CN117529487A

CN117529487A - 新颖苯丙素类化合物

Info

Publication number: CN117529487A
Application number: CN202280030063.4A
Authority: CN
Inventors: 詹华强; 堺孝子; 董婷霞; 彭治添; 王怀友; 坚母司屋
Original assignee: Napier Co ltd
Current assignee: Napier Co ltd
Priority date: 2021-06-03
Filing date: 2022-03-14
Publication date: 2024-02-06
Also published as: KR20240017335A; JP6919960B1; JP2022185604A; EP4349844A1; TW202313063A; WO2022254867A1

Abstract

本发明提供一种源自长角豆的新颖的活性成分及其用途。本发明是下述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂合物。

Description

新颖苯丙素类化合物

技术领域

本发明涉及一种从作为豆科植物的长角豆(Ceratonia siliqua L.)分离、提纯所获得的新颖的苯丙素类化合物及其用途，还涉及该化合物的制造方法。

背景技术

长角豆(Ceratonia siliqua L.)是主要原产于地中海地区的豆科植物。长角豆的荚果、即长角豆的荚及果肉被称为角豆荚(carob)，从前以来就被用作食用或食品原料。成熟的荚果的长度为10～25cm左右，呈现甜味。长角豆的荚果中包含大量多糖类、纤维素及矿物质类，包含少量蛋白质、非碳水化合物类的低分子化合物等。近年来，与长角豆的新功能相关的研究正不断推进，报告有：长角豆的荚果(pod)的水萃取物具有消化道中的止泻、抗氧化、抗菌、抗溃疡及抗炎症作用等多种药理作用，具有对溃疡性结肠炎、胃溃疡等消化器疾病的预防及治疗效果(非专利文献1、2)。另外，专利文献1记载了长角豆的种子萃取物中存在α-葡萄糖苷酶抑制活性，具有抑制体重增加的效果(专利文献1)。

另一方面，自由基是体内的代谢过程中所生成的中间产物，是包含不成对电子的具有非常活泼的化学性质的原子、原子团或分子。体内所生成的过量的自由基损伤正常细胞的细胞膜，使蛋白质改性，引起酶功能的丧失及DNA、细胞外基质的损伤。由自由基所引起的损伤与老化、致癌、阿兹海默症、心血管、脑血管的疾病及皮肤病等密切相关。人体虽具备用于防止由自由基所引起的损伤的抗氧化机制，但因连续的老化、患病状态等，难以完全排除由过量的自由基所引起的损伤。因此，为了维持人体的正常功能，利用抗氧化剂来去除自由基是非常有效的。作为现在所利用的抗氧化剂，可举出：二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)等，但这些具有价格昂贵、安全性差等课题。

若因自由基的强的氧化力而使细胞外基质等损伤，则可能失去肌肤的弹性。另外，因老化而使皮肤松弛，肤质变得粗糙，肌肤暗沉，因此肤色变暗。同时，由于人类的肤色主要取决于体内所生成的黑色素含量，因此黑色素积蓄于皮肤也是肤色变暗、失去弹性及光泽度的重要理由之一。

根据最近的研究成果，具有抗氧化活性的物质可通过去除体内的自由基而减少由自由基所引起的损伤，由此减缓皮肤的老化进程，并且，作为其结果，可带来美白效果。因此，抑制黑色素生成且具有抗氧化活性的物质可发挥协同的美白效果。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2005-119999号公报

非专利文献

非专利文献1：Rtibi K,Jabri M A,Selmi S,et al.,“Prevent ive effect ofcarob(Ceratonia siliqua L.)in dextran sulfate sodi um-induced ulcerativecolitis in rat”,RSC Advances,2016,Vol.6,p.19992-20000.

非专利文献2：Rtibi K,Selmi S,Grami D,et al.,“Chemical constituents andpharmacological actions of carob pods and leave s(Ceratonia siliqua L.)on thegastrointestinal tract:A review”,Biomedicine&Pharmacotherapy,2017,Vol.93,p.522-528.

发明内容

发明要解决的问题

然而，虽然上述非专利文献1、2中报告长角豆的荚果萃取物具有消化道中的止泻、抗氧化、抗菌、抗溃疡及抗炎症作用等药理作用，具有对消化器疾病的治疗效果，以及专利文献1中报告长角豆的种子萃取物具有抑制体重增加的效果，但尚未特定出具体的活性成分。

另外，至今未研究过使用长角豆作为美白剂，其有效性完全不明确。

因此，本发明是鉴于上述方面而成的，其目的在于提供一种源自长角豆的新颖的活性成分及其用途。

另外，本发明的另一目的在于提供一种具有黑色素生成抑制作用且还具有抗氧化活性的新的美白剂，其源自作为天然物的长角豆。此外，目的在于提供一种包含该美白剂的皮肤外用剂、化妆品及皮肤美白用饮食品组合物。

用于解决问题的技术手段

本发明人等发现，从长角豆的荚果萃取物可分离出新颖的苯丙素类化合物，该新颖化合物不仅具有黑色素生成抑制作用，还具有抗氧化活性。基于该见解而完成本发明。

为了解决上述课题，本发明为下述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂合物。

[化学式1]

式(I)所表示的化合物是从长角豆(Ceratonia siliqua)的荚果萃取物分离、提纯出的新颖苯丙素类化合物，具备黑色素生成抑制作用及抗氧化活性，具有美白效果。

另外，本发明的美白剂含有上述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂合物。通过投予式(I)所表示的化合物，可抑制皮肤中的黑色素生成，且可去除自由基而抑制皮肤老化，因此发挥协同的美白效果。

另外，本发明的美白剂还优选上述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂合物的浓度为0.001mM～1mM。由此，可选择效果优异的活性成分的浓度。

另外，本发明的黑色素生成抑制剂含有上述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂合物。通过投予式(I)所表示的化合物，可抑制皮肤中的黑色素生成。

另外，本发明的抗氧化剂含有上述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂合物。通过投予式(I)所表示的化合物，可去除自由基，可减少因自由基所产生的损伤。

另外，本发明的美白剂、黑色素生成抑制剂或抗氧化剂也优选为皮肤外用剂或化妆品。由此，可获得具有皮肤美白效果、具有皮肤中的黑色素生成抑制效果或皮肤的老化防止效果的皮肤外用剂或化妆品。

另外，本发明的皮肤美白用饮食品组合物含有上述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂合物。由此，可获得抑制皮肤中的黑色素生成，且去除体内的自由基而减缓皮肤的老化进程，由此发挥协同的美白效果的饮食品组合物。

另外，本发明的上述式(I)所表示的化合物的制造方法具有以下工序：获得长角豆(Ceratonia siliqua)的荚果的含水醇萃取物的工序；按照石油醚、乙酸乙酯的顺序对该含水醇萃取物进行液液萃取，回收乙酸乙酯级份的工序；及从所回收的乙酸乙酯级份中分离式(I)所表示的化合物的工序。由此，可获得具备抗氧化活性及黑色素生成抑制作用、具有美白效果的新颖的苯丙素类化合物。

发明效果

根据本发明，可提供一种具有如下所示的优异效果的新颖苯丙素类化合物、以及含有该化合物的美白剂、黑色素生成抑制剂、抗氧化剂、皮肤外用剂、化妆品及皮肤美白用饮食品组合物。

(1)具备黑色素生成抑制作用及抗氧化活性，具有协同的美白效果。

(2)由于将源自从前以来用作食用的长角豆的荚果的化合物作为有效成分，因此对人体的安全性高。

附图说明

图1是示出本发明的化合物的高分辨ESI质谱的图。

图2是示出本发明的化合物的紫外吸收光谱的图。

图3是示出本发明的化合物的红外吸收光谱的图。

图4是示出本发明的化合物的¹H-NMR光谱(CD₃OD、600MHz)的图。

图5是示出本发明的化合物的¹³C-NMR光谱(CD₃OD、150MH z)的图。

图6是示出本发明的化合物的HSQC谱的图。

图7是示出本发明的化合物的HMBC谱的图。

图8是将本发明的化合物的¹H-NMR信号及¹³C-NMR信号汇总至一览而得的图。

图9是示出本发明的化合物的HMBC相关的图。

图10是示出实施例4中由本发明的化合物所带来的DPPH自由基消除活性的图表。

图11是示出实施例5中本发明的化合物对HepG2细胞的细胞毒性试验的结果的图表。

图12是示出实施例5中由本发明的化合物所带来的HepG2细胞中的ROS生成抑制效果的图表。

图13是示出实施例6中本发明的化合物对B16黑色素瘤细胞的细胞毒性试验的结果的图表。

具体实施方式

以下，对本发明的新颖苯丙素类化合物及包含其的美白剂、黑色素生成抑制剂、抗氧化剂、皮肤外用剂、化妆品及皮肤美白用饮食品组合物以及该化合物的制造方法进行说明。

本发明的下述式(I)所表示的新颖苯丙素类化合物是葡萄糖与2-甲基丙酸分别酯键合于芥子醇而成的化合物。

[化学式2]

本发明的新颖苯丙素类化合物可为盐，优选为药理学上所容许的盐。作为该新颖苯丙素类化合物的药理学上所容许的盐，只要为与酸或碱形成的盐即可，并无特别限定。另外，该新颖苯丙素类化合物或其盐可以为溶剂合物，并无特别限定，例如可列举：水合物、乙醇等有机溶剂合物。

本发明的新颖苯丙素类化合物具有优异的黑色素生成抑制作用，进而还兼具抗氧化作用，因此可用作可获得基于多种机制的美白效果的美白剂。即，由于通过本发明的新颖苯丙素类化合物可抑制皮肤中的黑色素生成，且通过抗氧化作用可去除自由基，因此可抑制因由自由基造成的损伤所引起的皮肤老化所导致的肌肤暗色化，发挥协同的美白效果。

在本发明中，黑色素生成抑制作用是指如下作用，即，与未添加或投予本发明的新颖苯丙素类化合物的状态下的对照组相比，例如B16黑色素瘤细胞等黑色素生成细胞中的黑色素生成量减少。更具体而言，黑色素生成量优选为对照组的80％以下，更优选为70％以下。

另外，在本发明中，抗氧化作用是指如下作用，即，与未添加或未投予本发明的新颖苯丙素类化合物的状态下的对照组相比，例如DPPH自由基消除率高，或使细胞内ROS减少。

本发明的新颖苯丙素类化合物可通过从长角豆的荚果中分离、提纯而获得。本发明中所使用的长角豆的学名为Ceratonia siliqua，是豆科云实亚科长角豆属的植物。其是原产于地中海沿岸地区的植物，但在本发明中，产地、栽培环境并无特别限定，可使用所有产地及栽培环境的长角豆。

对本发明的新颖苯丙素类化合物的从长角豆分离的方法进行说明。首先，从长角豆的荚果获得含水醇萃取物。本发明中的长角豆荚果的含水醇萃取物是指通过在长角豆的荚果中加入含水醇作为萃取溶剂，实施萃取处理从而获得的萃取物。长角豆的荚果是指长角豆的带荚果实的荚及果肉，也可使用荚或果肉的任一者作为萃取材料，但更优选使用荚及果肉。关于萃取处理，对采集后的状态即未加工状态下的长角豆荚果、或干燥状态下的长角豆荚果进行萃取处理，但为了提高萃取效率，或为了使操作变容易，也可对实施了各种前处理的长角豆荚果实施萃取处理。作为前处理，并无特别限定，可举出：干燥处理、破碎处理或粉碎处理等，也可对实施了这些前处理的长角豆的荚果实施萃取处理而获得萃取物。

作为构成用作萃取溶剂的含水醇的醇，只要能够萃取本发明的苯丙素类化合物，则无特别限定，例如可列举：乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇、丁醇或异丁醇等。其中，就对人体的安全性及萃取效率等观点而言，作为萃取溶剂，可优选地选择含水乙醇。另外，作为含水醇的醇浓度，优选为50～99％，更优选为60～97％，特别优选为70～95％。另外，萃取溶剂中也可在不妨碍本发明的化合物的萃取的范围内含有其他成分。

作为利用含水醇的萃取方法，对于长角豆的荚果加入作为萃取溶剂的含水醇而浸渍，进行萃取。例如，在将长角豆荚果设为含水率小于10％的干燥破碎物的情况下，优选相对于植物体1重量份使用5～10重量份的萃取溶剂。另外，作为萃取方法，可通过室温下的萃取、加热萃取、加压加热萃取或亚临界萃取等任一方法进行，但就萃取效率的观点而言，优选利用回流操作的加热萃取。另外，为了提高萃取效率，优选进行数次萃取操作，进一步优选改变萃取溶剂中的醇浓度进行数次萃取操作。虽并无特别限定，但具体而言，可举出：进行利用95％乙醇的回流萃取1～5次，接下来进行利用70％乙醇的回流萃取1～5次这样的萃取方法。萃取时间可根据萃取方法、萃取材料的方式、萃取溶剂的种类或萃取温度等进行各种设定，例如，在使用70～95％的乙醇进行回流萃取的情况下，作为1次的萃取时间，优选设为1～3小时左右，特别优选设为1.5小时左右。上述萃取处理后，通过倾析、离心分离或过滤等去除残渣，由此可获得长角豆的荚果的含水醇萃取物。也包括通过对所获得的萃取物实施减压蒸馏等处理而制成浓缩液、固形物者。

对于如上述那样地获得的长角豆的荚果的含水醇萃取物，由于考虑到存在长角豆的荚果中所大量包含的糖类等，因此为了去除这些不需要的成分，也可进行利用离子交换树脂的分离操作。具体而言，相对于长角豆的荚果的含水醇萃取物1重量份，加入1～10重量份的水使其分散，通过装有大孔吸附树脂等离子交换树脂的柱，使本发明的苯丙素类化合物吸附，使糖类等不需要的成分流出去除。其后，通过95％乙醇等使其溶出，由此回收包含本发明的苯丙素类化合物的级份。

接下来，对长角豆的荚果的含水醇萃取物或通过上述离子交换树脂所分离出的回收级份的进一步分离操作进行说明。使含水醇萃取物或回收级份分散于水系溶剂中，按照石油醚、乙酸乙酯的顺序进行溶剂萃取。作为水系溶剂，只要能够使本发明的苯丙素类化合物分散，则无特别限定，优选使用50％含水甲醇。进行数次利用石油醚/水系溶剂的液液萃取后，进行数次利用乙酸乙酯/水系溶剂的液液萃取。通过该溶剂萃取操作所回收的乙酸乙酯级份包含本发明的新颖的苯丙素类化合物。利用各溶剂系的液液萃取的次数优选为2～10次左右，特别优选为5次左右。

由如上述那样地获得的乙酸甲酯级份基于常规方法进行提纯，由此可单独分离出本发明的新颖苯丙素类化合物。作为提纯方法，可举出：正相色谱法、反相色谱法、薄层色谱法、凝胶过滤色谱法及高效液相色谱法等，可组合这些中的一种或多种进行提纯。各种色谱法中所使用的载体、溶出溶剂等可对应于各种色谱法而适当选择。

需要说明的是，如上所述地从长角豆的荚果分离、提纯的本发明的苯丙素类化合物也可不作为完全的纯物质被单独分离，可包含一部分源自长角豆原料的其他成分。

进而，本发明的新颖苯丙素类化合物可为通过公知方法合成所获得的合成品。

本发明的新颖苯丙素类化合物具有优异的黑色素的生成抑制作用，进而还兼具抗氧化作用，因此可用作可获得基于多种机制的美白作用的美白剂。另外，该苯丙素类化合物可用作黑色素生成抑制剂或抗氧化剂。

含有本发明的新颖苯丙素类化合物的美白剂及黑色素生成抑制剂可用作皮肤外用剂或化妆品，上述皮肤外用剂或化妆品用于抑制皮肤中的黑色素生成，且用于抑制因由自由基造成的损伤所引起的皮肤老化而导致肌肤暗色化。另外，含有本发明的新颖苯丙素类化合物的抗氧化剂可防止因由自由基造成的损伤所引起的皮肤老化，用作用于保持皮肤处于稳定状态的皮肤外用剂。另外，本发明的抗氧化剂可防止由自由基造成的损伤所引起的皮肤老化，预防皮肤松弛、肤质粗糙化、肌肤暗沉，用作具有保持皮肤健康的作用的化妆品。

本发明的美白剂、黑色素生成抑制剂及抗氧化剂的投予量根据作为目标的效果、治疗效果、投予方法或年龄等而变化，因此无法一概而论地进行规定，但关于用作外用剂的情况下的通常一天的非经口的投予量，以本发明的苯丙素类化合物计，优选设为0.2μg～30mg，更优选设为1μg～3mg，进一步优选设为5μg～500μg。另外，作为用作内用剂的情况下的经口的投予量，以本发明的苯丙素类化合物计，通常一天优选设为1μg～1000mg，更优选设为5μg～500mg。

本发明的美白剂、黑色素生成抑制剂及抗氧化剂以及皮肤外用剂及化妆品的剂型并无特别限定，例如可列举：低粘度液体、涂剂(lotion)等液剂、乳液、凝胶、浆料、乳霜、泡沫、面膜、软膏、粉剂、雾剂或贴附剂等、以及锭剂、颗粒剂、胶囊剂或内服用液剂等。需要说明的是，本发明的美白剂、黑色素生成抑制剂及抗氧化剂可应用于化妆品、医药部外品或医药品的任一种。作为具体的产品，并无特别限定，可举出：化妆水、化妆乳霜、化妆乳液、美容液、化妆面膜、化妆清洗剂、皂、毛发护理剂、浴用剂或妆用化妆品、抗痘护肤化妆品等。

在本发明的美白剂、黑色素生成抑制剂及抗氧化剂以及皮肤外用剂及化妆品中，本发明的新颖苯丙素类化合物的配合浓度优选为0.001mM～1mM，更优选为5μM～100μM，进一步优选为10μM～100μM。通过将新颖苯丙素类化合物的配合量设为该范围内，可稳定地配合本化合物，对皮肤的安全性也高，可发挥高的美白效果、黑色素生成抑制作用及抗氧化作用。

本发明的美白剂、黑色素生成抑制剂及抗氧化剂可通过以往惯用的方法制成各种形态。在该情况下，可使用通常制剂用的载体、赋形剂等容许作为医药品的添加剂的添加剂进行制剂化。另外，为了提高本化合物的生物可利用度、稳定性，也可使用包括微囊、微粉化、使用环糊精等的包合等制剂技术的药物递送系统。

另外，可在本发明的美白剂、黑色素生成抑制剂及抗氧化剂以及皮肤外用剂及化妆品中适当配合作为皮肤外用剂及化妆品中通常使用的成分的水、油脂类、蜡类、烃类、脂肪酸类、高级醇类、酯类、植物萃取物类、维生素类、水溶性高分子、表面活性剂、金属皂、醇、多元醇、pH调节剂、防腐剂、香料、粉体、增稠剂、色素或螯合剂等成分。进而，可在不损害本发明的作用效果的范围内，与通常使用的各种功能性成分、例如选自保湿剂、抗炎剂、细胞活化剂、紫外线防御剂、血液循环促进剂以及其他美白剂、抗氧化剂等中的一种或两种以上功能性成分并用。

进而，本发明的皮肤美白用饮食品组合物含有本发明的新颖苯丙素类化合物作为活性成分。本发明的皮肤美白用饮食品组合物可制成锭剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂等补充品形态；清凉饮料、果汁饮料、酒精饮料等饮料；糖、口香糖、曲奇、饼干、巧克力等点心；面包、粥、谷类、面类、果冻、汤、乳制品、调味料等所有形态。当像这样地用作饮食品时，也可在不会对本发明的有效成分的功效造成影响的范围内，组合各种其他有效成分、维生素、矿物质或氨基酸等营养素等。本发明的饮食品包括补充品、健康食品、功能性食品、特定保健用食品等。另外，关于本发明的饮食品的每日摄取量，以本发明的苯丙素类化合物计，通常一天优选设为1μg～1000mg，更优选设为5μg～500mg。

以下，通过实施例更详细地说明本发明，但本发明并不因这些实施例而受到任何限定。

实施例

[实施例1]

1.长角豆荚果的含水醇萃取物的制备

采集后，从经干燥处理的长角豆(Ceratonia siliqua)的带荚果实去除种子。通过粉碎机粉碎该长角豆的荚果，获得粒径2mm以下的粉碎物。对于20kg的粉碎物，加入140kg(7倍量)的含水的95％乙醇，回流萃取1.5小时，将如上操作进行2次后，进一步通过140kg(7倍量)的含水的70％乙醇对残渣进行1.5小时回流萃取。合并所获得的回流萃取液后，减压蒸馏去除溶剂，获得长角豆荚果的含水乙醇萃取物12.4kg。

[实施例2]

2.长角豆荚果的含水醇萃取物的分离及提纯

使实施例1中所获得的长角豆荚果的含水乙醇萃取物分散于1～10倍量的水中，使其吸附于离子交换树脂(大孔吸附树脂D101，沧州宝恩吸附材料科技有限公司)。用柱容量的3倍量的蒸馏水使其溶出，去除糖类等杂质，其后用柱容量的3倍量的含水的95％乙醇使其溶出，减压蒸馏而去除溶剂，获得462.7g的乙醇溶出级份(非碳水化合物类低分子化合物级份)。接下来，使所获得的乙醇溶出级份分散于1.0L的含水50％甲醇中，按照石油醚、乙酸乙酯的顺序分别进行5次液液萃取。减压蒸馏去除各溶剂，分别获得石油醚级份28.4g、乙酸乙酯级份139.4g及水系级份290.2g。

接下来，对于135.0g的乙酸乙酯级份，供于正相硅胶柱色谱(柱填充材：200～300目，青岛海洋化工厂产品)，使用石油醚(P)/乙酸乙酯(E)及二氯甲烷(C)/甲醇(M)的2种展开溶剂使其溶出，进行区分。其结果是，获得108个溶出级份。对于所获得的108个溶出级份，利用薄层色谱(硅胶GF254板，青岛海洋化工厂产品)进行鉴定，合并类似的级份，获得10个溶出级份A～J。

接下来，对于溶出级份I(20.0g)，供于反相ODS柱色谱(柱填充材：40～63μm，Merck公司产品)，通过甲醇：水＝15：85→100：0的梯度溶出进行区分。对于所获得的溶出级份，利用薄层色谱(硅胶GF254板，青岛海洋化工厂产品)进行鉴定，合并类似的级份，获得5个溶出级份I1～I5。

接下来，对于溶出级份I5(2.7g)，供于凝胶过滤色谱(柱填充材：Sephadex LH-20)，通过二氯甲烷：甲醇＝1：1使其溶出，获得5个溶出级份I5a～I5e。

接下来，将溶出级份I5b(0.5g)用于半制备HPLC(柱I：YMC-Pack ODS-A，250×20mm，5μm)，在甲醇：水＝55：45、检测波长220nm的条件下进行分离，获得级份I5b1。将该级份I5b1用于半制备HPLC(柱II：YMC-Pack ODS-A，250×10mm，5μm)，在甲醇：水＝55：45、检测波长267nm的条件下进行分离，获得本发明的化合物(以下，称为“Ceratonia siliqua B”)48.3mg(保持时间tR＝27.27分钟)。

[实施例3]

3.化合物(Ceratonia siliqua B)的结构解析

进行实施例2中所获得的化合物“Ceratonia siliqua B”的结构解析。当进行结构解析时，进行高分辨质谱分析(HR-ESI-MS；正离子模式)、紫外吸收光谱分析、红外吸收光谱分析、¹H-NMR、¹³C-NMR、HMBC及HSQC分析。这些分析中所使用的装置如下所示。

·高分辨质谱分析：电喷雾电离四级杆飞行时间质谱分析装置(BrukerDaltonics公司产品)

·紫外吸收光谱分析：紫外可见分光光度计(UV-2401PC，株式会社岛津制作所产品)

·红外吸收光谱分析：FT-IR(NEXUS470，Thermo nicolet公司产品)

·NMR分析：600MHz核磁共振装置(AVANCE III 600，Bruk er公司产品)

Ceratonia siliqua B的物理性质如下所示。分别将高分辨质谱分析(HR-ESI-MS)的光谱示于图1，将紫外吸收光谱分析的结果示于图2，将红外吸收光谱分析的结果示于图3。

·性状：黄色粉末

·HR-ESI-MS(positive)m/z：465.1983[M+Na]⁺

·紫外吸收光谱：λmax(MeOH)nm(logε)：193.6(3.73)，211.6(4.32)，269.2(3.97)

·红外吸收光谱(KBr、cm-¹)：νmax：3393.18，2933.52，1731.29，1587.20，1506.71，1464.86，1421.12，1388.81，1336.38，1243.07，1158.97，1129.16，1070.11，625.20，609.78，595.24，581.17，566.35，536.59，523.24

高分辨质谱分析(图1)的结果是，准分子离子峰为m/z 465.1983[M+Na]⁺，因此推定组成式为C₂₁H₃₀O₁₀，不饱和度为7。另外，根据紫外吸收光谱(图2)，在211nm及269nm具有最大吸收，因此提示了Ceratonia siliqua B为苯丙素类化合物的可能性。另外，根据红外吸收光谱(图3)，显示在分子结构中包含羟基(3393.18cm^-1)、苯环(1587.20cm^-1、1506.71cm^-1)及酯键(1731.29cm^-1、1129.16cm^-1)等官能团。

进而，根据由¹H-NMR分析(溶剂：CD₃OD，观察频率：600MHz)所获得的谱(图4)，确认到：1组1,3,4,5-取代苯环氢信号[δ_H：6.76(2H，s，H-2，H-6)]、1组反式烯烃质子信号[δ_H：6.61(1H，d，J＝16.2Hz，H-7)，6.30(1H，dt，J＝15.6Hz，J＝6.0Hz，H-8)]、1个亚甲基氢信号[δ_H：4.71(2H，d，J＝6.0Hz，H-9)]、2个甲氧基信号[δ_H：3.86(6H，s，OCH₃-3，OCH₃-5)]、1个次甲基信号[δ_H：2.60(1H，m，H-2′)]、2个甲基信号[δ_H：1.18(6H，d，J＝7.2Hz，H₃-1′/H₃-4′)]、1组葡萄糖残基的氢信号[δ_H：4.89(1H，d，J＝7.8Hz，H-1")，3.78(1H，dd，J＝12.0Hz，J＝2.4Hz，H-6α")，3.67(1H，dd，J＝12.0Hz，J＝5.4Hz，H-6β")，3.48(1H，m，H-2")，3.43(1H，m，H-3")，3.42(1H，m，H-4")，3.22(1H，m，H-5")](图8)。另外，根据由¹³C-NMR分析(溶剂：CD₃OD，观察频率：150MHz)所获得的谱(图5)，确认有21个碳信号(图8)。其中包括：1个酯的羰基碳信号(δ_C：178.5)、8个芳香族或烯烃的碳信号(δ_C：154.3×2，136.2，134.8，134.5，124.4，105.6×2)、1个亚甲基信号(δ_C：66.0)、2个甲氧基信号(δ_C：57.0×2)、1个次甲基信号(δ_C：35.2)、2个甲基信号(δ_C：19.3×2)、1组葡萄糖残基的碳信号(δ_C：105.2，78.3，77.8，75.7，71.3，62.5)。根据这些解析结果可知，本化合物的NMR数据与紫丁香苷(Syringin)类似，但本化合物中还包含2-甲基丙酸单元，就该方面而言，本化合物是与紫丁香苷不同的化合物。

另外，根据由HMBC分析所获得的谱(图7)，确认有：H-2/H-6与C-4、H-7与C-2/C-6、H-8与C-1、H-9与C-7及H-1”与C-4的远程相关信号。根据该结果，显示本化合物的结构中存在紫丁香苷单元。另外，由于H₃-1′与C-3′/C-4′、H-2′与C-3′/C-4′确认有远程相关信号，因此显示本化合物的结构中存在2-甲基丙酸单元。进而，由于H₂-9与C-3′确认有远程相关信号，因此显示2-甲基丙酸单元键合于C-9位。可知，葡萄糖末端的质子的偶合常数为7.8Hz，葡萄糖的末端的相对配置为β型。根据这些解析结果，确定本化合物Ceratonia siliqua B的结构如以下式(I)所示。

图8示出基于HSQC谱及HMBC谱分析的汇总有¹H-NMR的δ_H及¹³C-NMR的δ_C的归属表。另外，图9示出Ceratonia siliqua B的HMBC的解析结果。

[化学式3]

[实施例4]

4.Ceratonia siliqua B的抗氧化活性(1)

使用实施例2中所获得的Ceratonia siliqua B，测定Ceratonia siliqua B的DPPH自由基消除活性。

首先，正确地称取实施例2中所获得的Ceratonia siliqua B，使其溶解于甲醇中，制备浓度100μM的样品液。进一步用甲醇稀释该浓度100μM的样品液，获得1μM、5μM、10μM及50μM的不同浓度的样品液。接下来，使2mg的DPPH(2,2-二苯基-1-苦味肼)溶解于50mL的甲醇中，制备100μM的DPPH溶液。

在96孔样品板的孔中放入190μL的DPPH溶液，迅速添加样品液10μL。孔内的反应液的总量为200μL。缓慢振荡样品板，在暗室中、室温下反应30分钟。其后，通过酶标仪测定517nm中的吸光度(A_样品)。另外，作为空白样品，使用添加有甲醇的反应液代替样品液，测定空白样品的吸光度(A_空白样品)。进而，作为样品空白，测定各浓度的样品液原本的着色的吸光度(A_样品空白)。对于各浓度的样品液、空白样品及样品空白，各进行3次(3孔)试验(n＝3)。

自由基消除率(％)通过以下式求出。

自由基消除率(％)＝[A_空白样品－(A_样品－A_样品空白)]/A_空白样品×100

A_空白样品为空白样品的吸光度，A_样品为样品液的吸光度，A_样品空白为样品空白的吸光度。

将结果示于图10。其显示本发明的化合物Ceratonia siliqua B浓度依赖性地消除DPPH自由基。由此可知Ceratonia siliqua B具有自由基消除活性、即抗氧化活性。

[实施例5]

5.Ceratonia siliqua B的抗氧化活性(2)

使用实施例2中所获得的Ceratonia siliqua B，对Ceratonia si liqua B对活细胞中的活性氧物种(Reactive Oxygen Species：ROS)的生成所造成的影响进行考察。

(a)活细胞及其细胞培养条件

本试验中，使用源自人类肝脏的肿瘤细胞株HepG2细胞作为活细胞。HepG2细胞用DMEM培养基(包含10％FBS、100U/mL的青霉素及100μM/mL链霉素)，在37℃、存在5％CO₂、饱和湿度的条件下培养。

(b)样品液的制备

用DMEM培养基稀释Ceratonia siliqua B，获得1μM、5μM、10μM、50μM及100μM的不同浓度的样品液。

(c)对HepG2细胞的细胞毒性的研究

首先，通过MTT试验，确认Ceratonia siliqua B对HepG2细胞有无细胞毒性。对3代以上继代培养的HepG2细胞进行胰蛋白酶处理，制备浓度1×105个/mL的单细胞的悬浊液。将该细胞悬浊液以每孔100μL接种于96孔样品板的各孔中，通过CO₂培养箱培养24小时。培养后，去除上清液，分成对照(空白对照)组及试验组，在对照群组中添加200μL的DMEM培养基，在试验组中分别以每孔200μL添加上述(b)的样品液。通过CO₂培养箱培养48小时后，去除上清液，以每孔100μL添加0.5mg/mL的MTT。4小时后，去除上清液，以每孔150μL添加DMSO，通过酶标仪测定570nm下的吸光度。对于对照组、试验组中的各浓度的样品液，各进行3次(3孔)试验(n＝3)。

将结果示于图11。将对照(空白对照)组的值设为100，算出试验组的细胞存活率。可知，在1～100μM的浓度下，作为本发明的化合物的Ceratonia siliqua B不具有对HepG2细胞的细胞毒性。

(d)HepG2细胞中的ROS的测定

制备1×105个/mL的浓度的HepG2细胞悬浊液，将该细胞悬浊液以每孔100μL接种于96孔样品板的各孔中，通过CO₂培养箱培养24小时。将其分为空白对照组、阳性对照组及试验组，在空白对照组中添加100μL的DMEM培养基，在阳性对照组中添加100μL的使L-抗坏血酸溶解于DMEM培养基中所得的溶液(L-抗坏血酸的最终浓度：100μM)，在试验组中以成为不同浓度(最终浓度：1μM、5μM、10μM、50μM及100μM)的方式以每孔100μL添加通过DMEM培养基适当稀释的Ceratonia siliqua B所得的溶液。通过CO₂培养箱培养24小时后，从各孔去除培养液，加入100μL的无血清培养基并清洗，将如上操作反复进行3次。接下来，将10μM的DCFH-DA(2′,7′-二氯萤光素二乙酸酯)以每孔100μL加入各孔中，通过CO₂培养箱培养60分钟后，从各孔去除DCFH-DA，加入100μL的无血清培养基并清洗，将如上操作反复进行3次。最后，将经无血清培养基稀释的400μM的过氧化氢(H2O2)以每孔100μL添加至各孔中，培养90分钟。其后，去除孔内的培养基，加入100μL的PBS，以激发波长485nm测定535nm处的萤光强度。将空白对照组的萤光强度设为1.0(基底)，算出阳性对照组及试验组的RO S生成量。对于空白对照组、阳性对照组及试验组中的各浓度的样品液，各进行3次(3孔)试验(n＝3)。

将结果示于图12。Vit.C表示作为阳性对照的100μM的L-抗坏血酸。显示出作为本发明的化合物的Ceratonia siliqua B浓度依赖性地抑制HepG2细胞中由过氧化氢所诱发的ROS的增加。由此可知Ceratonia siliqua B具有减少活细胞中的ROS的生成量的抗氧化活性。

[实施例6]

6.Ceratonia siliqua B的黑色素生成抑制效果

使用实施例2中所获得的Ceratonia siliqua B，对Ceratonia si liqua B的黑色素生成抑制效果进行考察。

(a)细胞培养条件

本试验中，使用B16黑色素瘤细胞。B 16黑色素瘤细胞是源自小鼠皮肤的黑色肿瘤的细胞株，具有黑色素生成能力。B 16黑色素瘤细胞用DMEM培养基(包含10％FBS、100U/mL的青霉素及100μM/mL链霉素)在37℃、5％CO₂存在下、饱和湿度的条件下培养。

(b)样品液的制备

(c)对B16黑色素瘤细胞的细胞毒性的研究

首先，通过MTT试验，确认Ceratonia siliqua B对B16黑色素瘤细胞有无细胞毒性。对3代以上继代培养的B16黑色素瘤细胞进行胰蛋白酶处理，制备浓度3×104个/mL的单细胞的悬浊液。将该细胞悬浊液以每孔100μL接种于96孔样品板的各孔中，通过CO₂培养箱培养整晚。从各孔去除上清液，分成对照(空白对照)组及试验组，在对照组中添加200μL的DMEM培养基，在试验组中分别以每孔200μL添加上述(b)的样品液。通过CO₂培养箱培养48小时后，去除上清液，以每孔100μL添加0.5mg/mL的MTT。4小时后，去除上清液，以每孔150μL添加DMSO，通过酶标仪测定570nm下的吸光度。对于对照组及试验组中的各浓度的样品液，各进行3次(3孔)试验(n＝3)。

将结果示于图13。将对照(空白对照)组的值设为100，算出试验组的细胞存活率。可知，在1～100μM的浓度下，作为本发明的化合物的Ceratonia siliqua B不具有对B16黑色素瘤细胞的细胞毒性。

(d)B16黑色素瘤细胞的黑色素生成量的测定

制备B16黑色素瘤细胞的单细胞的悬浊液，将4×10⁴个B16黑色素瘤细胞分别接种于12孔样品板的各孔中。通过CO₂培养箱培养整晚后，去除上清液，分成空白对照组、阳性对照组及试验组。在空白对照组中添加1mL的DMEM培养基，在阳性对照组中分别添加1mL的使L-抗坏血酸以不同浓度溶解于DMEM培养基中所得的溶液(L-抗坏血酸的浓度：0.1μM、5μM、10μM)，在试验组中，分别以每孔1mL添加上述(b)的样品液。培养48小时后，从各孔去除上清液，通过PBS缓冲液清洗2次后，进行胰蛋白酶处理，加入1.2mL的PBS缓冲液制备单细胞的悬浊液。分取该细胞悬浊液中的200μL，确定蛋白质含量。另外，对于剩余的细胞悬浊液，以3000rpm离心分离5分钟去除上清液后，加入250μL的包含1％DMSO的1M的NaOH溶液，通过增温至80℃的水浴使其溶解30分钟。取该溶解液200μL，测定405nm处的吸光度(A试验组、A_{阳性对照组}、A_{空白对照组})。对于空白对照组、阳性对照组及试验组中的各浓度的样品液，各进行3次(3孔)试验(n＝3)。

细胞内的黑色素的生成抑制率(％)通过以下式求出。

试验组的黑色素的生成抑制率(％)＝1－[(A_试验组/试验组的蛋白质含量)/(A_{空白对照组}/空白对照组的蛋白质含量)]。

阳性对照组的黑色素的生成抑制率(％)＝1－[(A_{阳性对照组}/阳性对照组的蛋白质含量)/(A_{空白对照组}/空白对照组的蛋白质含量)]。

此处，A_试验组为试验组的吸光度，A_{阳性对照组}为阳性对照组的吸光度，A_{空白对照组}为空白对照组的吸光度。

将结果示于以下表1。在作为阳性对照的L-抗坏血酸在浓度10μM显示出对黑色素生成具有显著的抑制效果(P＜0.01)，其抑制率为32.8％。另一方面，对于作为本发明的化合物的Ceratonia siliqu a B，在10～100μM的浓度下观察到对B16黑色素瘤细胞的黑色素生成具有显著的抑制效果(P＜0.05)。Ceratonia siliqua B的黑色素生成抑制效果与其浓度成比例地增加，在100μM的浓度下显示出超过30％的黑色素生成抑制效果。

[表1]

**：P＜0.01，*：P＜0.05

本发明并不限定于上述实施方式或实施例，在不脱离专利请求保护的范围中所记载的发明的主旨的范围内进行了各种设计变更的形态也包括在技术范围中。

产业上的可利用性

本发明的新颖苯丙素类化合物可用作美白剂、黑色素生成抑制剂、抗氧化剂、皮肤外用剂及化妆品，可广泛用于医疗、美容领域。

Claims

1.一种化合物或其盐或者它们的溶剂合物，该化合物由下述式(I)表示：

2.一种美白剂，其含有下述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂合物：

3.根据权利要求2所述的美白剂，其中，所述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂合物的浓度为0.001mM～1mM。

4.一种黑色素生成抑制剂，其含有下述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂合物：

5.一种抗氧化剂，其含有下述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂合物：

6.根据权利要求2至5中任一项所述的剂，其为皮肤外用剂。

7.根据权利要求2至5中任一项所述的剂，其为化妆品。

8.一种皮肤美白用饮食品组合物，其含有下述式(I)所表示的化合物或其盐或者它们的溶剂合物：

9.一种化合物的制造方法，其特征在于，具有以下工序：

获得长角豆即Ceratonia siliqua的荚果的含水醇萃取物的工序；

按照石油醚、乙酸乙酯的顺序对所述含水醇萃取物进行液液萃取，回收乙酸乙酯级份的工序；及

从所述乙酸乙酯级份中分离下述式(I)所表示的化合物的工序：