CN117512079A - 一种游离核酸的检测方法、引物探针组合物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本说明书实施例提供一种游离核酸的检测方法,该方法包括:(a)对样本进行预处理,获取DNA样本;预处理包括从样本中第一次富集DNA;(b)对DNA样本进行多重PCR扩增;其中多重PCR扩增包括:基于预扩增引物,对DNA样本进行预扩增,得到预扩增产物;从预扩增产物中第二次富集DNA;对第二次富集的DNA进行多重PCR扩增。
Description
技术领域
本说明书涉及生物医学领域,特别涉及一种游离核酸的检测方法、引物探针组合物及试剂盒。
背景技术
对胎儿游离核酸进行检测是一种目前较为便捷的产前检测方法,能够检测出胎儿染色体是否异常。染色体异常的新生儿表现为中到重度智力低下、体格发育异常且常携带多系统并发症。目前临床上常用的胎儿游离核酸检测手段主要包括羊水穿刺、绒毛活检、血清学筛查等,但上述检测方法存在耗时长、技术门槛高、检测费用贵等问题,且其结果可能会产生假阳性或假阴性。因此,亟需一种准确、快速、成本低的游离核酸的检测方法。
发明内容
本说明书一个或多个实施例提供一种游离核酸的检测方法。所述方法包括:(a)对样本进行预处理,获取DNA样本;所述预处理包括从所述样本中第一次富集DNA;(b)对所述DNA样本进行多重PCR扩增;其中,所述多重PCR扩增包括:基于预扩增引物,对所述DNA样本进行预扩增,得到预扩增产物;从所述预扩增产物中第二次富集DNA;对第二次富集的DNA进行多重PCR扩增。
在一些实施例中,所述样本包括含有胎儿游离核酸的妊娠对象的外周血样本。
在一些实施例中,从所述样本中第一次富集DNA包括:从所述样本中分离去除细胞,并从去除细胞后的所述样本中第一次富集DNA。
在一些实施例中,所述预扩增引物的上游引物序列如SEQ ID No.25-32所示,所述预扩增引物的下游引物序列如SEQ ID No.33-40所示。
在一些实施例中,所述方法还包括:选择所述目标染色体和所述参考染色体的靶向区域;其中,所述目标染色体是21号染色体;所述参考染色体是1号染色体。
在一些实施例中,所述对第二次富集的DNA进行多重PCR扩增,包括:基于第一扩增引物、第二扩增引物和探针,对第二次富集的DNA进行多重PCR扩增;其中,所述第一扩增引物的引物序列如SEQ ID No.1-8所示,所述第二扩增引物的引物序列如SEQ ID No.9-16所示,所述探针的探针序列如SEQ ID No.17-24所示;所述第一扩增引物、第二扩增引物和探针被配置为扩增目标染色体的靶向区域以及参考染色体的靶向区域。
在一些实施例中,所述第一次富集DNA包括:采用磁珠法定向筛选回收所述样本中的80bp-150bp的DNA片段,其中,磁珠与所述样本的体积比为(3.5±5%):1。所述第二次富集DNA包括,采用磁珠法定向筛选回收所述预扩增产物中大于100bp的DNA片段,其中,磁珠与所述预扩增产物的体积比为(0.9±5%):1。
本说明书一个或多个实施例提供一种用于游离核酸检测方法的引物探针组合物,其特征在于,所述引物探针组合物包括所述预扩增引物、所述第一扩增引物、所述第二扩增引物以及所述探针;所述第一扩增引物的引物序列如SEQ ID No.1-8所示,所述第二扩增引物的引物序列如SEQ ID No.9-16所示,所述探针的探针序列如SEQ ID No.17-24所示;所述预扩增引物序列的上游引物的序列如SEQ ID No.25-32所示,所述预扩增引物下游引物的序列如SEQ ID No.33-40所示。
在一些实施例中,所述引物探针组合物用于制备检测21-三体综合征的试剂或试剂盒。
本说明书一个或多个实施例提供一种试剂盒,所述试剂盒中包括如上所述的引物探针组合物。
附图说明
本说明书将以示例性实施例的方式进一步说明,这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的,在这些实施例中,相同的编号表示相同的结构,其中:
图1是根据本说明书一些实施例所示的一种游离核酸检测方法的示例性流程图;
图2是根据本说明书一些实施例所示检测方法在思纳福平台上的检测结果示意图;
图3是根据本说明书一些实施例所示检测方法在BioRad伯乐平台上的检测结果示意图;
图4是根据本说明书一些实施例所示检测方法在QIAGEN平台上的检测结果示意图;
图5是根据本说明书一些实施例所示检测方法在LIFE平台数据上的检测结果示意图;
图6是根据本说明书一些实施例所示检测方法在新奕平台上的检测结果示意图;
图7是根据本说明书一些实施例所示检测方法在小海龟平台上的检测结果示意图;
图8是根据本说明书一些实施例所示检测方法在永诺平台上的检测结果示意图;
图9是根据本说明书一些实施例所示的检测第一Jordan指数图;
图10是根据本说明书一些实施例所示的检测第二Jordan指数图;
图11是根据本说明书一些实施例所示的检测第三Jordan指数图;
图12a是根据本说明书一些实施例所示的样本来源及其结果证明的第一部分临床效果图;
图12b是根据本说明书一些实施例所示的样本来源及其结果证明的第二部分临床效果图;
图12c是根据本说明书一些实施例所示的样本来源及其结果证明的第三部分临床效果图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本说明书实施例的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本说明书的一些示例或实施例,对于本领域的普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明,图中相同标号代表相同结构或操作。
应当理解,本文使用的“系统”、“装置”、“单元”和/或“模块”是用于区分不同级别的不同组件、元件、部件、部分或装配的一种方法。然而,如果其他词语可实现相同的目的,则可通过其他表达来替换所述词语。
如本说明书和权利要求书中所示,除非上下文明确提示例外情形,“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数,也可包括复数。一般说来,术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素,而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列,方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
本说明书中使用了流程图用来说明根据本说明书的实施例的系统所执行的操作。应当理解的是,前面或后面操作不一定按照顺序来精确地执行。相反,可以按照倒序或同时处理各个步骤。同时,也可以将其他操作添加到这些过程中,或从这些过程移除某一步或数步操作。
21-三体综合征即唐氏综合征,是迄今为止最常见的染色体病,也是最常见的导致轻度至中度智力障碍的遗传性疾病。临床上常用的游离核酸的检测技术主要包括:羊水穿刺(AC)、绒毛活检(CVS)、血清学筛查、核型分析、无创产前筛查(NIPT)、胎盘组织DNA微阵列芯片等技术,但以上检测方法存在对孕妇有创伤性、准确度低、耗时长、检测成本高等问题。
对包括含有胎儿游离核酸的妊娠对象的外周血样本进行检测是一种目前较为便捷的产前检测方法,但是现有技术中的检测方法,例如定量聚合酶链式反应(qPCR)、高通量测序等技术,需要若干个工作日出检测报告、技术门槛高、检测费用贵,且其结果可能会产生假阳性或假阴性。因此,开发准确、可靠、快速和低成本的胎儿游离核酸的检测方法非常必要。
如本文所用,“游离核酸”指的是循环血中游离于细胞外的内源性DNA,也称作“循环DNA”、“cfDNA”或“cffDNA”。
如本文所用,“血浆游离核酸”或“孕妇血浆游离核酸”是指来自于孕妇(妊娠对象)血浆中的cfDNA,是一种母体DNA和胎儿DNA分子的混合物。其中,胎儿DNA来自于胎儿细胞、胎盘组织或细胞降解,释放到母体循环中,与母体DNA共存于妊娠对象的外周血样本中。因此,能够从妊娠对象的外周血样本中检测胎儿游离核酸,从而确定染色体是否异常。
本说明书实施例提供了一种游离核酸的检测方法,通过对样本进行预处理,提高了外周血样本中游离核酸的提取效率;通过靶向区域选择和引物探针设计,提高了检测的准确性;通过样本预扩增及纯化,有效增加DNA样本中胎儿游离核酸的浓度,克服了母体cfDNA中胎儿游离核酸浓度较低的问题。
图1是根据本说明书一些实施例所示的一种游离核酸的检测方法示例性流程图,如图1所示,流程100包括下述步骤。
步骤110,对样本进行预处理,获取DNA样本;预处理包括从样本中第一次富集DNA。
如本文所用,“样本”是指用于进行科学研究或实验室测试等非治疗非诊断目的所采集的生物样本。例如,样本可以包括来妊娠对象的细胞、组织、血液、尿液、唾液等。
如本文所用,“DNA样本”是指经过预处理后的样本。预处理可以包括对样本进行细胞裂解、采用DNA提取试剂提取DNA等。
在一些实施例中,样本包括含有胎儿游离核酸的妊娠对象的外周血样本,DNA样本可以包括从外周血样本中提取的游离核酸。
游离核酸可以单链或双链DNA的形式存在,大多数游离核酸是以核蛋白形式存在的双链DNA。游离核酸的片段较小,长度一般在几十到几百个bp之间。
孕妇血浆游离核酸存在以下特点:(1)孕妇血浆中的游离核酸通常相对较少,因为它被稀释在母体循环系统中。这意味着要从孕妇血浆中的游离DNA中检测到胎儿DNA可能会面临挑战,因为其浓度相对较低;(2)孕妇血浆中的游离DNA来自母体和胎儿,而且胎儿DNA只占其中的一小部分。这种多样性使得区分胎儿DNA变得更为复杂。相对于母体DNA,胎儿DNA在孕妇血浆中的丰度相对较低。本说明书实施例为了有效地进行胎儿DNA的检测和分析,通过从样本中第一次富集DNA,对样本进行预处理,获取DNA样本。
在一些实施例中,从外周血样本中第一次富集DNA包括:从样本中分离去除细胞,并从去除细胞后的样本中第一次富集DNA,得到DNA样本。本文对于分离去除细胞的具体方式不做限制。例如,可以通过将外周血样本经过离心分层从样本中分离和去除红细胞。
在一些实施例中,从外周血样本中第一次富集DNA还可以包括从样本中分离去除血浆蛋白。本文对于分离去除血浆蛋白的具体方式不做限制。例如,可以通过添加蛋白酶(例如蛋白酶K)到样本中,以消化血浆蛋白。
在一些实施例中,第一次富集DNA包括:采用磁珠法定向筛选回收样本中的80bp-150bp的DNA片段,其中,磁珠与样本的体积比为(3.5±5%):1。
在一些实施例中,第一次富集DNA进一步包括将样本溶解在包含聚乙二醇(PEG)和氯化钠的溶液中,用磁珠吸附样本溶液中的DNA片段。
在一些实施例中,为降低母体cfDNA的影响,采用磁珠吸附技术,利用不同长度DNA片段在不同PEG浓度下的溶解度差异,定向筛选回收样本中大小为80bp-150bp的DNA片段。在一些实施例中,磁珠优选为顺性磁珠,例如贝克曼SPRI Based Size Selection商品化磁珠。
磁珠回收DNA的原理是利用磁珠表面的官能团与DNA表面的磷酸基团结合,从而将DNA吸附到磁珠上。不同功能的磁珠,偶联的官能团不同。例如,纯化核酸用的磁珠表面的功能基团可以包括羧基(-COOH)。在一些实施例中,第一次富集DNA中,样本溶液中的PEG可以增加溶液的粘稠度,让磁珠保持悬浮不容易沉聚,使得磁珠在吸附DNA片段的过程中更充分地与DNA接触,同时减少蛋白变性和非特异性吸附。在一些实施例中,通过改变样本溶液的盐浓度,可以调控磁珠与DNA片段之间的结合力,从而实现磁珠对不同大小的DNA片段的选择性结合。
本说明书的一些实施例中,胎儿的游离DNA在其母体cfDNA中的比例仅为5%-20%,为解决胎儿游离DNA浓度过低,导致出现假阳性、漏检等问题,采用磁珠富集DNA的方式有效提高了DNA样本浓度。
步骤120,对DNA样本进行多重PCR扩增;其中,多重PCR扩增包括:基于预扩增引物,对DNA样本进行预扩增,得到预扩增产物;从预扩增产物中第二次富集DNA;对第二次富集的DNA进行多重PCR扩增。
在一些实施例中,第二次富集DNA包括,采用磁珠法定向筛选回收预扩增产物中大于100bp的DNA片段,其中,磁珠与预扩增产物的体积比为(0.9±5%):1。
在一些实施例中,预扩增引物的上游引物序列如SEQ ID No.25-32所示,预扩增引物的下游引物序列如SEQ ID No.33-40所示。
本说明书实施例在对DNA样本进行扩增之前,针对目标染色体设计出预扩增引物,实现了对胎儿游离DNA的预扩增,可以有效增加检测的灵敏度和特异性。
在一些实施例中,对DNA样本进行多重PCR扩增前,还包括选择目标染色体和参考染色体的靶向区域。
目标染色体是指需要进行研究或检测的染色体。例如,在进行非侵入性产前检测时,胎儿的染色体可能是目标染色体,以检测胎儿的染色体是否异常。在一些实施例中,目标染色体是21号染色体。
参考染色体是指用于检测目标染色体是否异常的对照染色体。例如,参考染色体可以是一个正常的、健康的染色体,作为检测目标染色体是否正常的对照标准。在一些实施例中,可以将人类的正常染色体集合或特定的参考基因组序列作为参考染色体。在一些实施例中,参考染色体是1号染色体。
在一些实施例中,参考染色体可以通过多种方式确定。例如,可以通过对正常个体进行染色体分析来获得参考染色体。
在一些实施例中,参考染色体可以根据参考染色体与21号染色体的扩增拷贝数比值的CV值确定。例如,若某条染色体在一定数量的阴性群体中与21号染色体的扩增拷贝数比值的CV值低于预设阈值(例如,10%),则将该染色体确定为参考染色体。
CV值也称作变异系数,是用来衡量数据变异程度的统计指标。
染色体的扩增拷贝数比值的CV值是该染色体的变异程度的一个度量。可以通过计算样本标准差与样本平均值之比来表示CV值。如果某染色体与目标染色体的扩增拷贝数比值的CV值低于预设阈值,即表示在一定数量的阴性群体中该染色体的变异相对较小,那么就被认为该染色体是相对稳定的,变异水平相对较小,因此可以作为标准或对照,即可以被作为参考染色体。
扩增拷贝数比值(Amplification Copy Number Ratio,ACNR)是判断基因组拷贝数变异的指标之一。它通过比较目标基因组在整个基因组中的拷贝数比例,来评估目标基因组的扩增或缺失情况。
扩增拷贝数比值的正常参考范围因物种、组织类型和检测方法不同而异。一般情况下,人类基因组的扩增拷贝数比值在0.8-1.2之间被认为是正常的。如果扩增拷贝数比值超出正常范围,则可能指示着基因组拷贝数变异的情况,进而影响基因表达和表型特征。
扩增拷贝数比值通常采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-TimePCR,qRT-PCR)或测序等方法进行确定。在qRT-PCR方法中,通过比较目标基因组与参照基因组的Ct值(Cycle threshold),可以计算出目标基因组的扩增拷贝数比值。在测序方法中,通过比较目标基因组与参考基因组的覆盖深度差异,可以计算出目标基因组的扩增拷贝数比值。
在一些实施例中,目标染色体的靶向区域选择:1p34.3、HR-DSCR、21q11.2和21q22;目标染色体的靶向区域不选择:21q21.1-21q21.2。
在一些实施例中,对第二次富集的DNA进行多重PCR扩增,包括:基于第一扩增引物、第二扩增引物和探针,对第二次富集的DNA进行多重PCR扩增。
在一些实施例中,第一扩增引物的引物序列如SEQ ID No.1-8所示,第二扩增引物的引物序列如SEQ ID No.9-16所示,探针的探针序列如SEQ ID No.17-24所示。第一扩增引物、第二扩增引物和探针被配置为扩增目标染色体的靶向区域以及参考染色体的靶向区域。
本说明书实施例提供一种用于如上述的检测方法引物探针组合物,引物探针组合物包括预扩增引物、第一扩增引物、第二扩增引物以及探针。
在一些实施例中,第一扩增引物的引物序列如SEQ ID No.1-8所示,第二扩增引物的引物序列如SEQ ID No.9-16所示,探针的探针序列如SEQ ID No.17-24所示;预扩增引物序列的上游引物的序列如SEQ ID No.25-32所示,预扩增引物下游引物的序列如SEQ IDNo.33-40所示。
在一些实施例中,引物探针组合物用于制备检测21-三体综合征的试剂或试剂盒。
本说明书实施例还提供一种试剂盒,试剂盒中包括上述引物探针组合物。
在一些实施例中,上述试剂盒具有高度特异性、灵敏性,可以用于临床研究,为临床医生提供迅速、准确的唐氏综合症诊断。
实施例
以下实施例是对与上述一些实施例相关的实施例的一些更具体的说明。这些实施例中的部分内容也可以与其他实施例中的相应内容替换或组合,从而形成新的实施例。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。应当理解,以下实施例是为了更好地解释本发明,并不旨在限制本发明。
实施例1:确定目标染色体的靶向区域及其引物、探针
目前临床上针对唐氏综合征(21-三体综合征)常见检测区域易发生微缺失的变异(存在1.6Mb-5Mb的缺失),故本说明书实施例对21号染色体进行分区段靶向检测,优选3段靶向区域:HR-DSCR、21q11.2以及21q22。
21q11.2是指21号染色体,长臂1区2带。
21q22是指21号染色体,长臂2区2带。
HR-DSCR包含一些与唐氏综合征特有的表型特征相关的基因。
确定靶向区域后,对各个靶向区域设计各自相应的引物和探针。设计的引物对退火温度通常在58℃-62℃,引物之间互不干扰,避免二级结构的产生。同时对扩增区设计Taqman探针,所有目标染色体上3个靶向区域的Taqman探针分别用荧光染料FAM、HEX(VIC)、Cy5在5’末端进行标记,3’末端标记萃灭基团MGB。另外,参考染色体(1号染色体)按照上述原则设计引物和配套的探针,探针用荧光染料ROX在5’末端进行标记,3’末端标记萃灭基团MGB。
实施例2:确定目标染色体的参考染色体及其靶向区域、引物和探针
人血浆中各条染色体的含量并不具有均一性。正常情况下,人类每个细胞核内都含有23对染色体(共46条),但在某些疾病或异常情况下,染色体数目可能会发生变异。此外,在不同的细胞类型和个体之间,染色体含量也有所差异。因此,血浆中各条染色体的含量并不总是相同的。
现针对21号染色体(目标染色体)异常检测,需从阴性群体样本中,根据所选的参考染色体与21号染色体的扩增拷贝数比值的CV值,确定参考染色体。
具体地,阴性群体样本为核型分析无染色体异常且孕周大于等于12周的孕妇外周血样本。
针对人类23条染色体保守区域(即在不同个体中保持相似序列的染色体区域)中的靶向区域,特异性地各设计合成2组扩增引物探针组。
对各个阴性样本,比较21号染色体以外的其余22条染色体与21号染色体的扩增拷贝数比值的CV值,将在整个阴性样本群体中的CV值小于10%的染色体作为参考染色体。最终,针对21号染色体异常检测,优选1号染色体为参考染色体。1号染色体优选1p34.3为靶向区域。
表1中示出了实施例1中确定的目标染色体的靶向区域及其引物、探针,以及实施例2中确定是参考染色体的靶向区域、引物和探针。
表1靶向区域及其引物探针组
实施例3:提高母体cfDNA中胎儿游离DNA浓度的方法及其应用
1.样本预处理(第一次富集DNA)。
外周血样本来源于10-20轴孕龄妇女,采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆cfDNA提取试剂盒(DP709),提取孕妇外周血血浆游离DNA。
为解决孕妇cfDNA中胎儿游离DNA浓度太低的问题,优选贝克曼SPRI Based SizeSelection商品化磁珠,利用不同长度DNA片段的在不同PEG浓度下的溶解度差异,定向筛选回收80bp-150bp的DNA片段。优选地,磁珠与DNA溶液体积比为3.5:1。
分选步骤
1)取至少50ul cfDNA(体积不够水补足)至离心管中,加入0.9x分选磁珠(x代表cfDNA的体积),涡旋震荡混匀,室温静置5min,瞬时离心,置于磁力架上5min;
2)吸取离心后的上清核酸溶液至新的离心管中,加入1.1x分选磁珠,涡旋震荡混匀,室温静置5min,瞬时离心,置于磁力架上5min;
3)弃2)中离心后的上清液,磁珠用85%乙醇清洗2次,清洗过程如下:
a.取200μL 85%乙醇加入3)中磁珠中,静置30s,弃乙醇;
b.重复步骤a,取200μL 85%乙醇,静置30s,弃乙醇;
c.将离心管瞬时离心后置于磁力架上,吸取剩余乙醇残液;
d.室温干燥磁珠;
4)向3)中获取的干燥磁珠中加入至少20μL水,涡旋混匀,室温静置5min,瞬离后置于磁力架上5min,吸取上清即获得小于150bp的DNA片段溶液,可先于-80℃保存。另外,为提高胎儿游离DNA检测浓度,根据靶向区域引物,设计合成预扩增引物。选择的靶向区域以及预扩增引物组如表2所示。
表2选择的靶向区域以及预扩增引物组
2.样本预扩增。
预扩增体系:第一次富集的样本DNA(小于150bp的DNA片段溶液)2ng;各预扩增引物反应体系终浓度:50nM;Digital PCR Master Mix(4×)5μL;ddH2O补足至20μL。
预扩增程序如下:
3.预扩增产物纯化(第二次富集DNA)。
预扩增后,需去除多余的含接头序列的寡核酸链及低质量的扩增不完全的扩增子。优选贝克曼SPRI Based Size Selection商品化磁珠,利用不同PEG浓度下,不同长度DNA片段的溶解度差异,优选筛选比例为磁珠与DNA溶液体积比为0.9:1,用以回收纯化大于100bp的预扩增产物,根据磁珠使用说明书,最终获得大于100bp的预扩增产物DNA片段溶液,可先于-80℃保存。
4.样本检测(多重PCR扩增)。
多重PCR(multiplex PCR)又称多重引物PCR或复合PCR,它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。一般PCR仅应用一对引物,通过PCR扩增产生一个核酸片段,主要用于单一致病因子等的鉴定。应用多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定某些病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定。
扩增体系:预扩增产物纯化DNA 2~5μL;各检测用引物探针反应体系终浓度:150nM;Digital PCR Maste rMix(4×)10μL;ddH2O补足至40μL。
扩增程序如下:
5.结果显示。
5.1.预扩增与未预扩增结果对比。
为提高检测灵敏度以及准确性,对血浆cfDNA这类低浓度样本进行预扩增。实验设计未预扩增组跟预扩增组各做8个重复,相比于未预扩增组,预扩增组中阳性扩增子数量显著提高,CI(95%)以及CV值也显著下降,指示检测数据结果更接近真实值。
21号染色体靶向区域检测对比结果如表3所示:
表3预扩增与未预扩增检测结果对比
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特别地,以上数据中Cy5通道仅涉及1组检测引物探针组(即仅包含如SEQ IDNo.31所示的上游引物和如
SEQ ID No.39所示的下游引物),目的是与其他两通道各包含2组检测引物探针组(即既包含如SEQ ID No.31所示的上游引物和如SEQ ID No.39所示的下游引物,又包含扩增引物如SEQ ID No.32所示的上游引物和如SEQ ID No.40所示的下游引物)做扩增拷贝数对比,以确认其即使在减少检测引物探针组后,在预扩增的作用下,检测引物探针组样本扩增拷贝数仍呈线性增加趋势。
Cy5通道:CY5通道是基于激发荧光基团CY5实现荧光成像和检测的特定通道。
5.2.检测体系可实现国内外各平台转换。
本说明书实施例中的多重PCR检测体系可在国内外各数字PCR平台应用(既包含液滴式数字PCR,也包含芯片式数字PCR),均可清晰地区分样本阴阳性区间。以下是采用同一检测体系,在国内外7家数字PCR平台(思纳福、BioRad伯乐、QIAGEN凯杰、LIFE赛默飞、新奕、小海龟、永诺)检测的部分结果示意图如图2-图8所示(灰黑色散点为阴性群,彩色散点为阳性群,其中,图5中黄色散点为阴性群,其他彩色散点为阳性群)。
检测结果解读
检测结果的解读,依赖于检测结果判别方法,已知目标染色体21号染色体靶向区域荧光通道为:FAM、HEX(VIC)、Cy5,参考染色体检测荧光通道为:ROX。通过计算待测样本FAM/ROX、HEX/ROX、Cy5/ROX扩增拷贝数比值,以及阴性样本参考群体(>200例核型分析无染色体异常且孕周大于等于12周的孕妇血浆样本)FAM/ROX、HEX/ROX、Cy5/ROX各扩增拷贝数比值的平均值跟标准差,计算各通道的Z值。最终获得阴性样本库FAM/ROX扩增拷贝数比值的平均值跟标准差为:1.10153893、0.0617998;HEX/ROX扩增拷贝数比值的平均值跟标准差为:1.03906979533、0.051737771;Cy5/ROX扩增拷贝数比值的平均值跟标准差为:0.994194、0.072167791。
Z值的cutoff值是指将一个统计样本分为两个区域的分界点,这个分界点的确定需要考虑多种因素,包括样本特性、显著性水平、分布形态等。通常,我们将Z值定义为在双尾检验中,将显著性水平(例如0.05)分成两个相等部分的直线横坐标。在Z检验中,我们根据Z值正负号决定在哪一侧进行检验,而Z值的大小则反映了样本与假设之间的距离。
对于Z值的cutoff值(共有3个临界值需要确定)的确定,需要通过>200例临床样本(有阴性也有阳性样本其临床21-三体金标准检测已有明确阴、阳性结果),根据阴性样本参考群体FAM/ROX、HEX/ROX、Cy5/ROX各扩增拷贝数比值的平均值跟标准差,计算各临床样本各通道的Z值。以这些>200例临床样本各样本各通道计算出来的Z值,以及检测体系初步判定的阴性或阳性结果(Z值≥3为21-三体阳性高风险,Z值<3为21-三体阴性高风险;若为阳性则样本标记为1,若为阴性则样本标记为0),基于Jordan指数图确定各通道Z值的cutoff值。
在Jordan指数图中,Z值的cutoff值为Jordan指数曲线最高点的横坐标。
FAM/ROX,Z1-cutoff:3.299749596。
第一Jordan指数图如图9所示。
HEX/ROX,Z2-cutoff:3.047159044。
第二Jordan指数图如图10所示。
Cy5/ROX,Z3-cut off:2.438089767。
第三Jordan指数图如图11所示。
结果判别
根据阴性样本库FAM/ROX、HEX/ROX及Cy5/ROX扩增拷贝数比值的平均值跟标准差,计算待检测样本各通道FAM/ROX、HEX/ROX、Cy5/ROX扩增拷贝数比值对应的Z值,当Z1≥3.299749596或Z2≥3.047159044或Z3≥2.438089767,则该样本为21-三体阳性高风险;Z1<3.299749596且Z2<3.047159044且Z3<2.438089767,则该样本为21-三体阴性低风险。特别地,若检测样本,扩增后任一荧光通道拷贝数浓度低于100copies/μL,则该样本需重新抽样检测。
临床样本检测
由于各厂家仪器通道量不一,样本部分通道检测数据如下。(注:NIPT,即应用高通量测序进行的无创DNA产前检测技术)。
表4临床样本检测结果(检测结果为空的均为阴性)
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从上述表中可知,PCR结束后数据生成,根据Z值判别可知NIPS和NIPT结果一致为100%。且所述的测试时间均为不超过4个小时。
注:扩增时采用的是对应表1的靶向区域、检测用引物探针组的组合;预扩增时采用的是对应表2的靶向区域以及预扩增引物组的组合。
合作医院样本检测证明
参见图12a-12c,示出了采用本发明的试剂盒的(并未公开,仅供科研使用)测试结果。从图中可以得知本发明的试剂盒的NIPS和NIPT结果一致为100%。而且所述的测试时间均为不超过4个小时。
其中试剂盒中,扩增时采用的是对应表1的靶向区域、检测用引物探针组的组合;预扩增时采用的是对应表2的靶向区域以及预扩增引物组的组合。
本说明书实施例至少具有以下有益效果:
(1)通过提高母体中胎儿游离DNA的浓度,稳定血浆游离DNA中参考染色体的状态,确保了检测灵敏度,降低假阳性、漏检等风险。
(2)检测流程相较于依赖于测序法的无创产前检测,本发明检测周期,由5个工作日缩短至约4小时即可完成检测。
(3)相较于依赖于测序法的无创产前检测,本发明的成本大大降低,仅需前者的1/5。
(4)检测体系稳定,适用于国内外多个数字PCR平台,可实现多平台转换。
上文已对基本概念做了描述,显然,对于本领域技术人员来说,上述详细披露仅仅作为示例,而并不构成对本说明书的限定。虽然此处并没有明确说明,本领域技术人员可能会对本说明书进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本说明书中被建议,所以该类修改、改进、修正仍属于本说明书示范实施例的精神和范围。
同时,本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此,应强调并注意的是,本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外,本说明书的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。
此外,除非权利要求中明确说明,本说明书所述处理元素和序列的顺序、数字字母的使用、或其他名称的使用,并非用于限定本说明书流程和方法的顺序。尽管上述披露中通过各种示例讨论了一些目前认为有用的发明实施例,但应当理解的是,该类细节仅起到说明的目的,附加的权利要求并不仅限于披露的实施例,相反,权利要求旨在覆盖所有符合本说明书实施例实质和范围的修正和等价组合。例如,虽然以上所描述的系统组件可以通过硬件设备实现,但是也可以只通过软件的解决方案得以实现,如在现有的服务器或移动设备上安装所描述的系统。
同理,应当注意的是,为了简化本说明书披露的表述,从而帮助对一个或多个发明实施例的理解,前文对本说明书实施例的描述中,有时会将多种特征归并至一个实施例、附图或对其的描述中。但是,这种披露方法并不意味着本说明书对象所需要的特征比权利要求中提及的特征多。实际上,实施例的特征要少于上述披露的单个实施例的全部特征。
一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字,应当理解的是,此类用于实施例描述的数字,在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明,“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有±20%的变化。相应地,在一些实施例中,说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值,该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中,数值参数应考虑规定的有效数位并采用一般位数保留的方法。尽管本说明书一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值,在具体实施例中,此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。
针对本说明书引用的每个专利、专利申请、专利申请公开物和其他材料,如文章、书籍、说明书、出版物、文档等,特此将其全部内容并入本说明书作为参考。与本说明书内容不一致或产生冲突的申请历史文件除外,对本说明书权利要求最广范围有限制的文件(当前或之后附加于本说明书中的)也除外。需要说明的是,如果本说明书附属材料中的描述、定义、和/或术语的使用与本说明书所述内容有不一致或冲突的地方,以本说明书的描述、定义和/或术语的使用为准。
最后,应当理解的是,本说明书中所述实施例仅用以说明本说明书实施例的原则。其他的变形也可能属于本说明书的范围。因此,作为示例而非限制,本说明书实施例的替代配置可视为与本说明书的教导一致。相应地,本说明书的实施例不仅限于本说明书明确介绍和描述的实施例。
Claims (10)
1.一种游离核酸的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
(a)对样本进行预处理,获取DNA样本;所述预处理包括从所述样本中第一次富集DNA;
(b)对所述DNA样本进行多重PCR扩增;其中,
所述多重PCR扩增包括:
基于预扩增引物,对所述DNA样本进行预扩增,得到预扩增产物;
从所述预扩增产物中第二次富集DNA;
对第二次富集的DNA进行所述多重PCR扩增。
2.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述样本包括含有胎儿游离核酸的妊娠对象的外周血样本。
3.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述从所述样本中第一次富集DNA包括:
从所述样本中分离去除细胞,并从去除细胞后的所述样本中第一次富集DNA。
4.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述预扩增引物的上游引物序列如SEQID No.25-32所示,所述预扩增引物的下游引物序列如SEQ ID No.33-40所示。
5.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于,对所述DNA样本进行所述多重PCR扩增前,还包括:
选择目标染色体和参考染色体的靶向区域;
其中,所述目标染色体是21号染色体;所述参考染色体是1号染色体。
6.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述对第二次富集的DNA进行多重PCR扩增,包括:
基于第一扩增引物、第二扩增引物和探针,对第二次富集的DNA进行多重PCR扩增;其中,
所述第一扩增引物的引物序列如SEQ ID No.1-8所示,所述第二扩增引物的引物序列如SEQ ID No.9-16所示,所述探针的探针序列如SEQ ID No.17-24所示;
所述第一扩增引物、第二扩增引物和探针被配置为扩增目标染色体的靶向区域以及参考染色体的靶向区域。
7.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于,
所述第一次富集DNA包括:采用磁珠法定向筛选回收所述样本中的80bp-150bp的DNA片段,其中,磁珠与所述样本的体积比为(3.5±5%):1。
所述第二次富集DNA包括,采用磁珠法定向筛选回收所述预扩增产物中大于100bp的DNA片段,其中,磁珠与所述预扩增产物的体积比为(0.9±5%):1。
8.一种用于如权利要求1所述的检测方法引物探针组合物,其特征在于,
所述引物探针组合物包括所述预扩增引物、所述第一扩增引物、所述第二扩增引物以及所述探针;
所述第一扩增引物的引物序列如SEQ ID No.1-8所示,所述第二扩增引物的引物序列如SEQ ID No.9-16所示,所述探针的探针序列如SEQ ID No.17-24所示;
所述预扩增引物序列的上游引物的序列如SEQ ID No.25-32所示,所述预扩增引物下游引物的序列如SEQ ID No.33-40所示。
9.一种如权利要求8所述的引物探针组合物的用途,其特征在于,所述引物探针组合物用于制备检测21-三体综合征的试剂或试剂盒。
10.一种试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中包括如权利要求8所述的引物探针组合物。
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