CN117535261A

CN117535261A - 糖基转移酶突变体在制备活性人参皂苷中的应用

Info

Publication number: CN117535261A
Application number: CN202311495196.1A
Authority: CN
Inventors: 何冰芳; 钦松; 王文文; 吴斌; 储建林; 姜天玥
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2023-11-10
Filing date: 2023-11-10
Publication date: 2024-02-09

Abstract

本发明公开了糖基转移酶突变体在制备活性人参皂苷中的应用。所述突变体是将糖基转移酶Yjic的氨基酸序列中第12位残基突变为另一种氨基酸残基得到；所述糖基转移酶Yjic的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。以本发明构建的糖基转移酶突变体与蔗糖合成酶AtSuSy双酶偶联催化体系，以原人参二醇为底物，可实现一步法直接定向制备活性人参皂苷F12，底物转化率高，且产物较为单一，有助于减少后续的分离步骤，精简产物提纯过程。人参皂苷F12具有抑制肿瘤细胞、提高免疫力等多种药用活性，因此在新药的开发上有很大的前景。

Description

糖基转移酶突变体在制备活性人参皂苷中的应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种糖基转移酶Yjic突变体及其在制备非天然人参皂苷中的应用。

背景技术

人参(Panax ginseng C.A，Mey.)是一种名贵中草药，是我国长期使用的重要中草药之一。《神农本草经》中指出人参具有补气、安神、止惊悸、明目等等功效。现代科学研究表明，人参在提升免疫力、抗肿瘤、改善心血管、抗氧化、抗衰老、抗阿尔茨海默病、降血糖、美白等多个方面均有不错的辅助作用，被誉为“百草之王”。自然界中除了少数例外，人参皂苷一般具有相似的基本结构，即由饱和的1,2-环戊过氢菲(甾烷或甾烷)甾体核组成。由苷元的骨架分为两类，齐墩果烷型五环三萜皂苷和达玛烷型四环三萜皂苷。达玛烷型的人参皂苷更为常见且活性更强，根据其皂苷苷元的不同，将其分为两类，20(S)-原人参二醇(PPD,protopanaxadiol)类皂苷和20(S)-原人参三醇(PPT,protopanaxatriol)类皂苷。常见的PPD型人参皂苷包括人参皂苷C-K、Rb1、Rb2、Rh2、Rd、Rg3等，常见的PPT型人参皂苷包括人参皂苷F1、Rh1、Rg1、Rg2、Re等。

这些相似而不同人参皂苷基于不同母核、不同糖基、不同糖基化位点及糖基化修饰程度，产生了多种多样的药用活性。有研究表明，一些非天然人参皂苷对肺癌细胞的抑制作用明显强于天然人参皂苷Rg3、Rh2等(Atopkina L N,et al；Planta Medica,1999,65(1):30-34)。例如，通过糖基化反应作用对原人参二醇的非天然糖基化位点(C-3、C-12)进行糖基化修饰，合成的非天然人参皂苷F12(3-O-β-D-glucopyranosyl-12-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol)具有独特生理和药理活性，尤其用于制备抗肿瘤药物，其针对结肠癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞和胃癌细胞具有显著的抑制作用，并存在着更多的潜在药用价值。

糖基转移酶(Glycosyltransferase)能够特异性地将糖基供体中的活性糖基团转移到糖基受体上，糖基转移酶涉及生物体内的多种糖类化合物以及糖苷化合物的合成、生理代谢等等方面。常见的活化糖形式为核苷二磷酸糖，包括UDP-葡萄糖(尿苷二磷酸葡糖，UDPG)、UDP-半乳糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖、UDP-葡萄糖醛酸等等。根据蛋白质序列对糖基转移酶进行区分，可将糖基转移酶划分为96个家族，其中涉及天然糖苷产物合成的家族大多属于家族1。目前糖基转移酶的折叠方式基本归纳为GT-A型和GT-B型。GT-A型由两个紧凑的Rossmann叠域构成，GT-B则由两个较为独立的结构域构成。同时GT-A型的糖基转移酶与底物结合时的过渡态需要二价金属离子帮助稳定，GT-B型的糖基转移酶催化过程无须二价金属离子的帮助。

发明内容

本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌来源的糖基转移酶Yjic突变体及其在制备非天然人参皂苷中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种糖基转移酶Yjic突变体，所述突变体是在如SEQ ID NO.2所示的糖基转移酶Yjic氨基酸序列的基础上进行突变，所述突变是将糖基转移酶Yjic氨基酸序列中的第12位脯氨酸(P)突变为另外一种氨基酸残基。

本发明所述糖基转移酶Yjic可以从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中分离获得，也可以从重组表达该蛋白质的表达转化体重分离获得，也可以人工合成获得。

进一步地，所述氨基酸残基选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)或色氨酸(W)。

进一步地，所述突变为P12A。

一种表达基因，该基因编码上述糖基转移酶Yjic的突变体。

一种重组质粒，该重组质粒中含有上述表达基因。

上述糖基转移酶Yjic突变体在制备非天然人参皂苷中的应用。

进一步地，所述非天然人参皂苷为3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-12-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)原人参二醇。

一种利用上述糖基转移酶Yjic突变体制备非天然人参皂苷的方法，所述方法利用双酶偶联催化体系合成非天然人参皂苷；

所述双酶偶联催化体系包括糖基转移酶Yjic突变体、蔗糖合成酶AtSuSy、原人参二醇、蔗糖和尿苷二磷酸二钠UDP。

作为一种优选的实施方式，双酶偶联催化体系中所述糖基转移酶Yjic突变体的用量为40mU/mL-320mU/mL，优选40mU/mL；蔗糖合成酶AtSuSy的用量为10mU/mL-60mU/mL，优选20mU/mL。

作为一种优选的实施方式，双酶偶联催化体系中原人参二醇的浓度为0.1mM-30mM，优选6mM；蔗糖浓度为50mM-2000mM，优选400mM；尿苷二磷酸二钠浓度为0.2mM-1.6mM，优选1.2mM。

作为一种优选的实施方式，双酶偶联催化体系中还添加二甲亚枫DMSO和吐温80；DMSO添加浓度为0～20％(V/V)，优选10％(V/V)；吐温80添加浓度为0～5％(V/V)，优选2％。

作为一种优选的实施方式，所述双酶偶联催化体系反应温度为20～45℃，优选35℃；初始pH为6.5～10.5，优选8.0。

本发明以枯草芽孢杆菌来源的糖基转移酶Yjic基因，通过丙氨酸扫描、饱和突变、迭代饱和突变等半理性设计的酶工程改造技术对糖基转移酶Yjic进行突变改造，使其能够以原人参二醇(PPD)为底物，一步法定向合成双糖苷的非天然人参皂苷3-O-β-D-Glc-12-O-β-D-Glc-20(S)PPD。同时，本发明所述的糖基转移酶突变体与蔗糖合成酶AtSuSy双酶偶联催化体系，以原人参二醇为底物，可实现一步法直接定向非天然人参皂苷F12，底物转化率高，且产物较为单一，有助于减少后续的分离步骤，精简产物提纯过程，从而为所述非天然人参皂苷的医药应用奠定基础。

附图说明

图1为糖基转移酶Yjic及其融合表达的SDS-PAGE电泳分析图。

图2为糖基转移酶Yjic或其突变体和蔗糖合成酶AtSuSy偶联催化合成3-O-β-D-Glc-12-O-β-D-Glc-20(S)PPD的反应示意图。

图3为蔗糖合成酶AtSuSy表达的SDS PAGE分析图。

图4为吐温80浓度对双酶体系活性的影响。

图5为一锅法补料合成人参皂苷F12。

图6为糖基转移酶突变体P12A催化PPD糖基化反应产物HPLC分析图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1、糖基转移酶Yjic质粒提取

将糖基转移酶重组菌(pET-28a-YjiC)菌株接种于含有卡那霉素的液体LB培养基中，在恒温摇床37℃，180rpm培养10-12h。按照“AxyPrep质粒DNA小量提取试剂盒”的操作说明提取质粒。取2μL质粒样品进行琼脂糖凝胶电泳分析，验证出明显亮条带即可用作后续PCR扩增的模板。糖基转移酶Yjic的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

2、糖基转移酶Yjic的定点突变

以Swiss-model在线服务器建立糖基转移酶Yjic的三维结构模型，hotspotwizard在线软件进行热点扫描预测，将预测的活性中心周围氨基酸残基分别突变为丙氨酸，糖基转移酶Yjic中突变为丙氨酸的位点分别为P12A、L128A、I11A、E83A、P64A、G294A。分别对糖基转移酶Yjic的突变体进行诱导表达，制备获得其突变体。以野生型糖基转移酶Yjic或其突变体催化合成非天然人参皂苷，利用高效液相色谱检测产物，计算突变体催化底物的转化率和产物选择性。去除部分活性下降的位点如I11、E83、P64、G294，在野生型糖基转移酶YjiC的基础上，选择P12、L128进行突变来提高突变体人参皂苷F12倾向的区域选择性。考虑到转化率和选择性，选择两者都相较野生型都提高的突变体P12A进行饱和突变。

将糖基转移酶Yjic的饱和突变点中底物转化率和选择性提高的点作为迭代突变的候选点。糖基转移酶Yjic序列中的第12位脯氨酸(P)突变为另外一种氨基酸残基，选自下述的丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、色氨酸(W)。

具体方法如下：

采用Agilent的在线引物设计QuikChange Primer Design软件设计引物，枯草芽孢杆菌来源的糖基转移酶Yjic或其突变体质粒为模板，进行全质粒PCR定点突变。

表1几种突变体的引物

表2突变体全质粒扩增的PCR体系

表3突变体全质粒扩增的PCR反应体系

取2μL样品进行琼脂糖凝胶电泳，验证出bp约为6500左右的明显亮条带后，表明全质粒PCR扩增成功。

模板消化：采用Quick cut Dpn I消化酶于37℃消化30min去除模板质粒。

表4 Quick cut Dpn I消化体系

消化处理后的PCR产物采用热激法转化进入大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)中。转化完成后在Kana抗性的固体LB培养基上进行平板涂布，37℃培养12-16h，然后挑取平板上生长良好的菌落进行菌落PCR验证。菌落PCR中的聚合酶选用诺唯赞公司的P112-02 Taq Master Mix(Dye Plus)。

表5菌落PCR反应体系

表6菌落PCR反应条件

菌落PCR产物分别取2μL样品进行琼脂糖凝胶电泳，阳性菌株在安徽通用生物公司进行测序工作。选取正确突变的菌株接种于含有卡那霉素的LB培养基中，在恒温摇床37℃，180rpm培养10-12h。然后取出800μL新鲜菌液加入冻存管中，放置在-80℃冰箱中保藏。

3、糖基转移酶Yjic及其突变体的诱导表达

将以上所得的突变体，接种至含有卡那霉素抗性(Kana)的LB液体培养基中，放置于恒温摇床，在37℃，180rpm的条件下培养10-12h后，获得种子液。将新鲜菌液以2％(v/v)的接种量转接至含有卡那霉素(Kana)的新鲜LB液体培养基中放置于恒温摇床，在37℃，180rpm振荡培养1.5h后(菌液OD₆₀₀约为0.6)，然后加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，在20℃，180rpm诱导表达10-12h。

将诱导表达过后的发酵液收集在离心瓶中，在台式离心机中以12000r/min离心20min。离心收集弃去上清后，加入Tris-HCl(pH＝8.0)缓冲液重新悬浮菌体。并进行超声破碎处理，全程在冰浴中进行破碎。超声破碎处理后12000r/min离心10min。取适量上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，验证蛋白表达情况。收集的上清即为后续实验所用的粗酶液。

4、蔗糖合成酶菌株的诱导表达

将平板上的蔗糖合成酶菌种(大肠杆菌BL21含质粒pET28a-AtSuSy，Genbank序列号：AK316826)接种到含有卡那霉素抗性(Kana)的LB液体培养基中放置于恒温摇床，在37℃，180rpm的条件下培养10-12h后，将新鲜菌液以2％的接种量转接至含卡那霉素抗性(Kana)的LB液体培养基中放置于恒温摇床，在37℃，180rpm的条件下约培养1.5h后(菌液OD600约为0.6)，然后加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，在16℃，180rpm诱导表达12-13h。

将诱导表达过后的发酵液收集在离心瓶中，在台式离心机中以12000r/min离心20min。离心收集弃去上清后，加入Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重新悬浮菌体。并进行超声破碎处理，全程在冰浴中进行破碎。超声破碎处理后12000r/min离心10min。取适量上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，验证蛋白表达情况。收集的上清即为后续实验所用的粗酶液。

5、糖基转移酶Yjic突变体和蔗糖合成酶蛋白的分离纯化

将Ni柱填料装入层析柱中借助重力压实，分别用EDTA脱镍液去离子水-硫酸镍溶液-去离子水进行冲洗，去除填料内的杂蛋白并重新挂上镍离子，以1.0mL/min流速的A缓冲液冲洗，直至254nm紫外吸收的基线稳定。将粗酶液以0.5mL/min流速用进样器进入柱子中，以1.0mL/min流速的A缓冲液冲洗，直至254nm紫外吸收的基线稳定，除去不能挂在镍柱上的蛋白，以1.0mL/min流速的A:B(94:6)缓冲液冲洗，直到基线再次稳定，此时基本去除镍柱上结合能力较弱蛋白。以1.0mL/min流速的A:B(80:20)缓冲液冲洗，收集的洗脱液中即含有目的蛋白。将收集洗脱液多次转移进入10Kda的超滤管中离心浓缩。在洗脱液全部离心完后，加入Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)再次离心，反复多次。去除溶液中的残余咪唑后进行分装。纯化结束后，纯化仪以及填料保存在20％乙醇溶液中。

缓冲A液、B液配制如下：

A缓冲液：10mM Na₂HPO₄·12H₂O，1.8mM KH₂PO₄，140mM NaCl，2.7mM KCl，去离子水定容，NaOH调节pH至8.0。

B缓冲液：50mM Na₂HPO₄·2H₂O，300mM NaCl，500mM咪唑，去离子水定容，NaOH调节pH至8.0。

6、突变体催化活力及其区域选择性测定

测定突变体糖基化原人参二醇(PPD)反应的影响，是通过体外酶促反应实现的，分为利用UDPG(二磷酸尿苷葡萄糖)作为糖基供体单酶体系进行检测和利用糖基转移酶与蔗糖合成酶偶联体系进行检测。

单酶反应体系(400μL)包括：6mM PPD、18mM UDPG、20mM Tris-HCl(pH 8.0)、8mMMgCl₂、10％ DMSO、1％(v/v)吐温80和40μL糖基转移酶粗酶液。在恒温摇床中以35℃、200rpm条件下反应4h或12h，然后加入等体积(400μL)的正丁醇充分震荡来终止反应。

双酶反应体系(400μL)包括：6mM PPD、1.2mM UDP(二磷酸尿苷)、20mM Tris-HCl(pH8.0)、8mM MgCl₂、10％ DMSO、1％(v/v)吐温80、400mM蔗糖、40μL糖基转移酶粗酶液和20μL蔗糖合成酶粗酶液。在恒温摇床以35℃、200rpm条件下反应4h或12h，然后加入等体积(400μL)的正丁醇充分震荡来终止反应。

7、糖基转移酶Yjic催化反应条件的优化程序

(1)液相样品的前处理

反应体系加入等体积的正丁醇充分震荡后，反应中的原人参二醇PPD、人参皂苷F12等物质被正丁醇萃取。随后经20000g离心5min后吸取上清，经0.22μm有机微孔滤膜过滤后，直接通过高效液相色谱法(HPLC)进行分析。

(2)HPLC检测分析程序：

仪器：戴安(DIONEX)P680高效液相色谱仪；分析柱：Acclaim 120 C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；检测波长：203nm；进样20微升；检测温度：30℃；流动相：甲醇-水＝85:15(v/v)，1mL/min。

结果显示：糖基转移酶Yjic突变体可以催化原人参二醇的糖基化反应，利用LC-MS和NMR对该产物进行分析，确证糖基转移酶Yjic突变体不仅可以合成人参皂苷Rh2，还可以合成非天然人参皂苷F12(3-O-β-D-Glc-12-O-β-D-Glc-20(S)PPD)。在上述检测条件下，人参皂苷F12的出峰时间为10-13min，人参皂苷Rh2的出峰时间为18-20min，PPD的出峰时间为35-37min。

通过Ni-NTA金属螯合柱层析技术实现了糖基转移酶Yjic的纯化，在此基础上，进一步对糖基转移酶Yjic的催化反应条件进行了研究，为后续应用于非天然人参皂苷的高效合成奠定基础。

8、糖基转移酶Yjic突变体与蔗糖合成酶双酶催化合成非天然人参皂苷中的应用

本反应需要蔗糖合酶AtSuSy，根据Genbank注册号：AED92895.1，合成AtSuSy全长基因，并将其与克隆载体pET-28a连接，连接产物直接转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞内，挑取单菌落进行PCR验证。将测序正确的菌株发酵，离心破碎后即得蔗糖合酶AtSuSy粗酶液，SDS-PAGE分析表达情况，结果如图3所示。

吐温80浓度对双酶体系的影响：

考察在双酶体系中吐温80浓度对底物溶解度和催化PPD糖基化的影响。研究表明双酶偶联反应体系中UDP与PPD最佳摩尔比为0.2。双酶反应体系：分别在3mM、6mM或12mM的PPD浓度条件下，来考察不同吐温80浓度(v/v)(0％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％)对糖基化反应的影响。体系还包含UDP与PPD摩尔比为0.2、20mM Tris-HCl(pH8.0)、8mM MgCl₂、10％ DMSO、400mM蔗糖、突变体P12A粗酶液45mU/mL、蔗糖合成酶粗酶液60mU/mL。反应条件为35℃和200rpm，反应12h后加入等量的正丁醇终止反应。结果如图4所示。

一锅法补料对双酶体系的影响：

为了高效生产人参皂苷F12，本发明建立双酶偶联补料体系(UGT-SuSy级联反应)，通过突变体P12A的人参皂苷F12合成倾向区域选择性来高效定向生产人参皂苷F12。

初始反应体系(10mL)包含：4mM PPD、0.8mM UDP、20mM Tris-HCl(pH 8.0)、400mM蔗糖、2.4％ DMSO、2％(v/v)吐温80、45mU/mL糖基转移酶突变体粗酶液和60mU/mL蔗糖合成酶粗酶液。反应在35℃和200rpm下进行。每小时取出50μL反应样品液并添加等体积的正丁醇终止反应，后续再进行萃取和液相分析操作。

补料方法如下：将底物PPD溶于DMSO中，配置PPD母液浓度为180mM。前期糖基化PPD速率相对较快，因此在反应第1h和2h时补入1mM的PPD(55.6μl的PPD母液)。在反应第4h、6h、8h、10h时补入2mM的PPD(111.2μl的PPD母液)。在反应第12h时补入4mM的PPD(222.4μl的PPD母液)。最终体系DMSO浓度约为10％。

补酶方法如下：随着反应进行酶活会逐渐降低，为了提高反应效率需要在反应中途进行补酶。在反应第6h和12h时补入新鲜的粗酶液(45mU/mL突变体和60mU/mL蔗糖合成酶)。突变体SNF应用于人参皂苷Rh2的合成，突变体P12A应用于人参皂苷F12的合成。

一锅法补料生产人参皂苷F12，反应的第一小时突变体P12A转化的PPD生成了0.74mM的人参皂苷F12和0.89mM人参皂苷Rh2。反应中的人参皂苷Rh2是人参皂苷F12的前体，因此在最初的反应中人参皂苷Rh2的浓度超过了人参皂苷F12。在后续反应中随着PPD的每次补入，体系中的人参皂苷Rh2浓度会小幅度提升。这是由于底物PPD浓度提高导致的。在整个反应中人参皂苷Rh2浓度终趋于稳定，而人参皂苷F12则在反应中不断积累。经过28h的不断补料反应，最终体系DMSO浓度约为10％，合成了17.3mM(13.58g/L)的人参皂苷F12和0.61mM的人参皂苷Rh2。PPD的总转化率高达99.5％，人参皂苷F12在总糖苷产物中占比96.6％，UDPG循环再生次数RC值约为44.4。结果如图5所示。

双酶反应体系(400μL)包括：6mM PPD、1.2mM UDP、20mM Tris-HCl(pH 8.0)、8mMMgCl₂、10％ DMSO、1％(v/v)吐温80、400mM蔗糖、40μL糖基转移酶粗酶液和20μL蔗糖合成酶粗酶液。在恒温摇床以35℃、200rpm条件下反应4h或12h，然后加入等体积(400μL)的正丁醇充分震荡来终止反应。样品过膜处理后用高效液相色谱法(HPLC)检测目标产物。

表7人参皂苷F12的合成概况

以上结果表明：以原人参二醇(PPD)为底物，糖基转移酶Yjic的突变体有良好的合成非天然人参皂苷的能力，其中突变体P12A的合成效果最佳，成功构建了高效定向催化PPD糖基化生成人参皂苷F12的双酶体系，如表7所示，借助突变体P12A的高活性以及高区域选择性，利用PPD作为原料高效合成了17.3mM(13.58g/L)的人参皂苷F12和0.61mM的人参皂苷Rh2。底物PPD的总转化率高达99.5％，人参皂苷F12在总糖苷产物中占比96.6％，UDPG循环再生次数RC值约为44。在目前已发表的文献中本研究合成F12的产量、在总糖苷产物中占比和总转化率均处于较高水平。这也是非天然人参皂苷F12产量首次超过10g/L。

表明该突变体能专一性的产生双糖基化产物F12(3-O-β-D-Glc-12-O-β-D-Glc-20(S)PPD，选择性较高。利用糖基转移酶突变体和蔗糖合成酶构成的双酶偶联反应，可实现一步法直接制备非天然人参皂苷F12产物，简化制备过程，可以大大降低生产成本，在生物制药工业中具有广阔的应用前景。

Claims

1. 一种糖基转移酶Yjic突变体，其特征在于，所述突变体是在如SEQ ID NO.2所示的糖基转移酶Yjic氨基酸序列的基础上进行突变，所述突变是将糖基转移酶Yjic氨基酸序列中的第12位脯氨酸突变为另外一种氨基酸残基。

2.根据权利要求1所述的糖基转移酶Yjic突变体，其特征在于，所述氨基酸残基选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺或色氨酸。

3.一种表达基因，其特征在于，该基因编码权利要求1所述的糖基转移酶Yjic突变体。

4.一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒中含有权利要求3所述的表达基因。

5.权利要求1所述的糖基转移酶Yjic突变体在制备非天然人参皂苷中的应用。

6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述非天然人参皂苷为3 -O -β-D-吡喃葡萄糖基-12 O-β-D-吡喃葡萄糖基-20（S）原人参二醇。

7.利用权利要求1所述的糖基转移酶Yjic突变体制备非天然人参皂苷的方法，其特征在于，所述方法利用双酶偶联催化体系合成非天然人参皂苷；

所述双酶偶联催化体系包括权利要求1所述的糖基转移酶Yjic突变体、蔗糖合成酶AtSuSy、原人参二醇、蔗糖和尿苷二磷酸UDP。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，双酶偶联催化体系中所述糖基转移酶Yjic突变体的用量40mU/mL-320mU/mL；蔗糖合成酶AtSuSy的用量为10mU/mL-60mU/mL。

9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，双酶偶联催化体系中还添加二甲亚枫DMSO和吐温80，DMSO添加浓度为10% V/V，吐温80添加浓度为2% V/V。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，双酶偶联催化体系反应温度为20～45℃，初始pH为6.5～10.5。