CN117551699A - 一种重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2的构建方法 - Google Patents
一种重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2的构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种重组火鸡疱疹病毒rHVT‑HA‑VP2的构建方法。该方法是通过在H9亚型禽流感病毒HA蛋白表达框的两侧添加不同的间隔序列，以及在鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白表达框的下游添加另一间隔序列，然后分别插入到火鸡疱疹病毒的特定位置实现的。未添加间隔序列的重组毒在体外连续传代9代以上，即发生重组毒不稳定现象，而添加间隔序列之后的重组病毒在体外连续传代20代以上仍然稳定，HA蛋白和VP2蛋白均能够正常表达。本发明的重组病毒rHVT‑HA‑VP2制备的疫苗能够提供针对IBDV强毒和H9N2亚型禽流感病毒感染的保护，具有良好的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程疫苗领域，具体是涉及一种重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2的构建方法。
背景技术
鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）是由鸡传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起的，主要感染3～12周龄雏鸡的急性且高度接触性免疫抑制病。IBD主要通过损伤鸡法氏囊，造成法氏囊发炎、坏死以及萎缩。病鸡主要表现为生长缓慢、精神沉郁、贫血消瘦、采食量减少、饮水增多等症状。该病的发病率可达100%，死亡率高于5%，有时高达20%，并发或继发感染所致的死亡率更高，是危害养禽业健康发展的重要免疫抑制病。因该病的大范围流行，其被世界动物卫生组织（OIE）列为“影响社会经济的重要疾病”。
禽流感（Avian influenza，AI）是由正粘病毒科、甲型流感病毒属的禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的一种人兽共患病。根据甲型流感病毒的外膜血凝素（H）/和神经氨酸酶（N）蛋白抗原性的不同，可分为16个H亚型（H1~H16）和9个N亚型（N1~N9）。其中H9N2亚型禽流感病毒在世界范围内流行，呈现持续存在的特点。H9N2亚型的禽流感虽然致死率不高，但是可引起蛋鸡的产蛋率明显下降、家禽料肉比下降和死亡淘汰率提高，给养禽业带来的经济损失不亚于高致病性禽流感。
由于H9亚型禽流感的灭活疫苗受母源抗体的影响比较严重，目前难以有有效的同时对两种疫病进行预防。HVT疫苗为细胞结合苗，可以用于鸡的一日龄免疫，避开母源抗体的干扰。研究显示，将IBDV VP2或H9 AIV HA保护性抗原插入到HVT基因组中，构建重组病毒载体疫苗，是预防此类疫病的有效方法，但同时应用HVT-H9-HA活载体疫苗和HVT-IBDV-VP2活载体疫苗对鸡群进行联合免疫，会导致这两种单苗在鸡体内互相影响，使二者都达不到理想的保护效果。将H9 AIV HA和IBDV VP2同时插入到HVT基因组中又会出现只对其中一种病有良好的保护效果，对两种疫病免疫效果都不理想的结果。因此，市场上亟需一种能够同时提供具有良好保护效果，且稳定传代的H9 AIV HA和IBDV VP2的二价HVT载体疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2的构建方法。
一种重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2的构建方法，所述构建方法是在火鸡疱疹病毒基因组中插入H9亚型禽流感病毒HA基因的表达盒、鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的表达盒和间隔序列。
进一步的，所述构建方法包括以下步骤：
1）在H9亚型禽流感病毒HA基因表达盒的左右两侧，分别插入间隔序列1和间隔序列2；
2）在鸡传染性法氏囊病毒VP2基因表达盒的下游插入间隔序列3；
3）将步骤1）和2）的产物插入火鸡疱疹病毒，构建重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2。
进一步的，所述H9亚型禽流感病毒HA基因的表达盒左侧插入的间隔序列1如SEQID NO: 1所示；所述H9亚型禽流感病毒HA基因的表达盒右侧插入的间隔序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步的，所述鸡传染性法氏囊病毒VP2基因表达盒下游插入的间隔序列3如SEQID NO: 3所示。
进一步的，步骤1）所述的插入位点为火鸡疱疹病毒FC-126基因组上HVT053和HVT054之间。
进一步的，步骤1）所述的插入位点为火鸡疱疹病毒FC-126基因组95318-95319之间。
进一步的，步骤1）所述的插入位点为火鸡疱疹病毒FC-126基因组上HVT088基因内。
进一步的，步骤1）所述的插入位点为火鸡疱疹病毒FC-126基因组上140211-140662之间。
进一步的，所述H9亚型禽流感病毒HA基因的表达盒的启动子为CAG复合启动子，终止子为rabbit beta-actin转录终止子。
进一步的，所述鸡传染性法氏囊病毒VP2基因表达盒的启动子为hCMV启动子，终止子为SV40 polyA转录终止子。
所述重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2在制备禽流感病毒疫苗中的应用。
所述重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2在制备传染性法氏囊病的疫苗中的应用。
本研究试验方法可以通过采用HVT粘粒系统、同源重组方法、HVT细菌人工染色体等不同的技术实现，分别将H9禽流感病毒HA基因表达盒盒鸡传染性法氏囊病毒VP2基因表达盒插入到HVT基因组指定的位置。
本发明以火鸡疱疹病毒HVT FC-126疫苗株为载体，通过添加适当的间隔序列，将含有H9 HA 和IBDV VP2基因表达盒插入到火鸡疱疹病毒基因组中，获得重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2，本发明的重组病毒rHVT-HA-VP2制备的疫苗能够提供针对IBDV强毒和H9N2亚型禽流感病毒感染的保护，克服现有共表达疫苗不能一苗防两病的缺陷，具有良好的市场应用前景。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为共表达H9亚型禽流感病毒HA基因和鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的重组火鸡疱疹病毒构建示意图。
图2为HA基因的PCR鉴定结果，其中1：HVT FC-126；2：rHVT-HA-VP2；3：水；M:为marker。
图3为VP2基因的PCR鉴定结果，其中1：HVT FC-126；2：rHVT-HA-VP2；3：水；M:为marker。
图4为重组病毒感染CEF后72h形成的细胞病变，其中左：rHVT-HA-VP2；中：HVT FC-126；右边：CEF对照。
图5为IFA鉴定H9 HA蛋白及IBDV VP2蛋白的表达情况图，其中a：用H9禽流感特异性血清检测H9的表达情况；b：重组病毒在白光下的蚀斑；c：用鸡传染性法氏囊病毒特异性血清检测VP2的表达情况；d：重组病毒在白光下的蚀斑；e和f：健康细胞在荧光显微镜和白光下的观察结果。
图6为rHVT-HA-VP2不同代次外源基因鉴定结果，其中左图：不同代次重组毒HA基因鉴定结果（1-5分别为P4、P8、P12、P16和P20代毒；6：阴性对照）；右图：不同代次重组毒VP2基因鉴定结果（1：阴性对照；2-6分别为P4、P8、P12、P16和P20代毒）。
图7为重组病毒rHVT-HA-VP2的不同代次的间接免疫荧光鉴定结果，其中上图：不同代次HA基因表达检测结果；下图：不同代次VP2基因表达检测结果。
图8为连续传代20次后带有间隔序列的rHVT-HA-VP2和不带有间隔序列的rHVT-HA-VP2的荧光检测结果图，其中上图：抗HA抗体染色重组毒的检测结果；下图：抗VP2抗体染色重组毒的检测结果。
图9为鸡传染性法氏囊强毒攻毒后鸡死亡情况图。
图10为鸡传染性法氏囊病毒攻毒后剖检脾和法氏囊的眼观情况图，其中上图：法氏囊；下图：脾。
图11为法氏囊剖开后的目测变化图。
图12为rHVT-HA-VP2免疫组鸡法氏囊体指数统计情况图。
图13为rHVT-HA-VP2免疫组鸡脾指数统计情况图。
图14为日平均体重变化情况图。
图15为疫苗免疫后的HI抗体水平变化情况图，其中1,2,3为免疫后周数，5为攻毒后天数。
具体实施方式
以下具体说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
1 实验材料
1.1 毒株、菌株和质粒
HVT FC-126疫苗株、H9亚型禽流感病毒FJ株、鸡传染性法氏囊病毒变异株FJ株、均由天津瑞普生物技术有限公司提供；表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒HVT-H9和表达鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的重组火鸡疱疹病毒HVT-VP2由天津瑞普生物技术股份有限公司生物制品研究院构建、保存。
大肠杆菌DH5alpha感受态细胞购自诺唯赞生物科技股份有限公司；pBluescriptSK II质粒、含有CAG启动子的真核表达质粒pCAGGS、含有hCMV启动子的真核表达质粒pCI均为商品化的质粒、含有eGFP或mCherry基因的质粒均为商品化的质粒，由天津瑞普生物技术股份有限公司生物制品研究院购买、保存；9-11日龄SPF鸡胚购自北京勃林格公司；原代鸡胚成纤维细胞取自9-11日龄鸡胚组织制备而成。
实验方法
2.1 中间转移质粒的构建
2.1.1 同源臂引物设计
分别选择HVT FC-126HVT053/054之间95318-95319，以及HVT088基因140211nt-140662nt作为插入位点，参照GenBank中登录的HVT FC126株（GenBank accession no.AF291866）的全基因组序列，用Primer Premier 5.0引物设计软件设计两对引物，分别PCR扩增HVT053/HVT504区和HVT088基因各自左边区和右边区的同源臂，同源臂长度各3000bp。HVT053/HVT054左右同源臂分别为HVT FC126基因组的92317nt-95318nt和95319-98319。HVT088左右同源臂序列为HVT FC126基因组的137211nt-140211nt和140662nt-143662nt。
2.1.2 同源重组质粒pBlue-HVT053/VT054以及pBlue-HVT088的构建
用病毒DNA提取试剂盒提取HVT FC-126基因组DNA，然后用扩HVT053/HVT05、HVT088左边区和右边区的引物对，分别扩增各自左右两侧同源臂，然后应用诺唯赞infusion连接试剂盒，将左右区同源臂同时插入到pBluescript SK II载体中，构建的质粒分别命名为pBlue-HVT053/HVT054以及pBlue-HVT088。
2.1.3 带有筛选基因的pBlue-HVT053/HVT054-mCherry和pBlue-HVT088-eGFP的构建
以pIRES2-mCherry、pIRES2-eGFP为模板，设计一对引物扩增mCherry和eGFP基因表达框，通过酶切克隆的方式，分别将mCherry表达框和eGFP表达框，连入到pBlue-HVT053/HVT054和pBlue-HVT088中，通过酶切、PCR、测序验证，鉴定正确的质粒命名为pBlue-HVT053/HVT054-mCherry和pBlue-HVT088-eGFP。
2.1.4 表达H9 HA和IBDV VP2的重组表达质粒的构建
为了提高表达效率，我们根据实验室分离的H9亚型禽流感病毒的HA基因序列，进行密码子优化，获得H9亚型禽流感HA基因序列H9-optiHA。提取IBDV FJ株病毒基因组RNA，然后用扩增VP2的特异性引物对VP2进行扩增。为了得到带有筛选基因的重组质粒，首先通过融合PCR技术，我们将H9-optiHA基因和mCherry表达框融合，将IBDV VP2基因和eGFP表达框融合。其次，通过酶切、克隆，将H9-optiHA-mCherry基因表达框和IBDV VP2-eGFP基因表达框分别插入到pCAGGS载体和pCI载体的多克隆位点。
通过融合PCR技术和定点插入技术，分别在H9-optiHA表达盒的左右两侧引入间隔序列1（SEQ ID NO: 1）和间隔序列2（SEQ ID NO: 2），以及在IBDV VP2表达盒的下游引入间隔序列3（SEQ ID NO: 3）。构建的重组质粒分别命名为pCAGGS-H9 HA-mCherry和pCI-IBDVVP2-eGFP。
2.1.5 表达H9 HA和IBDV VP2的同源重组质粒的构建
通过无缝克隆技术，分别将H9 HA表达框和IBDV VP2表达框插入到同源重组质粒pBlue-HVT053/VT054和pBlue-HVT088中。构建的重组质粒分别命名为pBlue-HVT053/VT054-H9 HA-mCherry和pBlue-HVT088-IBDV VP2-eGFP。
2.2 含有mCherry基因和eGFP基因的重组病毒rHVT-HA-mCherry/VP2-eGFP的获得
将pBlue-HVT053/VT054-H9 HA-mCherry和pBlue-HVT088-IBDV VP2-eGFP重组菌按照1:100比例接种LB培养基，12hpi，大提质粒。制备原代鸡胚成纤维细胞，然后按照200万/孔密度铺六孔板。次日，先用HVT FC126亲本病毒感染鸡胚成纤维细胞，接种比例为1MOI。2hpi，更换培养基，用invitrogen lipo3000脂质体转染试剂将大提质粒pBlue-HVT053/VT054-H9 HA-mCherry转染HVT感染的鸡胚成纤维细胞。转染后12小时换液。5天后，将转染的细胞消化下来，按照不同细胞密度，接种到6孔板中，然后铺熔点琼脂。5天后，在荧光显微镜下观察，寻找有红色荧光表达的细胞。将含有红色荧光的细胞挑取出来，继续稀释接种鸡胚成纤维细胞，铺低熔点琼脂，筛红色荧光蚀斑，经过连续10轮筛选，最终得到纯净的含有红色荧光的重组病毒rHVT-HA-mCherry。
同样，先用rHVT-HA-mCherry重组病毒感染鸡胚成纤维细胞，接种比例为1MOI。2hpi，更换培养基，用invitrogen lipo3000脂质体转染试剂将大提质粒pBlue-HVT088-IBDV VP2-eGFP转染rHVT-HA-mCherry重组病毒感染的鸡胚成纤维细胞。转染后12小时换液。5天后，将转染的细胞消化下来，按照不同细胞密度，接种到6孔板中，然后铺熔点琼脂。5天后，在荧光显微镜下观察，寻找有同时含有红色和绿色荧光表达的细胞。将含有绿色和绿色荧光的细胞挑取出来，继续稀释接种鸡胚成纤维细胞，铺低熔点琼脂，筛绿色和红色荧光蚀斑，经过连续10轮筛选，最终得到纯净的含有红色和绿色荧光的重组病毒rHVT-HA-mCherry/VP2-eGFP。
2.3 剔除标记基因的重组病毒rHVT-HA-VP2的获得
将筛选得到的重组病毒rHVT-HA-mCherry/VP2-eGFP进行扩大培养。制备原代鸡胚成纤维细胞，然后按照200万/孔密度铺六孔板。次日，先用重组病毒rHVT-HA-mCherry/VP2-eGFP感染鸡胚成纤维细胞，接种比例为1MOI。2hpi，更换培养基，用invitrogen lipo3000脂质体转染试剂将大提质粒pBlue-armV/VI-ΔmCherry转染重组病毒rHVT-HA-mCherry/VP2-eGFP感染的鸡胚成纤维细胞。转染后12小时换液。5天后，将转染的细胞消化下来，按照不同细胞密度，接种到6孔板中，然后铺熔点琼脂。5天后，在荧光显微镜下观察，寻找没有绿色荧光而只有绿色荧光表达的蚀斑细胞。将不含有红色而色荧光的细胞挑取出来，继续稀释接种鸡胚成纤维细胞，铺低熔点琼脂，筛没有红色，而只含有绿色荧光蚀斑，经过连续5-7轮筛选，最终得到纯净的绿色荧光的重组病毒rHVT-HA/VP2-eGFP。
同理，将筛选得到的重组病毒rHVT-HA/VP2-eGFP进行扩大培养。制备原代鸡胚成纤维细胞，然后按照200万/孔密度铺六孔板。次日，先用重组病毒rHVT-HA/VP2-eGFP感染鸡胚成纤维细胞，接种比例为1MOI。2hpi，更换培养基，用invitrogen lipo3000脂质体转染试剂将大提质粒pBlue-armVII/VIII-ΔeGFP转染重组病毒rHVT-HA/VP2-eGFP感染的鸡胚成纤维细胞。转染后12小时换液。5天后，将转染的细胞消化下来，按照不同细胞密度，接种到6孔板中，然后铺熔点琼脂。5天后，在荧光显微镜下观察，寻找没有荧光表达的蚀斑细胞。将不含有色荧光的细胞挑取出来，继续稀释接种鸡胚成纤维细胞，铺低熔点琼脂，筛没有荧光蚀斑，经过连续5-7轮筛选，最终得到纯净的无荧光的重组病毒rHVT-HA-VP2。
2.4 重组病毒的鉴定
2.4.1 重组病毒的PCR鉴定结果
提取重组病毒DNA、亲本病毒DNA，然后用扩H9 HA基因和IBDV VP2基因特异性的引物进行PCR鉴定，试验结果表明，通过目的基因特异性引物进行鉴定，重组病毒扩增出约1700bp的HA基因（参见图2）和约1400bp的VP2基因（参见图3），但亲本病毒HVT FC-126中扩增不到相应的目的基因。以上结果说明，H9-HA/IBDV-VP2基因正确的插入到HVT基因组中。
2.4.2 重组病毒的细胞病变观察
将重组病毒rHVT-HA-VP2、HVT FC-126亲本病毒接种原代鸡胚成纤维细胞，然后观察重组病毒与亲本病毒在原代鸡胚成纤维细胞上的生长状态有无差异。试验结果表明，重组病毒和亲本病毒接种细胞后，细胞病变的状态、产生细胞病变的时间大致都差不多，肉眼观察无明显差异（参见图4）。
2.4.3 重组病毒的间接免疫荧光鉴定结果
将未重组的火鸡疱疹病毒和纯化的重组病毒rHVT-HA-VP2分别以0.5MOI感染CEF细胞，待感染后的CEF出现病变时，分别用H9亚型禽流感病毒阳性血清和鸡传染性法氏囊病毒阳性血清分别作为一抗，Alexa Fluor-488标记的羊抗鸡的荧光二抗做间接免疫荧光试验检测目的基因的表达。接种重组病毒rHVT-HA-VP2的CEF细胞病变区域发出较亮的绿色荧光，接种未重组病毒的CEF细胞没有检测出绿色荧光，说明目的基因HA和VP2在重组HVT病毒中很好的表达（参见图5）。
将纯化的重组病毒rHVT-HA-VP2进行体外连续20代传代，每隔几代，通过PCR方法分别检测HA基因和VP2基因的变化情况，试验结果表明，带有间隔序列的HA基因表达框盒VP2基因表达框的重组病毒在体外能够稳定传代，HA基因和VP2基因条带大小正常（参见图6）。
同样，将纯化的重组病毒rHVT-HA-VP2分别以0.5MOI感染CEF细胞，待感染后的CEF出现病变时，分别用H9亚型禽流感病毒阳性血清和鸡传染性法氏囊病毒阳性血清分别作为一抗，Alexa Fluor-488标记的羊抗鸡的荧光二抗做间接免疫荧光试验检测目的基因的表达。通过连续体外传代，不同代次的重组毒的HA基因和VP2基因均表达正常，没有丢失（参见图7）。
将含有间隔序列的重组病毒rHVT-HA-VP2和不含有间隔序列的重组病毒rHVT-HA-VP2同时体外传代。然后分别用H9亚型禽流感病毒阳性血清和鸡传染性法氏囊病毒阳性血清分别作为一抗，Alexa Fluor-488标记的羊抗鸡的荧光二抗做间接免疫荧光试验检测目的基因的表达。试验结果表明，带有间隔序列的重组病毒的在体外连续传代20代以上HA基因的VP2基因表达均正常，而不带有间隔序列的重组病毒在体外连续传代9代就发生外源基因表达的丢失现象（参见图8）。
以上结果说明，带有间隔序列的重组病毒rHVT-HA-VP2体外传代更稳定。
1. 重组病毒rHVT-HA-VP2疫苗与IBDV疫苗的免疫保护效果评价
将40只1日龄SPF鸡随机分成四组，分别为rHVT-HA-VP2组、HVT-VP2疫苗组、HVTFC-126组和空白对照组；其中rHVT-HA-VP2组、HVT-VP2组、HVT FC-126组在1日龄时通过颈部皮下接种4000PFU/羽份的重组疫苗rHVT-HA-VP2、HVT-VP2或对照疫苗HVT FC-126，空白对照组仅接种疫苗稀释液。各组在免疫后28天，用IBDV强毒TN-209株经点眼途径进行攻毒，攻毒剂量为1000LD50/羽份，攻毒后每天观察并统计各组鸡的发病和死亡情况。从试验结果看，各组鸡在免疫后均正常，没有出现任何异常。攻毒后观察，健康对照组鸡无异常；HVTFC-126组鸡在攻毒后陆陆续续出现临床症状，直至死亡，到试验结束期仅有一只存活，死亡率为9/10；rHVT-HA-VP2免疫组鸡，攻毒后试验，1只鸡出现跛行，其余鸡均未出现临床症状，和健康组鸡没有异常；HVT-VP2免疫组鸡，攻毒后观察，1只鸡出现精神沉郁，其余鸡均未出现临床症状，和健康组鸡没有异常（参见表1和图9）。试验结束后，对存活试验鸡以及发病死亡鸡的解剖观察，可见，空白对照组鸡法氏囊、脾脏等内脏组织均无异常；HVT FC-126组免疫鸡攻毒后，对死亡鸡解剖，可以看到胸腺萎缩、肝脏发黄、质脆、肾肿、花斑肾、法氏囊胶冻、脾肿大、脾出血等不同的病理变化。HVT FC-126组鸡内脏出现病变比例为10/10；rHVT-HA-VP2组免疫鸡攻毒后，对所有鸡解剖，有一只鸡关节异常（不一定是重组毒造成的特异性病变），其余鸡未发现实质器官出现明显的病理变化。HVT-VP2组攻毒后剖检，1只鸡法氏囊有出血和萎缩现象（参见图10和图11）。
对剖检后，各组鸡的囊体指数和脾指数进行计算，与空白对照组相比，rHVT-HA-VP2组有一只鸡BBIX小于0.7，PBIX均正常；HVT-VP2组有一只鸡BBIX小于0.7，PBIX大于1.5；HVT FC-126组鸡基本死亡未做统计（参见表2、图12和图13）。
注：*该组鸡攻毒后基本都死亡，未做BBIX和PBIX分析。**BBIX:小于0.7判为法氏囊萎缩；PBIX:大于1.5判为脾脏肿胀。
进一步对试验过程中的各项指标进行统计，无论rHVT-HA-VP2组，HVT-VP2组，还是HVT FC-126组鸡在免疫前后和空白对照组的鸡体重比较，无显著差异（P值>0.05）（参见表3和图14）。
注：P值>0.05差异不显著；P值<0.05差异显著；P值<0.01差异及其显著；
2. 重组病毒rHVT-HA-VP2疫苗与H9亚型禽流感病毒疫苗的免疫保护评价
将40只1日龄SPF鸡随机分成四组，分别为rHVT-HA-VP2组、HVT-H9疫苗组、HVT FC-126组和空白对照组；其中rHVT-HA-VP2组、HVT-H9组、HVT FC-126组在1日龄时通过颈部皮下接种4000PFU/羽份的重组病毒载体疫苗rHVT-HA-VP2、HVT-H9或HVT FC-126，空白对照组仅接种疫苗稀释液。各组在免疫后21天，用H9亚型禽流感病毒FJ株攻毒，攻毒方式为静脉注射0.1mL含（2×107EID50），攻毒后第5日，采集每只鸡的咽拭子和泄殖腔拭子，进行病毒分离。临床观察结果表明，重组病毒载体疫苗rHVT-HA-VP2、HVT-H9、HVT FC-126和空白对照组在接种后，所有组SPF鸡均健康存活，所有鸡采食、饮水、精神状态、运动等均无异常，以上结果表明，同HVT-H9载体疫苗和HVT FC-126疫苗安全性一致，rHVT-H9-VP2重组载体疫苗对SPF鸡是安全的。用H9亚型禽流感病毒攻毒后，5天内连续观察，所有分组鸡群均存活，无明显的临床表现。将采集的咽拭子和泄殖腔拭子，进行无菌处理后，接种SPF鸡胚，3天后，测定HA效价，检测病毒分离情况。试验结果表明，rHVT-HA-VP2疫苗免疫组有1只鸡咽拭子和泄殖腔拭子H9亚型禽流感病毒分离阳性，综合保护率为90%；HVT-H9疫苗免疫组有1只鸡咽拭子H9亚型禽流感病毒分离阳性，综合保护率为90%；HVT FC-126疫苗组仅1只鸡病毒分离阴性，综合保护率10%，无保护作用；而空白对照组均未分离到病毒，空白对照试验成立（参见表4）。
疫苗免疫后，每组随机取5只鸡采血，分离血清，用H9亚型禽流感病毒FJ株抗原检测免疫后血清HI效价水平。试验结果表明，rHVT-HA-VP2组和HVT-H9组免疫后1周即可检测到HI效价，第二周开始达到保护水平的抗体效价，第三周抗体效价能够达到28。攻毒后第5天，采血，抗体效价能够达到29（参见图15）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2的构建方法，其特征在于，所述构建方法是在火鸡疱疹病毒基因组中插入H9亚型禽流感病毒HA基因的表达盒、鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的表达盒和间隔序列。
2.根据权利要求1所述的重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
1）在H9亚型禽流感病毒HA基因表达盒的左右两侧，分别插入间隔序列1和间隔序列2；
2）在鸡传染性法氏囊病毒VP2基因表达盒的下游插入间隔序列3；
3）将步骤1）和2）的产物插入火鸡疱疹病毒，构建重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2。
3.根据权利要求2所述的重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2的构建方法，其特征在于，所述H9亚型禽流感病毒HA基因的表达盒左侧插入的间隔序列1如SEQ ID NO: 1所示；所述H9亚型禽流感病毒HA基因的表达盒右侧插入的间隔序列如SEQ ID NO: 2所示。
4.根据权利要求2所述的重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2的构建方法，其特征在于，所述鸡传染性法氏囊病毒VP2基因表达盒下游插入的间隔序列3如SEQ ID NO: 3所示。
5.根据权利要求2所述的重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2的构建方法，其特征在于，步骤1）所述的插入位点为火鸡疱疹病毒FC-126基因组上HVT053和HVT054之间。
6.根据权利要求2所述的重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2的构建方法，其特征在于，步骤1）所述的插入位点为火鸡疱疹病毒FC-126基因组上HVT088基因内。
7.根据权利要求1所述的重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2的构建方法，其特征在于，所述H9亚型禽流感病毒HA基因的表达盒的启动子为CAG复合启动子，终止子为rabbit beta-actin转录终止子。
8.根据权利要求1所述的重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2的构建方法，其特征在于，所述鸡传染性法氏囊病毒VP2基因表达盒的启动子为hCMV启动子，终止子为SV40 polyA转录终止子。
9.一种如权利要求1所述重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2在制备禽流感病毒疫苗中的应用。
10.一种如权利要求1所述重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2在制备传染性法氏囊病的疫苗中的应用。
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| CN118086231A (zh) * | 2024-04-23 | 2024-05-28 | 天津瑞普生物技术股份有限公司 | 重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2-gDgI及应用 |
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