道冠状病毒为包括但不限于猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪流行性腹泻病毒PEDV、猪德尔塔冠状病毒PDCoV中的一种或多种。
其中的，所述4-辛基衣康酸的终浓度为0.25～0.4mM。
其中的，所述药物还包括其他药学上可接受的辅料。
本发明一种治疗猪肠道冠状病毒性腹泻的药物组合物，所述药物组合物中的活性成分为4-辛基衣康酸。
本发明一种治疗猪肠道冠状病毒性腹泻的饲料添加剂，所述添加剂中的活性成分为4-辛基衣康酸。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明首次发现4-辛基衣康酸对猪肠道冠状病毒在复制阶段具显著的抑制作用，当浓度在0.25mM～0.4mM之间没有表现出细胞毒性，且抗病毒效果与浓度成正比，可应用于制备治疗猪肠道冠状病毒感染药物和/或饲料添加剂。
附图说明
图1为不同浓度的4-辛基衣康酸对IPEC-J2细胞的毒性：450nm细胞吸光值检测0.1mM～10mM的4-辛基衣康酸处理IPEC-J2细胞后的CCK8细胞活性。
图2为不同浓度的4-辛基衣康酸对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染IPEC-J2细胞的黏附阶段、内化阶段和复制阶段影响：荧光定量PCR(RT-qPCR)检测IPEC-J2细胞中TGEV-N基因的表达量。
图3为不同浓度的4-辛基衣康酸对TGEV的抑制作用：Western Blot测定不同浓度4-辛基衣康酸对IPEC-J2细胞中TGEV-N蛋白的表达量影响。
图4为不同浓度的4-辛基衣康酸对IPEC-J2细胞中TGEV-N蛋白的影响：间接免疫荧光检测IPEC-J2细胞中TGEV-N蛋白荧光。
图5为ST细胞培养TGEV病毒噬斑形成试验：病毒噬斑形成试验检测不同浓度的4-辛基衣康酸对IPEC-J2细胞释放的子代TGEV数量。
图6为不同浓度的4-辛基衣康酸在IPEC-J2细胞上对猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的抑制作用：Western Blot测定不同浓度4-辛基衣康酸对IPEC-J2细胞中PEDV-N(A)和PDCoV-N(B)蛋白的表达量。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例中具体涉及的材料和试剂如下：
材料：IPEC-J2、ST和Vero-E6细胞(本实验室保存)；猪传染性胃肠炎病毒(TGEVSHXB毒株)；猪流行性腹泻病毒(PEDV CV777毒株)；猪德尔塔冠状病毒(PDCoV CHN-GD16-05毒株)；聚偏二氟乙烯膜(PVDF，美国Merck Millipore公司)。
试剂：4-辛基衣康酸(MedChemExpress公司)；DMEM培养基(上海源培生物科技股份有限公司)；胎牛血清(南京生航生物技术有限公司)；CCK8试剂盒(南京诺唯赞公司)；青链霉素混合液(北京索莱宝科技有限公司)；0.25％胰酶(美国Gibco公司)；TRIzol(宝日医生物技术(北京)有限公司)；三氯甲烷(深圳三品科技公司)；DPEC水(北京索莱宝科技有限公司)；HiScript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)反转录试剂盒(南京诺唯赞生物有限公司)；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix荧光定量试剂盒(南京诺唯赞生物有限公司)；细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)；蛋白酶抑制剂(上海碧云天生物技术有限公司)；5×非变性蛋白上样缓冲液(上海雅酶生物医药科技有限公司)；10％蛋白预制胶(上海雅酶生物医药科技有限公司；TGEV-N、PEDV-N和PDCoV-N蛋白单克隆抗体(美国Medgene Labs公司)；抗GAPDH抗体(南京巴傲得生物科技有限公司)；辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠或羊抗兔二抗(南京巴傲得生物科技有限公司)；超敏ECL化学发光试剂盒(苏州新赛美生物科技有限公司)；CoraLite594-conjugated Goat Anti-Mouse IgG(H+L)二抗(武汉三鹰生物技术有限公司)；DAPI(北京索莱宝科技有限公司)；TritonX-100(北京索莱宝科技有限公司)；低熔点琼脂糖(北京索莱宝科技有限公司)；DMEM粉末(赛默飞世尔科技公司)。
实施例1.4-辛基衣康酸对IPEC-J2细胞活力的影响
首先，本实施例探究了4-辛基衣康酸对猪空肠上皮细胞IPEC-J2细胞活力的影响。将IPEC-J2细胞以1×104个/mL密度铺设于96孔板，每孔加入100μL含10％(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的细胞生长培养基，并置于37℃、5％CO2培养箱中培养至至80％左右细胞融合度时，加入不同浓度梯度的4-辛基衣康酸(终浓度分别为0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM、10mM)，并将等体积溶剂的DMSO作为对照组；处理后的细胞置于37℃，5％CO2培养箱培养24小时后，更换为含有10％细胞活性检测试剂CCK8的新鲜无血清培养基，置于37℃、5％ CO2培养箱2小时；用酶标仪检测OD450的吸光度值；以DMSO处理的细胞活力为100％，计算不同浓度4-辛基衣康酸处理下的细胞活力。
结果如图1所示，4-辛基衣康酸具有较高的安全性，低浓度的4-辛基衣康酸可以促进细胞增殖，且0.1mM～0.5mM没有表现出细胞毒性。
实施例2.4-辛基衣康酸发挥抗TGEV病毒作用的阶段
将IPEC-J2细胞按2.5×105个/mL密度接种于12孔板，每孔加入1mL含10％(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的细胞生长DMEM培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中待细胞长至70％融合度；弃去培养基，并用PBS洗三遍，洗掉残余的血清。加入500μL的空培养基，备用。
为确定4-辛基衣康酸影响TGEV感染的阶段，分别按下述步骤在TGEV感染过程中的黏附阶段、内化阶段、以及复制阶段加入4-辛基衣康酸。
黏附组：将等体积的DMSO(对照组)、4-辛基衣康酸(终浓度为0.25mM和0.4mM)分别加入IPEC-J2细胞，并接种TGEV(MOI＝1)进行病毒感染，置于4℃冰箱使病毒黏附而不进入细胞，1小时后，PBS洗三遍洗去未黏附的病毒，加入1ml不含血清的DMEM细胞培养维持液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时。
内化组：将IPEC-J2细胞接种TGEV(MOI＝1)，并分别将等体积的DMSO(对照组)、4-辛基衣康酸(终浓度为0.25mM和0.4mM)加入细胞，置于37℃培养箱，1小时后PBS洗三遍洗去4-辛基衣康酸和未感染的病毒，加入1ml不含血清的DMEM维持液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时。
复制组：将IPEC-J2细胞接种TGEV(MOI＝1)，置于37℃、5％CO2培养箱2小时后，PBS洗三遍洗去未感染的病毒，加入1ml不含血清的DMEM细胞培养基，并分别将等体积的DMSO(对照组)、4-辛基衣康酸(终浓度为0.25mM和0.4mM)加入细胞，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时。
提取不同处理细胞的总RNA：将1mL TriZol加入到细胞孔中，上下吹打，使细胞裂解，并收集到1.5mL的EP管中，每管加入200μL氯仿，充分混合后在冰上静置10分钟；在4℃13000rpm离心20分钟，离心后，将上层的水相转移到新的1.5mL EP管中，并加入等量预冷的异丙醇。将混合物放置在-20℃冰箱沉淀30分钟，13000rpm离心20分钟；弃去上清，用1mL75％酒精洗涤RNA沉淀；13000rpm离心15分钟，再次用75％的酒精洗涤RNA沉淀，13000rpm离心15分钟；弃掉上清，风干RNA沉淀5分钟，将提取的RNA溶解在20μL DEPC水中，根据RNA浓度值调整统一后使用HiScript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)反转录试剂盒生成互补DNA(cDNA)作为RT-PCR模板：20μL的反转体系包含1000ng RNA，4μL反转酶5×qRTSuperMix，用DEPC水补足20μL。反转程序为37℃，30分钟。GAPDH作为内参利用实时荧光PCR检测TGEV-N基因的表达量。其中，引物信息如下：
表1荧光定量PCR引物序列
| 引物名称 | 序列(5’-3’) |
| TGEV-N上游引物 | CAATTCCCGTGGTCGGAAGA |
| TGEV-N下游引物 | TTTACGTTGGCCCTTCACC |
| GAPDH上游引物 | CACAGTCAAGGCGGAGAAC |
| GAPDH下游引物 | CGTAGCACCAGCATCACC |
20μLPCR反应体系包含10μL AceQ Green Master Mix，0.2μL上、下游引物(10μM)，2μL模板DNA，以及7.6μL灭菌蒸馏水。扩增参数为：95℃10s、60℃30s共40个循环，反应结束后溶解曲线测定，反应条件为：95℃15s、60℃60s、95℃15s。本实验通过2-ΔΔCt法进行TGEV-N基因的相对定量；
结果如图2所示，与DMSO对照组相比，4-辛基衣康酸主要在TGEV感染的复制阶段发挥抗病毒作用。
实施例3.不同浓度4-辛基衣康酸对IPEC-J2细胞感染TGEV的N蛋白影响
将IPEC-J2细胞按6×105个/mL密度接种于6孔板，每孔加入2mL含10％(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的细胞生长DMEM培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中待细胞长至70％融合度；弃去原有培养基，用PBS洗三遍；接种TGEV病毒(MOI＝1)，置于37℃、5％CO2培养箱2小时后，弃去病毒液，并用PBS洗三遍，洗去未感染的病毒；在DMEM细胞培养液中加入DMSO或不同浓度的4-辛基衣康酸(终浓度分别为0.15mM，0.25mM，0.4mM)，将培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时后，用含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液收取细胞样品，分别以4℃，12000rpm离心15分钟，获取细胞裂解液上清蛋白，使用BCA法测定蛋白样品中的蛋白浓度，并根据浓度数值调整目的蛋白上样量，加入5×非变性蛋白上样缓冲液，沸水煮样10分钟后短暂离心；以相同含量GAPDH为标准调节蛋白上样量，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)；按恒压110V进行转膜1小时，将蛋白样品转移至0.22μm的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)；用含5％(v/v)脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭1小时；分别以鼠抗TGEV-N和鼠抗GAPDH作为一抗，4℃孵育过夜；TBST洗涤3次，每次10分钟，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠二抗室温孵育1小时；TBST洗涤3次，使用超敏ECL化学发光试剂盒分别对TGEV-N和GAPDH的蛋白水平进行Western blot显色。
结果如图3所示，不同浓度的4-辛基衣康酸均显著抑制TGEV-N蛋白表达，并且抑制效果呈浓度依赖性，其中0.4mM浓度的4-辛基衣康酸抑制效果最好。
实施例4不同浓度4-辛基衣康酸处理对TGEV感染的影响
将IPEC-J2细胞以2.5×105密度接种于含有爬片的12孔板，每孔加入1mL含10％(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的细胞生长DMEM培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中待细胞长至70％融合度；弃去原有培养基，用PBS洗三遍。接种TGEV(MOI＝1)病毒，置于37℃、5％CO2培养箱2小时后，弃去病毒液，并用PBS洗三遍，洗去未感染的病毒；在DMEM细胞培养维持液中加入不同浓度的4-辛基衣康酸(终浓度分别为0.15mM，0.25mM，0.4mM)，将培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时后，进行间接免疫荧光实验：4％多聚甲醛固定不同处理细胞30分钟，PBS洗三遍；加入0.5％ TritonX-100破膜处理15分钟，增加抗体对细胞膜的通透性；随后用PBS清洗三遍；加入3％ BCA封闭2小时，PBS洗两遍；加入鼠抗TGEV-N蛋白一抗(1:200)，4℃过夜孵育。PBS清洗三遍；加入CoraLite594-conjugated Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(1:200)二抗，室温孵育一小时。PBS清洗三遍；加入1μg/mL的DAPI染细胞核，PBS洗三遍，洗掉多余的DAPI。在荧光显微镜下观察。
结果如图4所示，不同浓度4-辛基衣康酸处理后细胞中红色TGEV-N蛋白的特异性荧光显著减少，抗病毒效果呈现出浓度依赖性，蓝色DAPI代表细胞核。
实施例5.不同浓度4-辛基衣康酸对IPEC-J2细胞培养TGEV病毒滴度影响
将未感染的ST细胞稀释至3×105个/mL铺设12孔细胞培养板，每孔加入1mL DMEM培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中待细胞长至汇聚成单层；收取实施例2的复制组处理后的IPEC-J2细胞上清培养液并进行102、103、104倍倍比稀释，接种已铺设12孔细胞培养板的ST细胞，每孔接种500μL，每个稀释度做3个重复，另以空白DMEM培养基代替感染细胞上清培养液作对照。置于37℃、5％CO2培养箱孵育1小时；弃掉培养板中的细胞上清培养液，并加入1mL 1.4％的琼脂糖低熔点胶。待琼脂糖凝固后，放置在37℃、5％CO2培养箱。每24小时观察一次细胞的生长状态，观察1～3天；待空斑形成后，在细胞培养板中加入1mL的4％的多聚甲醛，室温固定1小时；弃掉多聚甲醛和琼脂糖凝胶，加入1mL的0.5％的结晶紫室温染色2小时；洗掉结晶紫，晾干后，拍照计数。
结果如图5所示，不同浓度4-辛基衣康酸处理IPEC-J2细胞后，呈浓度依赖性显著降低了细胞上清培养液中TGEV子代病毒滴度(病毒噬斑数量少)，再次证实了4-辛基衣康酸具有显著的抗TGEV病毒效果。
实施例6.4-辛基衣康酸对其他猪肠道冠状病毒(PEDV和PDCoV)的抑制作用
将Vero-E6细胞和IPEC-J2细胞分别按6×105个/mL密度接种于6孔细胞培养板，每孔分别加入2mL含10％(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的细胞生长DMEM培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中待细胞长至70％～80％融合度；弃去原有培养基，用PBS洗三遍。分别接种PEDV(至Vero-E6细胞)或PDCoV(至IPEC-J2细胞)(MOI＝1)，置于37℃、5％CO2培养箱2小时后，弃去病毒液，并用PBS洗三遍，洗去未入侵的病毒；在细胞培养维持液中加入不同浓度的4-辛基衣康酸(终浓度分别为0.1mM，0.25mM，0.4mM)，将培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时后，用含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液收取细胞样品，进行Western Blot检测。
结果如图6所示，与DMSO对照组相比，不同浓度4-辛基衣康酸处理显著下调PEDV-N蛋白和PDCoV-N蛋白的表达量，说明4-辛基衣康酸对猪肠道冠状病毒PEDV和PDCoV也具有显著的抑制作用，其抑制效果呈浓度依赖性，且0.4mM浓度的抑制效果最好。
Claims (6)
1.一种4-辛基衣康酸在制备治疗猪肠道冠状病毒感染药物和/或饲料添加剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述猪肠道冠状病毒包括猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪流行性腹泻病毒PEDV、猪德尔塔冠状病毒PDCoV中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述4-辛基衣康酸的终浓度为0.25～0.4mM。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括其他药学上可接受的辅料。
5.一种治疗猪肠道冠状病毒性腹泻的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中的活性成分为4-辛基衣康酸。
6.一种治疗猪肠道冠状病毒性腹泻的饲料添加剂，其特征在于，所述添加剂中的活性成分为4-辛基衣康酸。
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