CN117480992B - 一种绣球菌工厂化栽培新工艺 - Google Patents
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Abstract
一种绣球菌工厂化栽培新工艺，属于食用菌栽培技术领域。包括原基培养、出菇瓶/袋制作、原基移接、出菇管理，本发明采用创新的特定培养基及培养条件获得大量可用于移接出菇的原基，同时采用特定的栽培配方及条件获得已具有一定量菌丝的培养物，然后将原基移接到有菌丝的培养物中，经定植培养后进行出菇管理。本发明方法使绣球菌的生长发育周期缩短为65‑70天，原基成活率高，有效解决了传统栽培方法诱导原基困难、菌丝爬壁、原基在袋壁形成、原基容易物理损伤而死亡等问题，具有较好的产业化应用前景。
Description
技术领域
本发明属于食用菌栽培技术领域，具体涉及一种绣球菌工厂化栽培的新工艺。
背景技术
绣球菌（Sparassis crispa(Wulf.)Fr.）是一种名贵的食药用菌，不仅味道鲜美，而且具有多种营养和保健功能。绣球菌中富含的β-葡聚糖具有抗肿瘤活性、免疫调节、抗炎症反应、促进伤口愈合等作用。在我国，孙朴等1985年首次报道了绣球菌的驯化栽培，实验过程中成功获得了子实体，证明绣球菌可以人工栽培。何荣华等2006年报道了中国首次绣球菌栽培成功。丁湖广、黄建成（2007年）、赖日辉、贾培培、林衍铨、王忠艳、阮晓东、元玲刚、卢亨琼、雷萍、刁文涛（2017）、耿缘、黄贤华、杨丽莉、景勃）等相继对绣球菌的人工栽培方法进行了探索。绣球菌原基发生困难、原基易死亡、产量不稳定、生物学转化率低，生长发育周期长达100-120天等问题是绣球菌人工栽培的技术难点。至今为止绣球菌的栽培技术还很不完善，产量不稳定时有发生。根本原因之一是绣球菌优良的栽培品种和育种资源很有限，在绣球菌的遗传育种方面研究不足。目前行业内认定/鉴定的绣球菌品种仅有2个，分别为2013年的“闽绣1号”和2021年的“闽绣2号”。 根本原因之二是缺乏高效、稳定的绣球菌工厂化栽培技术。目前，绣球菌工厂化栽培方法包括接种、拉直上部空的袋子、缩口、开盖等步骤，不仅工艺繁琐、操作难、效率低、成本高，而且绣球菌原基形成困难、一致性差，菌丝具有爬袋壁并在袋壁形成原基的现象，在开盖时极易导致袋壁原基物理损伤，造成原基成活率降低。根本原因之三是对绣球菌的基础研究薄弱，特别是对绣球菌的遗传育种、栽培模式、基质分解和营养代谢、菌丝生长与子实体发育对环境因子的响应以及相关遗传基础与调控机制等方面的研究还不够深入。见参考文献[1] ～[18]。
综上，如何创新攻关绣球菌工厂化栽培技术难题，突破技术壁垒，是目前绣球菌工厂化栽培首要的研究任务。针对绣球菌工厂化栽培存在的问题，为进一步加快绣球菌工厂化栽培产业发展，本发明提出一种绣球菌工厂化栽培新工艺，以大幅缩短绣球菌的生长发育周期缩，提高原基成活率高，解决传统栽培方法诱导原基困难、菌丝爬壁、原基在袋壁形成、原基容易物理损伤而死亡等问题，为绣球菌的产业发展提供参考。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有技术存在的问题，提供一种生长发育周期短、原基成活率高的绣球菌工厂化栽培新工艺。
本发明采取的技术方案如下：
一种绣球菌工厂化栽培新工艺，方法步骤如下：
（1）原基培养：
（1.1）配制培养基：培养基配方为葡萄糖18-20g，玉米粉4-6g，糯米粉4-6g，鱼粉蛋白胨2-4g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，1/2MS 0.2-0.3g，6-BA 0.05-0.1mg，2,4-D 0.2-0.5mg，NAA0.2-0.5mg，琼脂16g，再用200g/L的土壤上清液过滤定容至1升；将培养基分装到350毫升广口组培瓶，每瓶分装50-100毫升，灭菌、冷却后备用；
（1.2）将绣球菌纯培养物接种至上述培养基中，23±1℃恒温散射光照射培养20-25天；
（1.3）将接种块周围或在培养基表面任意处产生的凸起或扭结的菌丝球或原基再次转移到新的培养基中，继续培养20-25天，如此循环2-3次，获得稳定的原基；
（1.4）将原基扩大培养，获得可用于移接出菇的原基，编号为培养物A；
使用上述配方及方法原基（培养物A）获得率为100%。
（2）出菇瓶/袋制作：
（2.1）出菇瓶/袋配方包含主原料60-68%，碳氮源复合物28-32%，余为其他营养复合物；将上述配方按照比例混合均匀搅拌，调节基质含水量63-65%，pH5-6，分装、灭菌、冷却后备用；
（2.2）接种，将制备好的固体菌种或液体菌种按照1-2%的接种量接种于上述制作的出菇瓶/袋中即可；
（2.3）将接种后的出菇瓶/袋置于23-25℃，恒温暗培养15-20天，得到生长有绣球菌菌丝的培养基料面，将此培养物编号为培养物B；
（3）原基移接：
将上述获得的培养物A在无菌条件下移接到培养物B中定植培养，定植培养温度为23-25℃，调节室内二氧化碳浓度≤3000ppm，散射光照射培养10-15天；
（4）出菇管理：将定植培养的出菇瓶/袋移到出菇房进行出菇管理，打开瓶/袋盖，调节温度为18-20℃，光照500-2000Lx，每天照射≥11小时，室内二氧化碳浓度≤1000ppm，空气湿度≥98%，出菇管理30-35天，待子实体叶片充分展开后即可采收。
进一步地，所述出菇瓶/袋配方中，所述主原料为松木锯末，所述碳氮源复合物为马铃薯粉和/或红薯粉：玉米粉和/或木薯粉和/或大米粉：蛋白胨按质量比9-10：4-6：1-2配制的混合物，所述其他营养复合物为土壤：松针粉：贝壳粉按质量比10-12：1-2：0.05-0.08配制的混合物。
本发明采用创新的特定培养基及培养条件获得大量可用于移接出菇的原基，同时采用特定的栽培配方及条件获得已具有一定量菌丝的培养物，然后将原基移接到由菌丝的培养物中，经定植培养后进行出菇管理。本发明方法使绣球菌的生长发育周期缩短为65-70天，原基成活率高，有效解决了传统栽培方法诱导原基困难、菌丝爬壁、原基在袋壁形成、原基容易物理损伤而死亡等问题，具有较好的产业化应用前景。
附图说明
图1为本发明方法经原基诱发培养获得的一批可移接的绣球菌培养物A；
图2为绣球菌培养物A在培养物B中定植培养的生长发育过程。
图3为绣球菌成熟子实体图。
具体实施方式
为了更清楚地描述本发明的技术方案，下面将结合实施例和附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，这些实施例和附图仅是本发明的部分具体实施例和附图，而非全部的实施例和附图。本发明的发明内容及保护范围包括但不限于实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在无需做出创造性劳动前提下所获得的所有变例，都属于本发明要求保护的范围。
除非特别说明，本发明的百分比为质量百分比。
本发明试验的供试菌株为绣球菌高产栽培菌株JSJ-Spar4-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2023年10月7日，保藏编号为CGMCC No.40889，菌株为JSJ-Spar4-2，分类命名为绣球菌Sparassis sp. 。
本发明的绣球菌工厂化栽培新工艺，具体步骤如下：
（1）原基培养：
（1.1）配制培养基：培养基配方为葡萄糖18-20g，玉米粉4-6g，糯米粉4-6g，鱼粉蛋白胨2-4g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，1/2MS 0.2-0.3g，6-BA 0.05-0.1mg，2,4-D 0.2-0.5mg，NAA0.2-0.5mg，琼脂16g，再用200g/L的土壤上清液过滤定容至1升；将培养基分装到350毫升广口组培瓶，每瓶分装50-100毫升，灭菌、冷却后备用；
（1.2）将绣球菌纯培养物接种至上述培养基中，23±1℃恒温散射光照射培养20-25天；
（1.3）将接种块周围或在培养基表面任意处产生的凸起或扭结的菌丝球或原基再次转移到新的培养基中，继续培养20-25天，如此循环2-3次，获得稳定的原基；
（1.4）将原基扩大培养，获得可用于移接出菇的原基，编号为培养物A。
使用上述配方及方法原基（培养物A）获得率为100%。
（2）出菇瓶/袋制作：
（2.1）出菇瓶/袋配方包含主原料60-68%，碳氮源复合物28-32%，余为其他营养复合物；将上述配方按照比例混合均匀搅拌，调节基质含水量63-65%，pH5-6，分装、灭菌、冷却后备用。所述主原料为松木锯末，所述碳氮源复合物为马铃薯粉和/或红薯粉：玉米粉和/或木薯粉和/或大米粉：蛋白胨按质量比9-10：4-6：1-2配制的混合物，所述其他营养复合物为土壤：松针粉：贝壳粉按质量比10-12：1-2：0.05-0.08配制的混合物。
（2.2）接种，将制备好的固体菌种或液体菌种按照1-2%的接种量接种于上述制作的出菇瓶/袋中即可；
（2.3）将接种后的出菇瓶/袋置于23-25℃，恒温暗培养15-20天，得到生长有绣球菌菌丝的培养基料面，将此培养物编号为培养物B。
（3）原基移接：
将上述获得的培养物A在无菌条件下移接到培养物B中定植培养，定植培养温度为23-25℃，调节室内二氧化碳浓度≤3000ppm，散射光照射培养10-15天；定植培养的培养物A在培养物B中经原基分化、发育成为成熟子实体。
目前的绣球菌人工栽培的技术难点之一是：绣球菌原基发生较难，一致性较差，且绣球菌菌丝具有较强的爬袋壁生长的特性，原基容易在袋壁形成，现有的栽培工艺中采用缩口方式（见参考文献[19]）来解决这一问题，通过菌袋缩口工艺制造微环境刺激原基发生并将原基聚集在培养料上生长，但这种缩口工艺较为繁琐，原基容易受到物理损伤死亡，原基成活率降低，一致性较差，同时也会导致生长周期的延长。因此，本发明采用在菌丝营养生长一定时间后的培养物B，将人为诱导培养好的培养物A移植/嫁接到营养菌丝上，使菌丝营养生长的同时原基吸收营养分化，将营养集中供应原基生长发育进行生殖生长，不需要特殊条件诱导原基，避免原基在壁上形成，提高原基成活率及一致性，缩短栽培周期。
（4）出菇管理：将定植培养的出菇瓶/袋移到出菇房进行出菇管理，打开瓶/袋盖，调节温度为18-20℃，光照500-2000Lx，每天照射≥11小时，室内二氧化碳浓度≤1000ppm，空气湿度≥98%，出菇管理30-35天，待子实体叶片如图3所示充分展开后即可采收。
上述技术方案及各技术参数范围是经过梯度实验后确定的，可取得预期技术效果，绣球菌的生长发育周期短，原基成活率高。
一个具体的实施例如下：
绣球菌工厂化栽培新工艺，具体步骤如下：
（1）原基培养：
（1.1）配制培养基：在组培瓶中将营养菌丝诱发培养获得原基，见图1。培养基配方为葡萄糖20g，玉米粉5g，糯米粉5g，鱼粉蛋白胨3g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，1/2MS0.25g，6-BA 0.08mg，2,4-D 0.3mg，NAA0.3mg，琼脂16g，再用200g/L的土壤上清液过滤定容至1升；将培养基分装到350毫升广口组培瓶，每瓶分装80毫升，灭菌、冷却后备用；
（1.2）将绣球菌纯培养物接种至上述培养基中，23±1℃恒温散射光照射培养22天；
（1.3）将原基再次转移到新的培养基中，继续培养22天，如此循环2次，获得稳定的原基；
（1.4）将原基扩大培养，获得可用于移接出菇的原基，编号为培养物A。图1所示为一批经原基诱发培养获得的可移接的绣球菌培养物A。
使用上述配方及方法原基（培养物A）获得率为100%。
（2）出菇瓶制作：
（2.1）出菇瓶配方包含松木锯末65%，碳氮源复合物30%，余为其他营养复合物。将上述配方按照比例混合均匀搅拌，调节基质含水量约64%，pH6，分装、灭菌、冷却后备用。碳氮源复合物为马铃薯粉和红薯粉：玉米粉和：蛋白胨按质量比9：5：2配制的混合物。其他营养复合物为土壤：松针粉：贝壳粉按质量比11： 2：0.06配制的混合物。
（2.2）接种，将制备好的固体菌种或液体菌种按照1.5%的接种量接种于出菇瓶中；
（2.3）将接种后的出菇瓶置于约24℃，恒温暗培养18天，得到生长有绣球菌菌丝的培养基料面，将此培养物编号为培养物B。
（3）原基移接：
如图3所示，将上述获得的培养物A在无菌条件下移接到培养物B中定植培养，定植培养温度为约24℃，调节室内二氧化碳浓度≤3000ppm，散射光照射培养12天。定植培养的培养物A在培养物B中经原基分化、发育成为成熟子实体。
（4）出菇管理：将定植培养的出菇瓶移到出菇房进行出菇管理，打开瓶盖，调节温度为18-20℃，光照500-2000Lx，每天照射12小时以上，室内二氧化碳浓度800ppm以下，空气湿度≥98%，出菇管理32天，待子实体叶片如图3所示充分展开后即可采收。
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Claims (2)
1.一种绣球菌工厂化栽培新工艺，其特征在于，方法步骤如下：
1)原基培养：
1.1)配制培养基：培养基配方为葡萄糖18-20g，玉米粉4-6g，糯米粉4-6g，鱼粉蛋白胨2-4g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，1/2MS 0.2-0.3g，6-BA 0.05-0.1mg，2,4-D 0.2-0.5mg，NAA0.2-0.5mg，琼脂16g，再用200g/L的土壤上清液过滤定容至1升；将培养基分装到350毫升广口组培瓶，每瓶分装50-100毫升，灭菌、冷却后备用；
1.2)将绣球菌纯培养物接种至上述培养基中，23±1℃恒温散射光照射培养20-25天；
1.3)将接种块周围或在培养基表面任意处产生的凸起或扭结的菌丝球或原基再次转移到新的培养基中，继续培养20-25天，如此循环2-3次，获得稳定的原基；
1.4)将原基扩大培养，获得可用于移接出菇的原基，编号为培养物A；
2)出菇瓶/袋制作：
2.1)出菇瓶/袋配方包含主原料60-68％，碳氮源复合物28-32％，余为其他营养复合物；将上述配方按照比例混合均匀搅拌，调节基质含水量63-65％，pH5-6，分装、灭菌、冷却后备用；
2.2)接种，将制备好的固体菌种或液体菌种按照1-2％的接种量接种于上述制作的出菇瓶/袋中即可；
2.3)将接种后的出菇瓶/袋置于23-25℃，恒温暗培养15-20天，得到生长有绣球菌菌丝的培养基料面，将此培养物编号为培养物B；
3)原基移接：
将上述获得的培养物A在无菌条件下移接到培养物B中定植培养，定植培养温度为23-25℃，调节室内二氧化碳浓度≤3000ppm，散射光照射培养10-15天；
4)出菇管理：将定植培养的出菇瓶/袋移到出菇房进行出菇管理，打开瓶/袋盖，调节温度为18-20℃，光照500-2000Lx，每天照射≥11小时，室内二氧化碳浓度≤1000ppm，空气湿度≥98％，出菇管理30-35天，待子实体叶片充分展开后即可采收。
2.根据权利要求1所述的一种绣球菌工厂化栽培新工艺，其特征在于，所述出菇瓶/袋配方中，所述主原料为松木锯末，所述碳氮源复合物为马铃薯粉和/或红薯粉：玉米粉和/或木薯粉和/或大米粉：蛋白胨按质量比9-10：4-6：1-2配制的混合物，所述其他营养复合物为土壤：松针粉：贝壳粉按质量比10-12：1-2：0.05-0.08配制的混合物。
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