CN117562887A - 一种4-辛基衣康酸在制备治疗猪肠道冠状病毒感染药物和/或饲料添加剂中的应用 - Google Patents
一种4-辛基衣康酸在制备治疗猪肠道冠状病毒感染药物和/或饲料添加剂中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117562887A CN117562887A CN202311688331.4A CN202311688331A CN117562887A CN 117562887 A CN117562887 A CN 117562887A CN 202311688331 A CN202311688331 A CN 202311688331A CN 117562887 A CN117562887 A CN 117562887A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- itaconic acid
- porcine
- octyl
- cells
- octyl itaconic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- IBYJNMZQRFSYSQ-UHFFFAOYSA-N 2-(2-propylhexylidene)butanedioic acid Chemical compound CCCC(CCCC)C=C(C(=O)O)CC(=O)O IBYJNMZQRFSYSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 55
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title claims abstract description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 5
- 241000711484 Transmissible gastroenteritis virus Species 0.000 claims description 24
- 241001361508 Porcine deltacoronavirus Species 0.000 claims description 11
- 241001135549 Porcine epidemic diarrhea virus Species 0.000 claims description 11
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 claims description 8
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims description 6
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 claims description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 abstract description 7
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 abstract description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 abstract description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 54
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 15
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 5
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 5
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 3
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- GUIHDHIMFDSCJZ-UHFFFAOYSA-N 2-nonylidenebutanedioic acid Chemical compound CCCCCCCCC=C(C(O)=O)CC(O)=O GUIHDHIMFDSCJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 229960001701 chloroform Drugs 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- NKMJZJDVLMDPGO-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-(2-phenylethyl)chromen-4-one Chemical compound OC1=CC=C(O)C(C(C=2)=O)=C1OC=2CCC1=CC=CC=C1 NKMJZJDVLMDPGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001447918 Baoris Species 0.000 description 1
- 241000272074 Bungarus Species 0.000 description 1
- 206010008609 Cholangitis sclerosing Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 206010051511 Viral diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- -1 itaconic acid ester Chemical class 0.000 description 1
- 101150060022 med gene Proteins 0.000 description 1
- LVHBHZANLOWSRM-UHFFFAOYSA-N methylenebutanedioic acid Natural products OC(=O)CC(=C)C(O)=O LVHBHZANLOWSRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 201000000742 primary sclerosing cholangitis Diseases 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 208000010157 sclerosing cholangitis Diseases 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
- A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
- A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
- A61K31/225—Polycarboxylic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
- A23K50/30—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for swines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/12—Antidiarrhoeals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Birds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种4‑辛基衣康酸在制备治疗猪肠道冠状病毒感染药物和/或饲料添加剂中的应用。本发明首次发现4‑辛基衣康酸对猪肠道冠状病毒在复制阶段具显著的抑制作用,当浓度在0.25mM~0.4mM之间没有表现出细胞毒性,且抗病毒效果与浓度成正比。
Description
技术领域
本发明涉及一种4-辛基衣康酸在制备治疗猪肠道冠状病毒感染药物和/或饲料添加剂中的应用,属于医药技术领域。
背景技术
在如今规模化、集约化的养殖条件下,猪的腹泻病一直困扰着养猪业,其中猪病毒性腹泻病严重威胁养猪业的发展,并造成巨大的经济损失。猪肠道冠状病毒中的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),猪流行性腹泻病毒(PEDV),猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)是造成猪肠道冠状病毒性腹泻的主要病原,它们都是有囊膜的单股正链RNA病毒,均属于套氏病毒目,冠状病毒科。猪肠道冠状病毒可感染不同日龄的猪,且主要感染猪的小肠组织,并通过消化道(粪便-口腔途径)传播。临床表现为严重的呕吐、水样腹泻、脱水等症状,且新生仔猪发病最严重,死亡率高。目前,尚无快速、高效、安全的预防或治疗猪肠道冠状病毒性腹泻病的药物和/或饲料添加剂。
4-辛基衣康酸是一种可以渗透细胞的衣康酸酯衍生物,具有缓解原发性硬化性胆管炎,减轻脓毒血症产生的损伤等作用。目前还没有4-辛基衣康酸抗猪肠道冠状病毒的研究报道。
发明内容
发明目的:本发明的目的是提供了一种4-辛基衣康酸新的应用,用于制备治疗猪肠道冠状病毒感染药物和/或饲料添加剂。
技术方案:本发明的一种4-辛基衣康酸在制备治疗猪肠道冠状病毒感染药物和/或饲料添加剂中的应用。
具体的,4-辛基衣康酸分子式为C13H22O4,结构式为:
其中的,4-辛基衣康酸的抗病毒作用阶段为病毒的复制阶段。
其中的,所述猪肠道冠状病毒为包括但不限于猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪流行性腹泻病毒PEDV、猪德尔塔冠状病毒PDCoV中的一种或多种。
其中的,所述4-辛基衣康酸的终浓度为0.25~0.4mM。
其中的,所述药物还包括其他药学上可接受的辅料。
本发明一种治疗猪肠道冠状病毒性腹泻的药物组合物,所述药物组合物中的活性成分为4-辛基衣康酸。
本发明一种治疗猪肠道冠状病毒性腹泻的饲料添加剂,所述添加剂中的活性成分为4-辛基衣康酸。
有益效果:与现有技术相比,本发明具有如下突出的显著优点:本发明首次发现4-辛基衣康酸对猪肠道冠状病毒在复制阶段具显著的抑制作用,当浓度在0.25mM~0.4mM之间没有表现出细胞毒性,且抗病毒效果与浓度成正比,可应用于制备治疗猪肠道冠状病毒感染药物和/或饲料添加剂。
附图说明
图1为不同浓度的4-辛基衣康酸对IPEC-J2细胞的毒性:450nm细胞吸光值检测0.1mM~10mM的4-辛基衣康酸处理IPEC-J2细胞后的CCK8细胞活性。
图2为不同浓度的4-辛基衣康酸对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染IPEC-J2细胞的黏附阶段、内化阶段和复制阶段影响:荧光定量PCR(RT-qPCR)检测IPEC-J2细胞中TGEV-N基因的表达量。
图3为不同浓度的4-辛基衣康酸对TGEV的抑制作用:Western Blot测定不同浓度4-辛基衣康酸对IPEC-J2细胞中TGEV-N蛋白的表达量影响。
图4为不同浓度的4-辛基衣康酸对IPEC-J2细胞中TGEV-N蛋白的影响:间接免疫荧光检测IPEC-J2细胞中TGEV-N蛋白荧光。
图5为ST细胞培养TGEV病毒噬斑形成试验:病毒噬斑形成试验检测不同浓度的4-辛基衣康酸对IPEC-J2细胞释放的子代TGEV数量。
图6为不同浓度的4-辛基衣康酸在IPEC-J2细胞上对猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的抑制作用:Western Blot测定不同浓度4-辛基衣康酸对IPEC-J2细胞中PEDV-N(A)和PDCoV-N(B)蛋白的表达量。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例中具体涉及的材料和试剂如下:
材料:IPEC-J2、ST和Vero-E6细胞(本实验室保存);猪传染性胃肠炎病毒(TGEVSHXB毒株);猪流行性腹泻病毒(PEDV CV777毒株);猪德尔塔冠状病毒(PDCoV CHN-GD16-05毒株);聚偏二氟乙烯膜(PVDF,美国Merck Millipore公司)。
试剂:4-辛基衣康酸(MedChemExpress公司);DMEM培养基(上海源培生物科技股份有限公司);胎牛血清(南京生航生物技术有限公司);CCK8试剂盒(南京诺唯赞公司);青链霉素混合液(北京索莱宝科技有限公司);0.25%胰酶(美国Gibco公司);TRIzol(宝日医生物技术(北京)有限公司);三氯甲烷(深圳三品科技公司);DPEC水(北京索莱宝科技有限公司);HiScript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)反转录试剂盒(南京诺唯赞生物有限公司);AceQ qPCR SYBR Green Master Mix荧光定量试剂盒(南京诺唯赞生物有限公司);细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司);蛋白酶抑制剂(上海碧云天生物技术有限公司);5×非变性蛋白上样缓冲液(上海雅酶生物医药科技有限公司);10%蛋白预制胶(上海雅酶生物医药科技有限公司;TGEV-N、PEDV-N和PDCoV-N蛋白单克隆抗体(美国Medgene Labs公司);抗GAPDH抗体(南京巴傲得生物科技有限公司);辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠或羊抗兔二抗(南京巴傲得生物科技有限公司);超敏ECL化学发光试剂盒(苏州新赛美生物科技有限公司);CoraLite594-conjugated Goat Anti-Mouse IgG(H+L)二抗(武汉三鹰生物技术有限公司);DAPI(北京索莱宝科技有限公司);TritonX-100(北京索莱宝科技有限公司);低熔点琼脂糖(北京索莱宝科技有限公司);DMEM粉末(赛默飞世尔科技公司)。
实施例1.4-辛基衣康酸对IPEC-J2细胞活力的影响
首先,本实施例探究了4-辛基衣康酸对猪空肠上皮细胞IPEC-J2细胞活力的影响。将IPEC-J2细胞以1×104个/mL密度铺设于96孔板,每孔加入100μL含10%(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的细胞生长培养基,并置于37℃、5%CO2培养箱中培养至至80%左右细胞融合度时,加入不同浓度梯度的4-辛基衣康酸(终浓度分别为0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM、10mM),并将等体积溶剂的DMSO作为对照组;处理后的细胞置于37℃,5%CO2培养箱培养24小时后,更换为含有10%细胞活性检测试剂CCK8的新鲜无血清培养基,置于37℃、5% CO2培养箱2小时;用酶标仪检测OD450的吸光度值;以DMSO处理的细胞活力为100%,计算不同浓度4-辛基衣康酸处理下的细胞活力。
结果如图1所示,4-辛基衣康酸具有较高的安全性,低浓度的4-辛基衣康酸可以促进细胞增殖,且0.1mM~0.5mM没有表现出细胞毒性。
实施例2.4-辛基衣康酸发挥抗TGEV病毒作用的阶段
将IPEC-J2细胞按2.5×105个/mL密度接种于12孔板,每孔加入1mL含10%(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的细胞生长DMEM培养基,置于37℃、5%CO2培养箱中待细胞长至70%融合度;弃去培养基,并用PBS洗三遍,洗掉残余的血清。加入500μL的空培养基,备用。
为确定4-辛基衣康酸影响TGEV感染的阶段,分别按下述步骤在TGEV感染过程中的黏附阶段、内化阶段、以及复制阶段加入4-辛基衣康酸。
黏附组:将等体积的DMSO(对照组)、4-辛基衣康酸(终浓度为0.25mM和0.4mM)分别加入IPEC-J2细胞,并接种TGEV(MOI=1)进行病毒感染,置于4℃冰箱使病毒黏附而不进入细胞,1小时后,PBS洗三遍洗去未黏附的病毒,加入1ml不含血清的DMEM细胞培养维持液,置于37℃、5%CO2培养箱中培养24小时。
内化组:将IPEC-J2细胞接种TGEV(MOI=1),并分别将等体积的DMSO(对照组)、4-辛基衣康酸(终浓度为0.25mM和0.4mM)加入细胞,置于37℃培养箱,1小时后PBS洗三遍洗去4-辛基衣康酸和未感染的病毒,加入1ml不含血清的DMEM维持液,置于37℃、5%CO2培养箱中培养24小时。
复制组:将IPEC-J2细胞接种TGEV(MOI=1),置于37℃、5%CO2培养箱2小时后,PBS洗三遍洗去未感染的病毒,加入1ml不含血清的DMEM细胞培养基,并分别将等体积的DMSO(对照组)、4-辛基衣康酸(终浓度为0.25mM和0.4mM)加入细胞,置于37℃、5%CO2培养箱中培养24小时。
提取不同处理细胞的总RNA:将1mL TriZol加入到细胞孔中,上下吹打,使细胞裂解,并收集到1.5mL的EP管中,每管加入200μL氯仿,充分混合后在冰上静置10分钟;在4℃13000rpm离心20分钟,离心后,将上层的水相转移到新的1.5mL EP管中,并加入等量预冷的异丙醇。将混合物放置在-20℃冰箱沉淀30分钟,13000rpm离心20分钟;弃去上清,用1mL75%酒精洗涤RNA沉淀;13000rpm离心15分钟,再次用75%的酒精洗涤RNA沉淀,13000rpm离心15分钟;弃掉上清,风干RNA沉淀5分钟,将提取的RNA溶解在20μL DEPC水中,根据RNA浓度值调整统一后使用HiScript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)反转录试剂盒生成互补DNA(cDNA)作为RT-PCR模板:20μL的反转体系包含1000ng RNA,4μL反转酶5×qRTSuperMix,用DEPC水补足20μL。反转程序为37℃,30分钟。GAPDH作为内参利用实时荧光PCR检测TGEV-N基因的表达量。其中,引物信息如下:
表1荧光定量PCR引物序列
引物名称 | 序列(5’-3’) |
TGEV-N上游引物 | CAATTCCCGTGGTCGGAAGA |
TGEV-N下游引物 | TTTACGTTGGCCCTTCACC |
GAPDH上游引物 | CACAGTCAAGGCGGAGAAC |
GAPDH下游引物 | CGTAGCACCAGCATCACC |
20μLPCR反应体系包含10μL AceQ Green Master Mix,0.2μL上、下游引物(10μM),2μL模板DNA,以及7.6μL灭菌蒸馏水。扩增参数为:95℃10s、60℃30s共40个循环,反应结束后溶解曲线测定,反应条件为:95℃15s、60℃60s、95℃15s。本实验通过2-ΔΔCt法进行TGEV-N基因的相对定量;
结果如图2所示,与DMSO对照组相比,4-辛基衣康酸主要在TGEV感染的复制阶段发挥抗病毒作用。
实施例3.不同浓度4-辛基衣康酸对IPEC-J2细胞感染TGEV的N蛋白影响
将IPEC-J2细胞按6×105个/mL密度接种于6孔板,每孔加入2mL含10%(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的细胞生长DMEM培养基,置于37℃、5%CO2培养箱中待细胞长至70%融合度;弃去原有培养基,用PBS洗三遍;接种TGEV病毒(MOI=1),置于37℃、5%CO2培养箱2小时后,弃去病毒液,并用PBS洗三遍,洗去未感染的病毒;在DMEM细胞培养液中加入DMSO或不同浓度的4-辛基衣康酸(终浓度分别为0.15mM,0.25mM,0.4mM),将培养板置于37℃、5%CO2培养箱中培养24小时后,用含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液收取细胞样品,分别以4℃,12000rpm离心15分钟,获取细胞裂解液上清蛋白,使用BCA法测定蛋白样品中的蛋白浓度,并根据浓度数值调整目的蛋白上样量,加入5×非变性蛋白上样缓冲液,沸水煮样10分钟后短暂离心;以相同含量GAPDH为标准调节蛋白上样量,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE);按恒压110V进行转膜1小时,将蛋白样品转移至0.22μm的聚偏二氟乙烯膜(PVDF);用含5%(v/v)脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭1小时;分别以鼠抗TGEV-N和鼠抗GAPDH作为一抗,4℃孵育过夜;TBST洗涤3次,每次10分钟,再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠二抗室温孵育1小时;TBST洗涤3次,使用超敏ECL化学发光试剂盒分别对TGEV-N和GAPDH的蛋白水平进行Western blot显色。
结果如图3所示,不同浓度的4-辛基衣康酸均显著抑制TGEV-N蛋白表达,并且抑制效果呈浓度依赖性,其中0.4mM浓度的4-辛基衣康酸抑制效果最好。
实施例4不同浓度4-辛基衣康酸处理对TGEV感染的影响
将IPEC-J2细胞以2.5×105密度接种于含有爬片的12孔板,每孔加入1mL含10%(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的细胞生长DMEM培养基,置于37℃、5%CO2培养箱中待细胞长至70%融合度;弃去原有培养基,用PBS洗三遍。接种TGEV(MOI=1)病毒,置于37℃、5%CO2培养箱2小时后,弃去病毒液,并用PBS洗三遍,洗去未感染的病毒;在DMEM细胞培养维持液中加入不同浓度的4-辛基衣康酸(终浓度分别为0.15mM,0.25mM,0.4mM),将培养板置于37℃、5%CO2培养箱中培养24小时后,进行间接免疫荧光实验:4%多聚甲醛固定不同处理细胞30分钟,PBS洗三遍;加入0.5% TritonX-100破膜处理15分钟,增加抗体对细胞膜的通透性;随后用PBS清洗三遍;加入3% BCA封闭2小时,PBS洗两遍;加入鼠抗TGEV-N蛋白一抗(1:200),4℃过夜孵育。PBS清洗三遍;加入CoraLite594-conjugated Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(1:200)二抗,室温孵育一小时。PBS清洗三遍;加入1μg/mL的DAPI染细胞核,PBS洗三遍,洗掉多余的DAPI。在荧光显微镜下观察。
结果如图4所示,不同浓度4-辛基衣康酸处理后细胞中红色TGEV-N蛋白的特异性荧光显著减少,抗病毒效果呈现出浓度依赖性,蓝色DAPI代表细胞核。
实施例5.不同浓度4-辛基衣康酸对IPEC-J2细胞培养TGEV病毒滴度影响
将未感染的ST细胞稀释至3×105个/mL铺设12孔细胞培养板,每孔加入1mL DMEM培养基,置于37℃、5%CO2培养箱中待细胞长至汇聚成单层;收取实施例2的复制组处理后的IPEC-J2细胞上清培养液并进行102、103、104倍倍比稀释,接种已铺设12孔细胞培养板的ST细胞,每孔接种500μL,每个稀释度做3个重复,另以空白DMEM培养基代替感染细胞上清培养液作对照。置于37℃、5%CO2培养箱孵育1小时;弃掉培养板中的细胞上清培养液,并加入1mL 1.4%的琼脂糖低熔点胶。待琼脂糖凝固后,放置在37℃、5%CO2培养箱。每24小时观察一次细胞的生长状态,观察1~3天;待空斑形成后,在细胞培养板中加入1mL的4%的多聚甲醛,室温固定1小时;弃掉多聚甲醛和琼脂糖凝胶,加入1mL的0.5%的结晶紫室温染色2小时;洗掉结晶紫,晾干后,拍照计数。
结果如图5所示,不同浓度4-辛基衣康酸处理IPEC-J2细胞后,呈浓度依赖性显著降低了细胞上清培养液中TGEV子代病毒滴度(病毒噬斑数量少),再次证实了4-辛基衣康酸具有显著的抗TGEV病毒效果。
实施例6.4-辛基衣康酸对其他猪肠道冠状病毒(PEDV和PDCoV)的抑制作用
将Vero-E6细胞和IPEC-J2细胞分别按6×105个/mL密度接种于6孔细胞培养板,每孔分别加入2mL含10%(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的细胞生长DMEM培养基,置于37℃、5%CO2培养箱中待细胞长至70%~80%融合度;弃去原有培养基,用PBS洗三遍。分别接种PEDV(至Vero-E6细胞)或PDCoV(至IPEC-J2细胞)(MOI=1),置于37℃、5%CO2培养箱2小时后,弃去病毒液,并用PBS洗三遍,洗去未入侵的病毒;在细胞培养维持液中加入不同浓度的4-辛基衣康酸(终浓度分别为0.1mM,0.25mM,0.4mM),将培养板置于37℃、5%CO2培养箱中培养24小时后,用含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液收取细胞样品,进行Western Blot检测。
结果如图6所示,与DMSO对照组相比,不同浓度4-辛基衣康酸处理显著下调PEDV-N蛋白和PDCoV-N蛋白的表达量,说明4-辛基衣康酸对猪肠道冠状病毒PEDV和PDCoV也具有显著的抑制作用,其抑制效果呈浓度依赖性,且0.4mM浓度的抑制效果最好。
Claims (6)
1.一种4-辛基衣康酸在制备治疗猪肠道冠状病毒感染药物和/或饲料添加剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述猪肠道冠状病毒包括猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪流行性腹泻病毒PEDV、猪德尔塔冠状病毒PDCoV中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述4-辛基衣康酸的终浓度为0.25~0.4mM。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述药物还包括其他药学上可接受的辅料。
5.一种治疗猪肠道冠状病毒性腹泻的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物中的活性成分为4-辛基衣康酸。
6.一种治疗猪肠道冠状病毒性腹泻的饲料添加剂,其特征在于,所述添加剂中的活性成分为4-辛基衣康酸。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311688331.4A CN117562887A (zh) | 2023-12-11 | 2023-12-11 | 一种4-辛基衣康酸在制备治疗猪肠道冠状病毒感染药物和/或饲料添加剂中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311688331.4A CN117562887A (zh) | 2023-12-11 | 2023-12-11 | 一种4-辛基衣康酸在制备治疗猪肠道冠状病毒感染药物和/或饲料添加剂中的应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117562887A true CN117562887A (zh) | 2024-02-20 |
Family
ID=89884449
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311688331.4A Pending CN117562887A (zh) | 2023-12-11 | 2023-12-11 | 一种4-辛基衣康酸在制备治疗猪肠道冠状病毒感染药物和/或饲料添加剂中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117562887A (zh) |
-
2023
- 2023-12-11 CN CN202311688331.4A patent/CN117562887A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4368582B2 (ja) | 牛ウイルス性下痢ウイルス(bvdv)感染およびc型肝炎ウイルス(hcv)感染を処置するのに有用な化合物、方法、および組成物 | |
CN101928782B (zh) | 同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的引物和试剂盒 | |
CN115089600A (zh) | 麦冬皂苷d在制备抗轮状病毒药物中的应用 | |
CN116426469B (zh) | LAP2α在间充质干细胞成脂向分化中的应用 | |
Witz et al. | Is there a risk of cytomegalovirus transmission during in vitro fertilization with donated oocytes? | |
CN112516132B (zh) | 丹酚酸c或其药物可接受盐在制备抗病毒的药物中的应用 | |
CN117562887A (zh) | 一种4-辛基衣康酸在制备治疗猪肠道冠状病毒感染药物和/或饲料添加剂中的应用 | |
CN113133995B (zh) | 抑制剂cni-1493在猪繁殖与呼吸综合征中的应用 | |
CN110551694A (zh) | 塞尼卡谷病毒svv/ch/zz/2016 | |
CN116121202A (zh) | 一种柯萨奇病毒b组1型毒株及应用 | |
CN116919934B (zh) | 盐酸二甲双胍在制备抗猪肠道α冠状病毒的药物中的应用 | |
CN112516149B (zh) | 苯甲酸雌二醇或其药物可接受盐在制备抗冠状病毒的药物中的应用 | |
CN114796208B (zh) | 雷帕霉素在制备预防或治疗鲫造血器官坏死病药物中的应用 | |
CN115192556B (zh) | 异甘草素在制备抗猪流行性腹泻病毒的药物中的应用 | |
CN115778935B (zh) | 楝酰胺在制备预防和/或治疗蓝耳病的药物中的应用 | |
CN116036065B (zh) | 化合物egta在制备预防或治疗猪流行性腹泻药物中的应用 | |
CN109847063B (zh) | Rsk信号通路抑制剂在抑制沙眼衣原体感染中的应用 | |
CN113750083B (zh) | 二甲双胍在制备治疗手足口病的药物中的应用 | |
CN117618439A (zh) | EHop-016抑制猪流行性腹泻病毒体外感染的方法及应用 | |
CN113368112B (zh) | Usp1-uaf1抑制剂在制备药物中的应用,药物组合物 | |
CN111118154B (zh) | Linc01272在制备肿瘤检测试剂和/或治疗药物中的应用 | |
CN116236474A (zh) | 桑根酮c或含有桑根酮c的组合物在制备抗病毒药物中的应用 | |
CN117838847A (zh) | 乙型脑炎病毒减毒活疫苗株sa14-14-2及其ns2b蛋白在预防寨卡病毒感染中的应用 | |
CN118141814A (zh) | 铁螯合剂dfp在制备prrs防治药物中的应用 | |
CN117599032A (zh) | Ccg-1423抑制猪流行性腹泻病毒体外感染的方法及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |