CN117451468A - 一种用于免疫组化与Masson套染的试剂组合、试剂盒及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于免疫组化与Masson套染的试剂组合、试剂盒及使用方法，本发明属于组织染色检测领域。试剂组合包括免疫组化染色试剂、Masson染色试剂、固色液以及显色液，所述固色液中氯化钠质量体积分数为0.25‑0.5％、乙二胺四乙酸二钠质量体积分数为0.5‑1％、丙二醇质量体积分数为0.5‑1％、聚丙烯酰胺质量体积分数为0.25‑0.5％以及硫酸锌质量体积分数为0.25‑0.5％；进一步地，所述显化液，以乙醇作为显色液溶剂，显化液中磷钼酸质量体积分数为1‑3％、浓盐酸质量体积分数为0.1‑0.3％。采用常规免疫组化与Masson套染的过程中，增加了固色液固色步骤和显化液显化步骤，最终染色效果肌纤维红染鲜艳，胶原纤维蓝染明艳，免疫组化染色鲜明；Masson染色与免疫组化染色对比度明显、容易辨析，组织及细胞结构清晰可辨。
Description
技术领域
本发明属于组织染色检测领域，具体地，涉及一种用于免疫组化与Masson套染的试剂组合、试剂盒及使用方法。
背景技术
目前，免疫组化+Masson(马松)三色染色套染方法参见文献《免疫组化、特染套染技术在硬化性胆管炎病理诊断中的应用》中记载：首先进行免疫组化染色，水洗10min，不进行苏木素染色，直接进行Masson三色染色，95％酒精稍洗，无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。其他文献如《探讨免疫组化、特染套染技术在硬化性胆管炎(SC)病理诊断中的应用价值分析》中描述的免疫组化+Masson套染方法：首先进行免疫组化染色，水洗，使用丽春红酸性品红染液、苯胺蓝染液染色，不使用苏木素染色，冲洗、脱水、树胶封固。又如文献《免疫组化、特染套染技术在硬化性胆管炎(SC)病理诊断中的应用价值》中描述的套染技术：免疫组化后采用水进行为期10min的洗涤，苏木素染色步骤可以省去，直接开展Masson染色，洗涤选用95％酒精，脱水采用无水酒精，二甲苯的作用是透明，并用中性树胶进行封固。
现有的常规免疫组化+Masson套染技术存在的缺陷是：其组化染色会因复染Masson，色彩有所叠加，导致实验结果色彩过深、偏暗，色彩对比度不够鲜亮明显或不容易辨析。
发明内容
为了解决上述问题中的至少一个问题，本发明提供了一种用于免疫组化与Masson套染的试剂组合、试剂盒及使用方法，免疫组化与Masson套染采用该固色液后，套染的染色效果是染色鲜亮，组织结构色彩对比鲜明、容易辨析。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明第一方面提供了一种用于免疫组化与Masson套染的试剂组合，包括免疫组化染色试剂、Masson染色试剂、固色液以及显色液，所述固色液包括氯化钠、乙二胺四乙酸二钠、丙二醇、聚丙烯酰胺以及硫酸锌。
在一些具体实施方案中，固色液中氯化钠质量体积分数为0.25-0.5％、乙二胺四乙酸二钠质量体积分数为0.5-1％、丙二醇质量体积分数为0.5-1％、聚丙烯酰胺质量体积分数为0.25-0.5％以及硫酸锌质量体积分数为0.25-0.5％。
在本发明中，固色液可以防止显化液破坏染料与组织的结合，具有护色、固色作用，防止显化过程以及后续步骤对染色的过多弱化，从而保护组织染色，使组织染色牢固鲜明，易于保存和判读。乙二胺四乙酸二钠(又称EDTA二钠)是一种强效螯合剂，具有稳定、抗氧化、防腐、护色的作用。丙二醇溶解性能好，毒性和刺激性较小，是一种具有稳定、防腐、增塑作用的表面活性剂。聚丙烯酰胺无毒，分子量高，水溶性强，可以引进各种离子基团并调节分子量以得到特定的性能，具有稳定、助沉、成膜、补强作用。硫酸锌有收敛性，易溶于水，水溶液呈酸性，具有媒染、防腐、稳定作用。
在一些具体实施方案中，所述显化液包括磷钼酸、浓盐酸以及乙醇。
在一些具体实施方案中，显色液中乙醇为无水乙醇，作为显色液溶剂，其中，磷钼酸质量体积分数为1-3％、浓盐酸质量体积分数为0.1-0.3％。
在本发明中，显化液可以去除过多结合的染料，减轻复染过深导致的DAB着色覆盖，从而增加不同色彩间的对比度，使组织结构色彩鲜亮更易辨析。
本发明的第二方面提供第一方面所述的试剂组合在制备用于组织免疫组化与Masson套染试剂盒中的应用。
在一些具体实施方案中，所述组织选自包括胶原纤维组织、肌纤维组织、癌症组织中的中的至少一种。
在一些具体实施方案中，还包括由所述组织分离出来的单细胞，即对组织分离出来的单细胞染色可达到与组织同样的颜色鲜明的效果。
本发明的第三方面提供了一种用于免疫组化与Masson套染试剂盒，包括第一方面所述的试剂组合。
在本发明的一些具体实施方案中，具体地，试剂组合中固色液和显化液配制方法如下：
固色液：称取0.5g氯化钠、1g乙二胺四乙酸二钠、1g丙二醇、0.5g的聚丙烯酰胺、0.5g硫酸锌，加入纯化水充分混匀，室温保存。
显化液：称取2.5g磷钼酸、使用99.7mL无水乙醇溶解，充分溶解后再加入0.3mL浓盐酸，边加边搅拌混匀，充分混匀后室温避光保存。
在本发明的一些具体实施方案中，免疫组化染色试剂中一抗试剂选用CollagenType IV(BX50067B，杭州百凌生物科技有限公司)，二抗试剂及DAB显色试剂采用免疫显色试剂盒(I20012C，图凌(杭州)生物医药有限公司)。
在本发明的一些具体实施方案中，Masson染色试剂包括Weigert铁苏木素染液、红色染液以及蓝色染液。具体地，试剂配方如下：
Weigert铁苏木素A液：称取0.5g苏木精，加入7mL乙二醇，再加入43mL 95％乙醇，混匀备用。
Weigert铁苏木素B液：浓盐酸0.5mL，溶解于50mL纯化水，加入0.58g无水三氯化铁，混匀备用。
Weigert铁苏木素A液与B液使用前等比例混合，即为Weigert铁苏木素染液。
红色染液：称取0.3g丽春红、0.2g酸性品红、0.58g比布列希猩红、乙酸2mL，加纯化水定容至100mL，充分混匀后室温避光保存。
蓝色染液：称取苯胺蓝2.5g、乙酸2mL，加纯化水定容至100mL，充分混匀后室温避光保存。
本方面的第四方面提供了利用第三方面的试剂盒进行免疫组化与Masson套染的方法，包括如下步骤，
S1、免疫组化染色：利用第一方面所述试剂组合中的免疫组化染色试剂，采用常规免疫组化染色方法对待染色组织依次进行脱蜡水化、修复，然后用PBS洗涤，加入一抗孵育，随后用PBS洗涤，加入二抗后孵育，再次PBS洗涤，然后采用DAB显色液进行显色，终止显色后用水洗掉多余的DAB显色液；
S2、Masson染色：利用第一方面所述试剂组合中的Masson染色试剂，对完成S1的待染色组织使用Weigert铁苏木素染液、红色染液、蓝色染液依次进行染色，染色时间5-10min；
S3、固色：使用本发明第一方面所述试剂组合中的固色液孵育2-5min，用水洗掉多余的固色液；
S4、显化：使用本发明第一方面所述试剂组合中的显化液孵育2min，用水洗掉多余的显化液；
S5、成片观察：显化结束后，进行脱水、吹干、树胶封固成片，在显微镜下观察组织的染色情况。
本发明的有益效果
本发明具有以下有益效果：本发明使用固化液起到护色、固色作用，能够防止显化液破坏染料与组织的结合，同时防止显化过程以及后续步骤对染色的过多弱化，起到保护组织染色的作用，使组织染色牢固鲜明，易于保存和判读。而显化液去除过多结合的染料，减轻复染过深导致的DAB着色覆盖，从而增加不同色彩间的对比度，使组织结构色彩鲜亮更易辨析。
免疫组化与Masson的套染通过增加固色和显化步骤，使组化染色和Masson套染着色的色彩对比更鲜明，使套染的组织结构色彩鲜亮更易辨析。与常规套染相比，显著地提升了染色效果，便于实验结果的判读。
附图说明
图1为实施例1染色方法得到的组织染色结果镜检图片；
图2为对比例1染色方法得到的组织染色结果镜检图片；
图3为对比例2染色方法得到的组织染色结果镜检图片。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
试剂准备
实施例中需要用到的试剂材料如下：
| 物料名称 | CAS号 | 货号 | 规格 | 供应商 |
| 酸性品红 | 3244-88-0 | A610469-0100 | 100g | 生工生物工程(上海)股份有限公司 |
| 丽春红 | 3761-53-3 | A600753-0010 | 10G | 生工生物工程(上海)股份有限公司 |
| 比布列西猩红 | 4196-99-0 | A610019-0025 | 25g | 生工生物工程(上海)股份有限公司 |
| 苏木精 | 517-28-2 | A600701-0050 | 50g | 生工生物工程(上海)股份有限公司 |
| 乙二醇 | 107-21-1 | A600199-0250 | 250mL | 生工生物工程(上海)股份有限公司 |
| 无水三氯化铁 | 7705-08-0 | A600454-0500 | 500g | 生工生物工程(上海)股份有限公司 |
| 磷钼酸 | 51429-74-4 | A600709-0025 | 25g | 生工生物工程(上海)股份有限公司 |
| 苯胺蓝 | 28631-66-5 | A500083-0025 | 25G | 生工生物工程(上海)股份有限公司 |
| 乙酸 | 64-19-7 | A501931-0500 | 500mL | 生工生物工程(上海)股份有限公司 |
| 乙二胺四乙酸二钠 | 6381-92-6 | A500838-0500 | 500g | 生工生物工程(上海)股份有限公司 |
| 氯化钠 | 7647-14-5 | A610476-0001 | 1KG | 生工生物工程(上海)股份有限公司 |
| 丙二醇 | 57-55-6 | A610450-0500 | 500mL | 生工生物工程(上海)股份有限公司 |
| 聚丙烯酰胺 | 9003-05-8 | A502788-0100 | 100g | 生工生物工程(上海)股份有限公司 |
| 硫酸锌 | 7446-20-0 | A602906-0500 | 500g | 生工生物工程(上海)股份有限公司 |
一抗试剂及二抗试剂如下：
| 抗体靶点 | 货号 | 克隆号 | 供应商 |
| Collagen Type IV | BX50067B | BP6072 | 杭州百凌生物科技有限公司 |
| 免疫显色试剂盒(含二抗、DAB色原及DAB缓冲液等) | I20012C | / | 图凌(杭州)生物医药有限公司 |
试剂配制过程如下：
Weigert铁苏木素A液：称取0.5g苏木精，加入7mL乙二醇，再加入43mL 95％乙醇，混匀备用。
Weigert铁苏木素B液：浓盐酸0.5mL，溶解于50mL纯化水，加入0.58g无水三氯化铁，混匀备用。
Weigert铁苏木素A液与B液在使用前等比例混合即得Weigert铁苏木素染液。
红色染液：称取0.3g丽春红、0.2g酸性品红、0.58g比布列希猩红、乙酸2mL，加纯化水定容至100mL，充分混匀后室温避光保存。
蓝色染液：称取苯胺蓝2.5g、乙酸2mL，加纯化水定容至100mL，充分混匀后室温避光保存。
固色液：称取0.5g氯化钠、1g乙二胺四乙酸二钠、1g丙二醇、0.5g的聚丙烯酰胺、0.5g硫酸锌，加入纯化水充分混匀，室温保存。
显化液：称取2.5g磷钼酸、使用99.7mL无水乙醇溶解，充分溶解后再加入0.3mL浓盐酸，边加边搅拌混匀，充分混匀后室温避光保存。
实施例1
取肾组织样本、肺组织样本、结肠癌组织样本玻片，每张玻片每种试剂上样量为0.2mL，以完全覆盖组织为宜。
操作方法如下：常规脱蜡水化、修复，PBS洗涤，加入一抗按说明书孵育，PBS洗涤，加入二抗按说明书孵育，再次PBS洗涤，进行DAB显色，终止显色后自来水洗涤；使用Weigert铁苏木素、红色染液、蓝色染液依次进行染色，每种染料染色时间8min。使用固色液孵育4min，自来水稍洗；使用显化液孵育2min，自来水稍洗；显化结束后，进行脱水、吹干、树胶封固，显微镜下观察染色情况。镜检结果如图1所示。
对比例1
取肾组织样本、肺组织样本、结肠癌组织样本，每张玻片每种试剂上样量为0.2mL，以完全覆盖组织为宜。
操作方法如下：常规脱蜡水化、修复，PBS洗涤，加入一抗按说明书孵育，PBS洗涤，加入二抗按说明书孵育，再次PBS洗涤，进行DAB显色，终止显色后自来水洗涤；使用Weigert铁苏木素、红色染液、蓝色染液依次进行染色，每种染料染色时间8min。使用显化液孵育2min，自来水稍洗；显化结束后，进行脱水、吹干、树胶封固，显微镜下观察染色情况。镜检结果如图2所示。
对比例2
取肾组织样本、肺组织样本、结肠癌组织样本，每张玻片每种试剂上样量为0.2mL，以完全覆盖组织为宜。
操作方法如下：常规脱蜡水化、修复，PBS洗涤，加入一抗按说明书孵育，PBS洗涤，加入二抗按说明书孵育，再次PBS洗涤，进行DAB显色，终止显色后自来水洗涤；使用Weigert铁苏木素、红色染液、蓝色染液依次进行染色，每种染料染色时间8min。95％酒精稍洗，无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察染色情况。镜检结果如图3所示。
测试结果：
结果判读：免疫组化特异性着色部分呈棕色或棕红色；胶原纤维呈蓝色；肌纤维、纤维素、红细胞呈红色；细胞核呈紫褐色或蓝褐色。
结果显示：对比例2结果：染色过深过暗、对比度较差，组织及细胞结构染色区分不够明显，不易辨析。以传统套染方法对比例2为基准，标记为0，有优化标记为+、劣化标记为-。优化是指染色色彩鲜亮、对比更鲜明，组织及细胞结构染色可以明显区分，更易于辨析；劣化是指染色色彩过浅过弱、对比度差，组织及细胞结构染色区分不够明显，不易辨析。
结果整理如下：
| 套染方法 | 肾 | 肺 | 结肠癌 |
| 实施例1 | + | + | + |
| 对比例1 | - | - | - |
| 对比例2 | 0 | 0 | 0 |
对比例2没有使用固色液进行固化，在直接使用显化液处理之后，染色效果被劣化。
实施例1使用了固色液，可以防止显化液破坏染料与组织的结合，具有护色、固色作用，防止显化过程以及后续步骤对染色的过多弱化，从而保护组织染色，使组织染色牢固鲜明，易于保存和判读。显化液去除过多结合的染料，减轻复染过深导致的DAB着色覆盖，从而增加不同色彩间的对比度，使组织结构色彩鲜亮更易辨析。最终实施例1的肌纤维红染鲜艳，胶原纤维蓝染明艳，免疫组化染色鲜明；马松染色与免疫组化染色对比度明显、容易辨析，组织及细胞结构清晰可辨；染色效果优于实验室常规套染。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (9)
1.一种用于免疫组化与Masson套染的试剂组合，其特征在于：所述试剂组合包括免疫组化染色试剂、Masson染色试剂、固色液以及显色液，所述固色液包括氯化钠、乙二胺四乙酸二钠、丙二醇、聚丙烯酰胺以及硫酸锌。
2.根据权利要求1所述的一种用于免疫组化与Masson套染的试剂组合，其特征在于：所述固色液中氯化钠质量体积分数为0.25-0.5％、乙二胺四乙酸二钠质量体积分数为0.5-1％、丙二醇质量体积分数为0.5-1％、聚丙烯酰胺质量体积分数为0.25-0.5％以及硫酸锌质量体积分数为0.25-0.5％。
3.根据权利要求1所述的一种用于免疫组化与Masson套染的试剂组合，其特征在于：所述显化液包括磷钼酸、浓盐酸以及乙醇。
4.根据权利要求1所述的一种用于免疫组化与Masson套染的试剂组合，其特征在于：所述显色液中乙醇为无水乙醇，作为显色液溶剂，其中，磷钼酸质量体积分数为1-3％、浓盐酸质量体积分数为0.1-0.3％。
5.权利要求1-4任一项所述的试剂组合在制备用于组织免疫组化与Masson套染试剂盒中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述组织选自包括胶原纤维组织、肌纤维组织、癌症组织中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：还包括由所述组织分离出来的单细胞。
8.一种用于免疫组化与Masson套染试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-4任一项所述的试剂组合。
9.一种利用权利要求8所述的试剂盒进行免疫组化与Masson套染的方法，其特征在于：包括如下步骤，
S1、免疫组化染色：利用权利要求1所述试剂组合中的免疫组化染色试剂，采用常规免疫组化染色方法对待染色组织依次进行脱蜡水化、修复，然后用PBS洗涤，加入一抗孵育，随后用PBS洗涤，加入二抗后孵育，再次PBS洗涤，然后采用DAB显色液进行显色，终止显色后用水洗掉多余的DAB显色液；
S2、Masson染色：利用权利要求1所述试剂组合中的Masson染色试剂，对完成S1的待染色组织使用Weigert铁苏木素染液、红色染液、蓝色染液依次进行染色，染色时间5-10min；
S3、固色：使用权利要求1所述试剂组合中的固色液孵育2-5min，用水洗掉多余的固色液；
S4、显化：使用权利要求1所述试剂组合中的的显化液孵育2min，用水洗掉多余的显化液；
S5、成片观察：显化结束后，进行脱水、吹干、树胶封固成片，在显微镜下观察组织的染色情况。
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