CN117384826A - 一种鸡x期胎盘原始生殖细胞分离与建系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸡X期胎盘原始生殖细胞分离与建系的方法，属于细胞培养领域。该方法包括使用带孔滤纸膜从X期鸡胚的胚盘中分离、纯化获取原始生殖细胞；将所述原始生殖细胞置于体外长期培养液中，利用饲养层共培养的方法进行培养，实现扩增建系。本发明通过所构建的X期原始生殖细胞的体外增殖和免疫细胞学特征，发现X期原始生殖细胞可以显著迁移到胚胎性腺并高效获得供体来源的后代，这表明X期原始生殖细胞已经具备其他阶段原始生殖细胞具有的功能和特征。本发明为家禽早期原始生殖细胞发育生物学研究提供参考，为后续制备基因编辑鸡和保护家禽种质资源提供新策略。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，特别是涉及一种鸡X期胎盘原始生殖细胞分离与建系的方法。
背景技术
原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)是动物体内所有生殖细胞的祖细胞，具有自我更新能力，并能够分化为精子和卵母细胞，主要功能是将遗传信息传递到下一代，对于物种的延续至关重要。鸟类PGCs最先起源于EG&K X期胚胎的中央盘状明区(XPGCs)，随后PGCs跟随胚胎外胚层迁移到生殖新月，进一步发育侵入血管进入血液循环系统，最终迁移并定植在性腺。鸟类PGCs这种特殊的迁移途径，结合特定的分离培养方法，使得PGCs可以进行体外分离培养。根据胚胎发育过程中PGCs特定的迁移路线，可以从HH 5～8期胚胎的生殖新月、HH 14～17期的胚胎血液和HH 27～31期的胚胎性腺中分离出PGCs。X期胚胎内约有30个PGCs，生发新月形成时约有200～250个，HH 14～17期胚胎血液内约有380个，孵化7天后发育中的胚胎性腺中有1000多个。体外培养的PGCs成为了一种体外高效生产基因编辑动物的工具。在动物育种过程，PGCs可以用于特定生产抗病、生长速度快等性状优良的基因编辑品种，并且对珍惜鸟类种质资源保护具有重要的价值，且研究原始生殖干细胞对生殖疾病或生物发育机理研究等方面均有极其深远的意义。
目前HH 5～8期胚胎生殖新月期、HH 14～17期胚胎血液和HH 27～31期性腺中的PGCs已具有成熟的分离培养方法。然而，在X期胚胎中，已经拥有6万个细胞，其中仅包含30多个PGCs，不到细胞总数的千分之一。此外，胚盘周围有大量的蛋黄，分离困难，已有研究中没有关于体外分离培养建立XPGCs细胞系的报道。XPGCs是鸡胚胎发育过程中最早出现的PGCs，研究XPGCs，有助于推进我们对家禽胚胎发育早期PGCs发育生物学的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸡X期胎盘原始生殖细胞分离与建系的方法，以解决上述存在的技术难题，该方法具有操作简便、实验材料易获得、建系成功率高、建系时间短、高效稳定的特征，为后续制备基因编辑鸡和保护家禽种质资源提供新策略。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种鸡X期胎盘原始生殖细胞分离与建系的方法，包括使用带孔滤纸膜从X期鸡胚中分离胚盘、利用差异贴壁从胚盘中分离、纯化原始生殖细胞；将所述原始生殖细胞置于体外长期培养液中，利用小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层共培养的方法进行培养，实现扩增建系。
所述X期鸡胚来源于所收集的当天新鲜产下的受精种蛋，对应孵化时间为0小时。
优选的是，所述带孔滤纸膜为内含小孔的正方形滤纸，边长为15mm，孔径为7mm。
优选的是，分离所述原始生殖细胞的步骤包括：用带孔滤纸膜贴于X期鸡胚的胚盘顶部的卵黄膜，分离出所述胚盘，并将所述胚盘转移至预热至37℃的PBS溶液中洗涤，重复洗涤2-3次，加入所述体外长期培养液吹打，直至所述胚盘的组织成为细胞悬液，即获得所述原始生殖细胞。
纯化所述原始生殖细胞的步骤包括：将所述原始生殖细胞转移到饲养层，在37℃、5％CO2培养48h，收集未贴壁的悬浮细胞经离心后，用所述体外长期培养液重悬，之后转至新的饲养层继续培养。
优选的是，经分离、纯化后的所述原始生殖细胞使用所述体外长期培养液进行原代培养，每1.5天进行1/3换液，每3天更新一次新的培养层。
优选的是，将所述原始生殖细胞培养至第15天时，按所述原始生殖细胞∶所述体外长期培养液体积为(1∶2)-(1∶3)的比例传代至新的饲养层培养；第27天时，再次以所述原始生殖细胞∶所述体外长期培养液体积为(1∶2)-(1∶3)的比例传代至新的饲养层培养；其余传代时间，每3天按照所述原始生殖细胞∶所述体外长期培养液体积为1:1传代到新的饲养层进行培养，每1.5天进行1/3换液。
优选的是，所述原始生殖细胞培养至第36天时，总细胞数量达到100万个。
优选的是，所述饲养层在使用前需要提前三天使用1mg/mL的丝裂霉素C处理2h，之后铺至相应细胞培养板，1.5天使用含有10％FBS的DMEM F12(BI)完全培养液更换培养液，第3天可以接种原始生殖细胞使用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明公开了一种鸡X期胎盘原始生殖细胞分离与建系的方法，通过贴附特制滤纸法从X期DAZL-mCherry基因编辑鸡胚中分离胚盘，并从胚盘中分离、纯化X期原始生殖细胞，将分离得到的XPGCs接种至饲养层配和优化的PGCs体外长期培养系统进行培养，在36天内从30多个XPGCs扩增至1×106个，实现首例X期鸡胚盘原始生殖细胞快速分离培养与建系。另外，检测了XPGCs的体外增殖和免疫细胞学特征，发现XPGCs可以显著迁移到胚胎性腺，并呈现原始生殖细胞标记蛋白阳性，验证了本发明中所述XPGCs细胞系的原始生殖细胞特征。
本发明公开的方法具有操作简便、实验材料易获得、建系成功率高、建系时间短、高效稳定的特征，为研究家禽早期原始生殖细胞发育生物学提供参考意义，为后续制备基因编辑鸡和保护家禽种质资源提供新策略。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为剪裁好的滤纸圈的示意图片；
图2为有无圆孔的滤纸分离胚盘效果对比图；A图为有孔滤纸分离操作流程图，其视野清晰透亮，便于定位胚盘位置，有利于完整地分离胚盘；B为无孔滤纸分离操作流程图，其透光性差，无法确切看到胚盘位置，不便剥离上层附着卵黄，更无法进一步进行分离胚盘；
图3为DAZL-mCherry基因编辑模型鸡X期胚盘分离荧光图，框内为XPGCs存在位置即X期胚盘明区的中央盘；
图4为本发明成功建系的XPGC细胞形态图，左侧为明场下细胞，右侧为mCherry红色荧光下细胞；
图5本发明成功建系后的XPGCs细胞系碱性磷酸酶染色鉴定图；
图6为XPGCs特异性基因的RT-PCR鉴定结果；泳道CEF(Chicken EmbryoFibroblasts，鸡胚成纤维细胞)为阴性对照；泳道XPGC为本发明成功建系后的细胞；泳道gPGC(HH28期性腺PGC)为阳性对照；每个泳道由上到下依次对应PouV、Nanog、DAZL、CVH、CDH和β-ACTIN基因的扩增产物；
图7为本发明成功建系后的XPGCs细胞系进行SSEA1、DAZL、CVH染色鉴定图；A，CVH免疫荧光阳性细胞；B，SSEA1免疫荧光阳性细胞；C，DAPI对细胞核的免疫荧光染色；D，CVH、SSEA1和DAPI染色的Merge图；E，DAZL免疫荧光阳性细胞；F，SSEA1免疫荧光阳性细胞；G，DAPI对细胞核的免疫荧光染色；H，DAZL、SSEA1和DAPI染色的Merge图；
图8为本发明成功建系后的细胞进行向受体胚胎性腺迁移能力的鉴定图；左侧为6.5日龄受体鸡胚性腺的明场图；右侧为6.5日龄受体鸡胚性腺红色荧光PGC的迁移图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1一种鸡X期胚盘原始生殖细胞的分离与建系的方法
(1)X期鸡胚的准备
收集实验当天新鲜产下的受精种蛋(种蛋来源于Dazl-mCherry基因编辑工具鸡(此工具鸡已发表见刊详细文章：Tracking the dynamics of female germ celldevelopment during peri-hatch periods using a gene-edited chicken model-ScienceDirect，但是种蛋的来源并不局限于此鸡，对其他所有鸡的品种都是适用的，比如发明人还对东兰乌鸡、广西三黄鸡、广西麻鸡和白羽鸡进行了验证，同样能取得与本发明相同的效果)，置于19℃静置4h后方可进行后续实验。
(2)XPGC的分离
具体操作步骤如下：
取出静置完毕的X期鸡胚，使用事先裁剪好的滤纸圈(见图1，正方形滤纸边长为15mm，中间打一个直径为7mm的圆孔；同时以采用不带孔的滤纸进行分离胚盘的对照实验，见图2)贴于X期胚盘顶部的卵黄膜，使用眼科剪沿着滤纸边缘剪开卵黄膜后转移至提前准备好含有预热至37℃PBS的60mm中皿内进行胚盘分离，将含有卵黄膜的胚盘置于PBS液面上方便于在体式显微镜下进行观察，使用眼科弯镊将X期胚盘上面附着的卵黄完整剥离后，使用1mL移液枪(枪头前端100μL剪去)将胚盘从滤纸膜上转移至提前准备好含有预热至37℃PBS的60mm中皿内进行洗涤，重复洗涤2-3次，洗涤完毕使用荧光显微镜观察(见图3)。随后，将胚盘移入装有1mL PGC体外长期培养液的15mL离心管中，并轻轻吹打至胚盘组织形成细胞悬液。
上述PGC体外长期培养液(参考专利号为201711289911.0的发明专利中的优化的培养液配方)。
(3)XPGC的纯化
转移细胞悬液到已铺好饲养层的24孔板内，37℃，5％CO2培养48h，收集未贴壁的悬浮细胞到15mL离心管内800rpm离心5min，弃掉上清，用新的体外长期培养液重悬并转移至新的含有饲养层24孔板内。
上述MEF饲养层的处理方法为：在使用前需要提前三天使用1mg/mL的丝裂霉素C处理2h，之后铺至相应细胞培养板，1.5天使用含有10％FBS的DMEM F12(BI)完全培养液更换培养液，第3天可以接种PGCs使用。
(4)XPGC的原代培养
使用PGC体外长期培养液培养，每1.5天进行1/3换液，每3d更换新的饲养层。
(5)XPGC传代培养和建系
将以上XPGC在培养至第15天时，按1∶2到1∶3的比例传代至含有新饲养层的12孔板内；第27天时再次以1∶2到1∶3的比例传代至含有新饲养层的12孔板内。XPGC细胞系总细胞数量在第36天达到100万个。以上过程中除了提出的时间点按比例传代外，其余时间使用原始生殖细胞体外长期培养液以1∶1对应细胞培养孔板传代培养，每1.5d进行1/3换液，每3天进行传代更换新的饲养层直至建系(见图4)。
(6)碱性磷酸酶(AP)活性检测
使用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒(Beyotime,C320，南通，中国)测定碱性磷酸酶(AP)活性，根据制造商的说明，稍加修改。总共收集了1×106个XPGCs，并汇集到一个6孔板中。细胞沉淀后，在体视显微镜下用移液枪小心地移出培养基。细胞在PBS中冲洗一次，在染色液中室温孵育30分钟。孵育后，除去染色液，用PBS冲洗细胞两次，最后重新悬浮在PBS中涂片并在倒置显微镜(Olympus)下观察成像。
碱性磷酸酶染色结果如图5所示，本发明建立的XPGCs细胞系呈碱性磷酸酶强阳性。
(7)RT-PCR检测生殖干细胞特异标志基因表达
Dazl、PouV、Nanog、Cvh、Cdh等基因是PGC在发育过程中特异性表达的基因，在体细胞中不表达，对本发明构建的X期PGC细胞系(XPGCs)进行RT-PCR。具体步骤如下：
提取XPGCs及CEF细胞的总RNA(CEF细胞为阴性对照)，经反转录为cDNA后，进行Dazl、Nanog、PouV、Cvh、Cdh等基因扩增，同时扩增β-actin基因为阳性对照，最后琼脂凝胶电泳。
①引物参考已发表的文献“Derivation and characterization of primordialgerm cells from Guangxi yellow-feather chickens-ScienceDirect”，设计好的引物序列交由北京擎科生物科技股份有限公司进行成(引物序列见表3)。
表3 RT-PCR引物序列
②提取样品RNA
试验样品提取RNA的方法按照OMEGA公司“Total RNA Kit I”的说明书进行。
③RNA反转录为c DNA
按照One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒(全式金/AE311)的说明书进行。
④PCR扩增
反应体系见表4：
表4PCR反应体系
反应程序如下表5：
表5反应程序
PCR反应产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。85V，25min；110V，10min。
RT-PCR结果如图6所示，本发明建立的XPGCs细胞系表达PouV,Nanog,Dazl,Cvh,Cdh,这些原始生殖细胞特异性标记基因。
(8)XPGCs的免疫荧光染色鉴定
PGC在整个发育时期会表达生殖细胞特异性蛋白，DAZL、SSEA1、CVH可作为PGC的标志物，对本发明中分离建系的XPGCs细胞系进行免疫荧光染色鉴定。具体步骤如下：
①前期准备：将盖玻片用镊子小心放入6孔细胞培养皿中，并用多聚赖氨酸处理；配置封闭液，其成分为含有1％BSA的PBS溶液；收集1×106个XPGCs至15ml离心管内后使用PBS重悬清洗；用封闭液稀释一抗、二抗(1：200比例稀释)；用PBS溶液将DAPI(Thermoo-Fisher,P36934)稀释到工作浓度(1：10000比例稀释)；其中，一抗为：DAZL(IgG，Rabbit，武汉金开瑞/订制)、SSEA1(IgG，Mouse，Hybridoma Bank/Mc-480)、CVH(IgG，Rabbit，武汉金开瑞/订制)；二抗为：Alexa594Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(Life Technology/A-11005)、DyLight 488Conjugated AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG(H+L)(博士德生物/BA1127)；
②固定：离心去除PBS，使用4％多聚甲醛固定液(Biosharp,BL539A)1mL重悬，室温固定15min；将1mL细胞悬液转移至1.5mL的EP管中，在离心机内以5000rpm离心60s，去除上清使用1ml ddH2O重悬清洗，随后离心；去除上清后，使用100μL ddH2O重悬；
③涂片：在粘附载玻片上加入5μL细胞悬液，用移液管尖端侧面涂抹均匀，将载玻片放37℃烘箱内让液体蒸发，使用PAP笔(GeneTech,GT1001)将细胞涂抹部外围画上疏水屏障圈，PBS清洗3次；
④封闭：在室温条件下，用封闭液处理1h；
⑤孵育一抗：向每个圈中加入100μL封闭液稀释好的一抗，在室温条件下孵育1h，随后使用PBS清洗3遍；
⑥孵育二抗：向每个圈中加入100μL封闭液稀释好的二抗，在室温避光条件下孵育60min，在室温避光条件下用PBS溶液洗3遍；
⑦DAPI染色细胞核：向每个圈中加入100μL封闭液稀释好的DAPI溶液在避光室温条件下孵育2min。
免疫荧光染色结果如图7所示，本发明建立的XPGCs细胞系表达DAZL、SSEA1、CVH这些原始生殖细胞特异性标记，细胞核为DAPI染色。
(9)XPGCs性腺迁移能力的鉴定
能够从2.5d受体胚胎的心脉血液系统向性腺迁移并最后定植进行增殖的特征，是PGC细胞所特有的特性。本发明构建的XPGCs细胞系是自带mCherry红色荧光的，把建系的XPGCs细胞系进行鸡胚注射。鸡胚注射具体步骤按照如下进行：取的XPGCs细胞总数根据所要注射鸡胚数来定，使用对应培养液重悬调整细胞密度，每个鸡胚注射2μl培养液应含有1×104个XPGCs，使用直径为30μm的纤维玻璃针吸取细胞并注射至孵化53h受体鸡胚的心脏内。继续孵育至6.5d后解剖鸡胚，观察受体鸡胚性腺内mCherry荧光细胞的数目。
结果如图8所示，经过建系培养的mCherry红色荧光XPGCs，具有迁移到性腺中的能力。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种鸡X期胎盘原始生殖细胞分离与建系的方法，其特征在于，包括使用带孔滤纸膜从X期鸡胚的胚盘中分离、纯化获取原始生殖细胞；将所述原始生殖细胞置于体外长期培养液中，利用小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层共培养的方法进行培养，实现扩增建系。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述X期鸡胚来源于所收集的当天新鲜产下的受精种蛋。
3.如权利要求1所述的方法，所述带孔滤纸膜为内含小孔的正方形滤纸，边长为15mm，孔径为7mm。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分离所述X期原始生殖细胞的步骤包括：用带孔滤纸膜贴于X期鸡胚的胚盘顶部的卵黄膜，分离出所述胚盘，并将所述胚盘转移至预热至37℃的PBS溶液中洗涤，重复洗涤2-3次，之后用所述体外长期培养液吹打，直至所述胚盘的组织成为细胞悬液，即得所述原始生殖细胞混合液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，纯化所述原始生殖细胞的步骤包括：将所述原始生殖细胞混合液转移到饲养层，在37℃、5％CO2培养48h，收集未贴壁的悬浮细胞经离心后，用所述体外长期培养液重悬，之后转至新的饲养层继续培养。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，经分离、纯化后的所述原始生殖细胞使用所述体外长期培养液进行原代培养，每1.5天进行1/3换液，每3天更新一次新的培养层。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述原始生殖细胞培养至第15天时，按所述原始生殖细胞∶所述体外长期培养液体积为(1∶2)-(1∶3)的比例传代至新的饲养层培养；第27天时，再次按所述原始生殖细胞∶所述体外长期培养液体积为(1∶2)-(1∶3)的比例传代至新的饲养层培养；其余传代时间，每3天按照所述原始生殖细胞∶所述体外长期培养液体积为1:1的比例传代到新的饲养层进行培养，每1.5天进行1/3量换液。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述原始生殖细胞培养至第36天时，总细胞数量达到100万个。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MEF饲养层在使用前需要提前三天使用1mg/mL的丝裂霉素C处理2h，之后铺至相应细胞培养板，1.5d使用含有10％FBS的DMEM F12(BI)完全培养液更换培养液，第3d可以接种原始生殖细胞。
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