CN117344035A - 一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒及其应用。利用本发明所述试剂盒可对肺炎克雷伯菌进行特异性扩增，从而实现对肺炎克雷伯菌的快速定性或定量检测。本发明所述检测方法与传统的qPCR方法的阴阳性符合率达到97.5％，相关性较好，相关系数r达到0.981。

Description

一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒及其应用
技术领域
本申请涉及生物医学检测领域，具体涉及一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒及其应用。
背景技术
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是肠杆菌科细菌中常见的病原菌之一，尤其在菌血症、尿道感染、下呼吸道感染等。由于抗生素选择有限以及高发病率和高死亡率，耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌(carbapenem resistant K.pneumoniae,CRKP)遍及全球，成为对公共卫生的主要威胁。前期研究发现，由CRKP引起的感染的死亡率为30％～55％，快速可靠地分辨CRKP对其传播和流行病学监测至关重要。目前，临床上耐药细菌的检测主要通过纸片扩散法、Etest试纸条和自动化微生物系统方法检测药敏试验的结果，或者采用PCR的方法检测耐药基因。常规药敏试验通常需要24h才能报告结果，而PCR的方法虽然用时短但较为繁琐，对实验室要求太高，不适合在临床推广。
胶乳增强免疫比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后,直接测定反应液的吸光度值,省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。
RPA等温扩增技术，也称重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymeraseamplification,RPA)是2006年Piepenburg等人利用参与细胞DNA合成的蛋白重组和修复开发出的一种新的核酸恒温扩增技术，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。RPA的反应过程首先是重组酶与引物结合，形成蛋白-DNA复合物，然后蛋白-DNA复合物在双链DNA寻找同源序列。一旦引物寻找到目标同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，针对模板上的靶序列在数分钟之内完成指数级别的扩增。而被替换的DNA链与SSB(单链DNA结合蛋白)结合，保持DNA维持单链状态，防止被核酸酶水解这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右，只需少量的样本制备，即可在10min内扩增低至1-10个DNA拷贝，具有高灵敏度、可选择性、便携性、快速与可以进行多重扩增等优点。
发明内容
本试剂盒在胶乳增强技术的原理上进行创新，利用全自动生化平台上结合核酸等温扩增技术进行了一种全新的尝试。将市面上几乎所有全自动生化仪都自带的恒温孵育模块对核酸样本进行恒温扩增，将扩增后产物(每个扩增产物两端各连接一个生物素)通过与偶联有链霉亲和素的胶乳微球特异性结合形成多个胶乳-扩增产物聚集体，从而形成浊度被生化仪检测到；该技术不但可以快速解决普通核酸检测样本的时间限制，还具备胶乳增强比浊技术的高灵敏特性，从而具备了高灵敏检测核酸分子的能力。为解决现有技术中缺乏检测肺炎克雷伯菌的试剂的问题，本发明公开了一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒及其应用。
本发明通过以下技术方案实现上述问题：
本发明的第一方面提供一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其中，所述试剂盒除包括一对用于特异性扩增肺炎克雷伯菌的引物对外，还包括至少两种粒径的聚苯乙烯羧基微球，使其在线性范围内可以定量检测所述肺炎克雷伯菌；“可以”定义为能够确定所检测的肺炎克雷伯菌的具体浓度。
其中，所述引物对包含正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQID NO:1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在本发明的一些具体的实施方案中，所述引物对的正向引物和/或反向引物的5’端和/或3’端缀合有标记物；所述聚苯乙烯羧基微球偶联有可以与标记物特异性结合的分子，以实现定性和/或定量检测。
在本发明的一些优选实施方案中，所述标记物为生物素，与标记物特异性结合的分子为链霉亲和素。
在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒还包括扩增酶、醋酸镁、促凝剂、防腐剂、封闭剂、离子稳定剂、微球储存液和缓冲液中的一种或多种。
在本发明的另一些具体实施方案中，所述试剂盒还包括以下一种或多种：
(1)所述扩增酶为RPA酶组合，其包括结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、重组酶辅助因子和肌酸激酶；
(2)所述促凝剂选自聚乙二醇、壳聚糖、葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种；所述聚乙二醇优选PEG25000；
(3)所述防腐剂选自叠氮化钠、硫柳汞和ProCline 300中的一种或多种；
(4)所述封闭剂选自酪蛋白、甘氨酸和BSA中的一种或多种；
(5)所述离子稳定剂选自0.4～2％ NaCl、KCl和MgCl2中的一种或多种，优选0.9％NaCl；
(6)所述微球储存液选自50～500mM Tris、HEPES和PBS缓冲液，pH6.5～7.8；优选100mM PBS，pH 7.4；
(7)所述缓冲液为10～500mM Tris或PBS，pH 6.5～8.8；优选10mM Tris，pH 8.0。
在本发明的一些具体实施方案中，所述聚苯乙烯羧基微球的粒径为88±5nm和309±5nm。
优选地，所述试剂盒还包括粒径为147±5nm的聚苯乙烯羧基微球。
更优选地，所述聚苯乙烯羧基微球的粒径分别为88nm、147nm和309nm。
本发明的第二方面提供一种用于特异性扩增肺炎克雷伯菌的引物对，其中，所述引物对包含正向引物和反向引物，所述正向引物的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的第三方面提供一种对样品中是否包含肺炎克雷伯菌进行定性的方法，该方法使用如本发明第一方面所述的试剂盒进行检测，其包括以下步骤：
(1)使用引物对和扩增酶对样品中的核酸进行扩增；
(2)加入不同粒径聚苯乙烯羧基微球和链霉亲和素，读取吸光度A1数据组；
(3)凝集反应后，再次进行吸光度检测，读取A2数据组，并计算每组对应的ΔA＝A2-A1；
(4)若ΔA＞x，则判定样品中存在肺炎克雷伯菌，所述x为实际检测定量限所对应ΔA的值。
本发明的第四方面提供一种对样品中的肺炎克雷伯菌进行相对定量的方法，该方法使用如本发明第一方面所述的试剂盒进行检测，步骤是：
(1)使用引物对和扩增酶对样品中的核酸进行扩增；
(2)加入不同粒径的聚苯乙烯羧基微球和链霉亲和素，读取吸光度A1数据组；
(3)凝集反应后，再次进行吸光度检测，读取A2数据组，并计算每组对应的ΔA＝A2-A1；
(4)利用不同粒径的聚苯乙烯羧基微球的线性标准曲线，将ΔA代入，计算得到样品中肺炎克雷伯菌的核酸浓度；
(5)将不同粒径微球测得的核酸浓度与其可信范围相比较，取落在可信范围内的核酸浓度作为最终报告值。
优选地，所述(5)中，若有多个不同粒径微球测得的核酸浓度均落在其可信范围内，则以线性范围更宽的微球测得的核酸浓度为最终报告值。
在本发明的一些具体的实施方案中，所述方法包括以下条件的一种或多种：
(i)提取样品中的核酸，以用于所述扩增；
(ii)在提取的核酸中加入如本方面第一方面所述的试剂盒所定义的激活剂；
(iii)所述标记物与标记物特异性结合的分子结合，产生凝集反应；
(iv)所述凝集反应在37℃下进行3-6min；
优选地，所述(i)中，将1份样本和4-5份0.5％ SDS等渗葡萄糖溶液混合；并加入4-5份0.1M KOH，0.5mM EDTA混合；置于80-100℃金属浴孵育2-10min，例如90℃金属浴中孵育5min；静置待絮状沉淀析出后取上清即得样品中的核酸。
在本发明的另一些具体的实施方案中，所述聚苯乙烯羧基微球与标记物特异性结合的分子结合包括以下步骤：
(a)将聚苯乙烯羧基微球以1％浓度分散在MES中，加入NHS和EDC，反应；
(b)离心弃上清，用缓冲液例如HEPES重悬浮超声；
(c)加入链霉亲和素，反应；
(d)加入封闭剂例如1％BSA终止偶联反应；
(e)离心弃上清，用微球储存液重悬浮超声，制成偶联有链霉亲和素的聚苯乙烯羧基微球溶液。
本发明的第五方面提供一种如本发明第二方面所述的引物对或本发明第一方面所述的试剂盒在检测样品中肺炎克雷伯菌中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1、应用本发明可以实现对待检测核算样品中是否含有肺炎克雷伯菌的快速定性检测。
2、应用本发明可以实现对待检测核算样品中是否含有肺炎克雷伯菌的快速相对定量检测，且本发明检测方法与传统的qPCR方法的阴阳性符合率达到97.5％，相关性较好，相关系数r达到0.981。
附图说明
图1显示了不同碱解试剂处理后的样本核酸提取效果；其中，
M为Marker；1为金黄色葡萄球菌；2为铜绿假单胞菌；3为鲍曼不动杆菌；4为肺炎克雷伯菌；5为米根霉；6为卷枝毛霉菌；NC为阴性对照。
图2显示了不同核酸提取方法提取的核酸在qPCR反应中的表现。
图3显示了不同引物对对肺炎克雷伯菌的扩增效果；其中，M为Marker。
图4显示了不同引物对浓度对肺炎克雷伯菌的扩增效果；其中，
M为Marker；1为引物浓度为0.6μM，2为引物浓度为0.5μM，3为引物浓度为0.2μM，4为引物浓度为0.1μM。
图5显示了不同粒径聚苯乙烯羧基微球检测校准品的校准曲线。
图6显示了KPS和SPS基质溶解的校准品的校准曲线；其中，
图6A显示了KPS和SPS基质溶解的校准品在低灵敏度试剂组中的校准曲线；图6B显示了KPS和SPS基质溶解的校准品在中灵敏度试剂组中的校准曲线；图6C显示了KPS和SPS基质溶解的校准品在高灵敏度试剂组中的校准曲线。
图7显示了本发明检测方法与传统qPCR检测方法的Passing-Bablok回归分析结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1样本核酸提取方法优化
1.1碱解试剂的选择优化
分别对真菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌株进行样本核酸初提方法测试。对于碱试剂的选择，选择0.1M氢氧化钠(NaOH)和0.1M氢氧化钾(KOH)作为待测试剂，其余步骤与样本释放剂处理菌株方法一致。对于提取的菌株样本DNA进行PCR扩增验证。对于细菌验证的引物对选择16sDNA-F/R，其正向引物核酸序列如SEQ ID NO:3所示，其反向引物的核酸序列如SEQ ID NO:4所示。对于真菌验证的引物对选择ITS1/ITS4引物对，其正向引物核酸序列如SEQ ID NO:5所示，其反向引物的核酸序列如SEQ ID NO:6所示。
SEQ ID NO:3序列为：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
SEQ ID NO:4序列为：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA
SEQ ID NO:5序列为：TCCGTAGGTGAACCTGCGG
SEQ ID NO:6序列为：TCCTCCGCTTATTGATATGC
PCR扩增的体系和扩增程序如下：
表1 PCR鉴定扩增体系
试剂 体积(μl)
PCR buffer 20.3
5μM正向引物 2
5μM反向引物 2
模板 2.5
Taq酶 0.2
表2 PCR鉴定扩增程序
对于扩增的结果用2％的琼脂糖凝胶进行鉴定，结果如图1所示，对于裂解试剂中的碱解试剂选择氢氧化钾(KOH)可对提取起到显著作用。
1.2样本核酸提取方法的优化
方案1：取20μl样本，加入到100μl的0.5％ SDS溶液中，涡旋混匀；再加入100μl0.1M KOH溶液，涡旋混匀，置于90℃金属浴中孵育5min；随后室温静置使温度恢复至室温，有SDS絮状沉淀析出，置于离心机10000rpm离心2min，取上清加入pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液即可得到提取的基因组溶液。
方案2：取20μl样本，加入到95μl的0.5％ SDS溶液中，涡旋混匀；再加入95μl 0.1MKOH溶液，涡旋混匀；再加入10μl 10mM EDTA置于90℃金属浴中孵育5min；随后室温静置使温度恢复至室温，有SDS絮状沉淀析出，置于离心机10000rpm离心2min，取上清加入pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液即可得到提取的基因组溶液。
方案3：取20μl样本，加入到95μl的0.5％ SDS等渗葡萄糖溶液，涡旋混匀；再加入95μl 0.1M KOH，0.5mM EDTA，涡旋混匀；置于90℃金属浴中孵育5min；随后室温静置使温度恢复至室温，有SDS絮状沉淀析出，置于离心机10000rpm离心2min，取上清加入样本保存液即可得到提取的基因组溶液。
取上清加入样本保存液即可得到提取的基因组溶液。
对于上述方案，用qPCR进行检测，qPCR引物对为KP-F与KP-R，其正向引物核酸序列如SEQ ID NO:7所示，其反向引物的序列如SEQ ID NO:8所示。
SEQ ID NO:7序列为：GAAGCTGAAGAACTACGGC
SEQ ID NO:8序列为：TACTGCAGGGTCAGATCCAGG
检测结果如图2所示：可知对于方案3的稳定性和Ct值均较好。
表3 qPCR结果统计
Ct值 方差
方案1 28.08 0.33
方案2 26.21 0.266
方案3 24.6 0.23
实施例2RPA等温扩增优化
2.1对于RPA酶扩增引物的优化
对于快速扩增反应体系，对应引物的进行优化，引物对分别选择KP-1引物对，其正向引物核酸序列如SEQ ID NO:9所示，其反向引物的核酸序列如SEQ ID NO:10所示；KP-2引物对，其正向引物核酸序列如SEQ ID NO:11所示，其反向引物的核酸序列如SEQ ID NO:12所示；KP-3引物对，其正向引物核酸序列如SEQ ID NO:1所示，其反向引物的核酸序列如SEQID NO:2所示；
SEQ ID NO:1序列为：CAGGTAGCCCTGCAGATAATTCACCCCCAGCTSEQ ID NO:2序列为：CGATATCATCAAGATTGACGGCTGCTTCGTTCSEQ ID NO:9序列为：GTCCCTTGCCCGACCCGACGGCACGGCCA；
SEQ ID NO:10序列为：CGACGGCACGGCCAGTCCCGCCCGAGG；
SEQ ID NO:11序列为：
TCGCGTAGGGGGAGGCTGCGACGGCACGGCCAT；
SEQ ID NO:12序列为：CGACGGCACGGCCATTGTCCCGCCCGAGG。
其余体系均不变，反应步骤如下：
(1)向5μl样本中，加入5μl激活剂混匀；
(2)RPA酶体系为25μl，10mM dNTP 8μl，正反向引物，补水至40μl；
(3)将第一步的混有激活剂的样本加入到反应体系中，涡旋混匀，37℃恒温孵育10min；
反应结束后用2％琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图3所示，从电泳图可以看出引物对KP-3的条带亮度和特异性最高，因此后续选择KP-3作为反应扩增选用的引物对。
2.2对于RPA酶扩增反应体系的优化
对于快速扩增反应体系，对应引物的浓度进行体系优化，KP-3引物对在反应体系中的浓度分别为：0.6μM，0.5μM，0.2μM，0.1μM。分别对应的10μM引物反应体积为：3μl，2.5μl，1μl，0.5μl。
其余体系均不变，反应步骤如下：
(1)取5μl样本中，加入5μl激活剂混匀；
(2)RPA酶体系为25μl，10mM dNTP 8μl，正反向引物，补水至40μl；
(3)将第一步的混有激活剂的样本加入到反应体系中，涡旋混匀，37℃恒温孵育10min。
反应结束后用2％琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图4所示，当引物浓度为0.6μM和0.5μM时的条带大小和亮度一致，因此选择反应体系的引物浓度为0.5μM。
实施例3制备偶联有链霉亲和素的聚苯乙烯羧基微球
其制备有以下步骤：
使用官能团为羧基的聚苯乙烯羧基微球(北京博尔迈生物技术有限公司)通过NHS(N-羟基丁二酰亚胺)和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的活化后，再与链霉亲和素上的氨基偶联形成酰胺反应，本发明采用的偶联方法如下：
(1)将10mg羧基胶乳微球(粒径采用50nm～350nm)分散在1ml MES(pH 5.8～6.5，优选6.1)中(微球浓度1％)，加入NHS(N-羟基丁二酰亚胺)和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)，于室温反应1h；
(2)12000rmp离心30min弃去上清，用MES或者HEPES缓冲液重悬浮超声；
(3)加入1.2mg/ml链霉亲和素，搅拌反应1.5h；
(4)加入0.1％～1％的BSA进行封闭终止偶联反应，封闭过夜；
(5)12000rmp离心30min弃去上清，用微球储存液重悬浮超声，制成偶联有链霉亲和素的聚苯乙烯羧基微球；
得到的偶联有链霉亲和素的聚苯乙烯羧基微球储存在微球储存液中，微球储存液配方为：
100mM PBS缓冲液pH 7.4，0.9％ NaCl，0.1％ BSA，0.1％ ProCline 300。
实施例4使用试剂盒检测不同浓度肺炎克雷伯菌
4.1试剂盒试剂准备
(1)校准品：包含肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)的保守序列质粒和器官保存液基质、5％牛血清及防腐剂(0.1％叠氮化钠)；
(2)样本释放试剂(细菌提取剂)包含有包含有SDS、KOH、EDTA等，其中：
样本释放剂1：0.5％ SDS等渗葡萄糖溶液；
样本释放剂2：0.1M KOH，0.5mM EDTA；
(3)样本保存液：Tris-HCl缓冲液，pH 8.0；
(4)激活剂：150mM醋酸镁(MgOAc)；
(5)R1：包含扩增用的正向引物、反向引物、dNTP、RPA酶组合、离子稳定剂、促凝剂、防腐剂和缓冲液，其中：
缓冲液：10mM Tris-HCl，pH 8.2；
引物：0.5μM KP3-F(正向引物)、0.5μM KP3-R(反向引物)；
扩增酶组合及底物：10mM dNTP溶液，聚合酶(Bsu DNA polymerase，翌圣生物，货号：11078ES72)，重组酶(T4 UvsX Recombinase，翌圣生物，货号：11079ES60)，重组酶辅助因子(T4 UvsY Protein，翌圣生物，货号：11080ES60)，单链结合蛋白(T4 gene 32protein，翌圣生物，货号：11081ES72)，肌酸激酶(Creatine Kinase，翌圣生物，货号：14502ES05)；
离子稳定剂：0.9％NaCl；
促凝剂：PEG25000(不同浓度可以调控促凝反应的强度，可调整)；
防腐剂：0.1％ ProClin300；
(6)R2：包含偶联有链霉亲和素的聚苯乙烯羧基微球溶液、离子稳定剂、蛋白稳定剂、封闭剂、防腐剂和缓冲液，其中：
R2(中灵敏试剂组)为88nm偶联有链霉亲和素的聚苯乙烯羧基微球溶液；
R2(中灵敏试剂组)为147nm偶联有链霉亲和素的聚苯乙烯羧基微球溶液；
R2(高灵敏试剂组)为309nm偶联有链霉亲和素的聚苯乙烯羧基微球溶液；
离子稳定剂：1％ NaCl；
缓冲液：pH 7.5，100mM HEPES缓冲液；
蛋白稳定剂：0.5％海藻糖；
封闭剂：0.1％ BSA；
防腐剂：0.1％ ProClin300。
4.2绘制不同粒径聚苯乙烯羧基微球测定校准品核酸浓度的标准曲线
其步骤包括：
(1)全自动生化仪(日立，7180)参数设置为：主波长546nm；
(2)分别取3份20μl浓度梯度的校准品，与100μl R1混匀，37℃孵育3-5min；
(3)将(2)中的3份混合液分别与100μl低灵敏度、中灵敏度和高灵敏度的R2试剂混匀，37℃孵育20s后，置于生化仪，读取吸光度A1；
(4)37℃孵育5min后，置于生化仪，读取吸光度A2；
(5)计算得到ΔA(生化仪检测吸光度值)＝A2-A1；
(6)以校准品浓度梯度为横坐标，以ΔA值为纵坐标绘制标准曲线，如图5所示。
生化仪检测的吸光度值如表4所示：
表4生化仪检测吸光度值
注：本发明确定了各试剂组最适配的PEG浓度。当各试剂组PEG浓度大于最适浓度时，会导致阈值上升；当PEG浓度小于最适浓度时，会导致检测灵敏度下降，同时阈值也会下降。由此确定了上表中的最适浓度。
从图5可以看出，粒径越大的聚苯乙烯羧基微球对于样本扩增产物的检测灵敏度也越高。根据不同粒径聚苯乙烯羧基微球的检测能力设定不同的可信范围：309nm偶联链霉亲和素的聚苯乙烯羧基微球测得的核酸浓度的可信范围为5～250copies/μl，147nm偶联链霉亲和素的聚苯乙烯羧基微球测得的核酸浓度的可信范围为250～5000copies/μl，88nm偶联链霉亲和素的聚苯乙烯羧基微球测得的核酸浓度的可信范围为1000～10000copies/μl。
4.3绘制不同基质的校准品检测校准曲线
采用三种偶联链霉亲和素的聚苯乙烯羧基微球试剂组，按照上述实验中筛选出的肺炎克雷伯菌质粒浓度配制成校准品，校准品包含肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)的保守序列质粒、器官保存液基质、5％牛血清及防腐剂(1％叠氮化钠)。其中器官保存液基质为使用上海健耕医药股份有限公司的器官保存液或/>器官保存液作为校准品的基础基质，并加入5％牛血清，防腐剂可选叠氮钠、硫柳汞、ProClin300制备得到。每组校准品浓度范围不同，如表5所示：
表5不同灵敏度试剂组的校准品浓度范围
检测前，按表6数据设置设备参数：
表6设备参数
波长 546nm/无(主/副) 标本 20μl 反应方法 两点终点法
比色杯光径 1cm R1 100μl 校准类型 Spline/Logit-log(4p)
反应温度 37℃ R2 100μl 反应方向 向上
反应步骤如下：
(1)制备KPS基质以及SPS基质的浓度梯度的校准品溶液并按表5浓度范围分为三组，每组包括两种基质溶解的浓度梯度核酸溶液；
(2)将20μl(1)中的三组校准品溶液与100μl R1混匀，37℃孵育3-5min；
(3)将(2)中的三组混合液分别与100μl三组不同灵敏度R2混匀，37℃孵育20s后，置于生化仪，读取吸光度A1；
(4)37℃孵育5min后，置于生化仪，读取吸光度A2；
(5)计算得到ΔA(生化仪检测吸光度值)＝A2-A1，结果如表7所示。
表7生化仪检测结果
绘制KPS和SPS两种基质溶解的校准品在本发明中的检测校准曲线，如图6所示。使用以上方法，可以快速对样本进行定性，例如当ΔA＞200时，则可以判定该样本为肺炎克雷伯菌阳性。ΔA的具体取值标准，本领域技术人员可以根据本说明书记载或阴性样本对照结合公知常识来判定。
4.4临床样本检测以及与qPCR检测效果进行比较
采用qPCR方法作为对照，同时与本发明的方法一起检测12例KPS基质样本和28例SPS基质样本，每组样本中都含有肺炎克雷伯菌阴性和阳性，KPS基质校准品定标的试剂只检测12例KPS基质样本(其中，天然样本8例，人工添加肺炎克雷伯菌样本4例)，SPS基质校准品定标的试剂只检测28例SPS基质样本(其中，天然样本22例，人工添加肺炎克雷伯菌样本6例)。对于qPCR检测的结果，为了避免取样等人为因素造成的结果偏差，暂定对于Ct值<38(对应样本约为5copies/μl)为有效样本。
具体的反应步骤如下：
(1)将20μl含核酸的样本溶液与100μl R1混匀，37℃孵育3-5min；
(2)将(1)中的混合液分别与100μl三组不同灵敏度R2混匀，37℃孵育20s后，置于生化仪，读取吸光度A1；
(3)37℃孵育5min后，置于生化仪，读取吸光度A2；
(4)计算得到ΔA(生化仪检测吸光度值)＝A2-A1，结果如表8所示。
计算以及分析过程如下：
(1)利用不同粒径的聚苯乙烯羧基微球的线性标准曲线，将ΔA代入计算得到样品中肺炎克雷伯菌的核酸浓度；
(2)将不同粒径微球测得的核酸浓度与其可信范围相比较，取落在可信范围内的核酸浓度为最终报告值；
(3)若有多个粒径微球测得的核酸浓度均落在其可信范围内，则以线性范围更宽的微球测得的核酸浓度为最终报告值。
可信范围：实施例4中低灵敏度试剂组报告1000-100000copies/μl范围内的结果；中灵敏度试剂组报告250～5000copies/μl范围内的结果；高敏试剂组报告5～250copies/μl范围内的结果。
表8临床样本检测结果
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上表中应用qPCR检测方法以及本发明检测方法，检测的样本报告值低于5copies/μl的，不在检测方法线性范围内，其检测结果为肺炎克雷伯菌阴性。从阴阳性符合率比较可以看到本发明检测方法与qPCR方法在40例样本中仅有1例(SPS基质样本21号)存在不同，阴阳性符合率达到97.5％。
与传统的qPCR方法测得的结果做Passing-Bablok比对分析，分析结果如图7所示，本发明检测方法与传统的qPCR方法比相关性较好，本实例检测40个样本相关系数r达到0.981。
从上述实施例可知本发明的肺炎克雷伯菌核酸检测试剂盒具快速、方便，可产业化等优势，相比传统的qPCR方法检测核酸来说检测时间上大幅度缩短，对需要快速检测场景的情况下样本有很大的优势和前景。

Claims (10)

1.一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒除包括一对用于特异性扩增肺炎克雷伯菌的引物对外，还包括至少两种粒径的聚苯乙烯羧基微球，使其在线性范围内可以定量检测所述肺炎克雷伯菌；
其中，所述引物对包含正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对的正向引物和/或反向引物的5’端和/或3’端缀合有标记物；所述聚苯乙烯羧基微球偶联有能与标记物特异性结合的分子，以实现定性和/或定量检测；
优选地，所述标记物为生物素，与标记物特异性结合的分子为链霉亲和素。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增酶、醋酸镁、促凝剂、防腐剂、封闭剂、离子稳定剂、微球储存液和缓冲液中的一种或多种；
优选地，所述试剂盒还包括以下一种或多种：
(1)所述扩增酶为RPA酶组合，其包括结合单链核酸的重组酶、重组酶辅助因子、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶和肌酸激酶；
(2)所述促凝剂选自聚乙二醇、壳聚糖、葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种；所述聚乙二醇优选PEG25000；
(3)所述防腐剂选自叠氮化钠、硫柳汞和ProCline 300中的一种或多种；
(4)所述封闭剂选自酪蛋白、甘氨酸和BSA中的一种或多种；
(5)所述离子稳定剂选自0.4～2％NaCl、KCl和MgCl2中的一种或多种，优选0.9％NaCl；
(6)所述微球储存液选自50～500mM Tris、HEPES和PBS缓冲液，pH6.5～7.8；优选100mMPBS，pH 7.4；
(7)所述缓冲液为10～500mM Tris或PBS，pH 6.5～8.8；优选10mM Tris，pH8.0。
4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述聚苯乙烯羧基微球的粒径为88±5nm和309±5nm；
优选地，所述试剂盒还包括粒径为147±5nm的聚苯乙烯羧基微球；
更优选地，所述聚苯乙烯羧基微球的粒径分别为88nm、147nm和309nm。
5.一种用于特异性扩增肺炎克雷伯菌的引物对，其特征在于，所述引物对包含正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
6.一种对样品中是否包含肺炎克雷伯菌进行定性的方法，其特征在于，使用如权利要求1-4任一项所述的试剂盒进行检测，其包括以下步骤：
(1)使用引物对和扩增酶对样品中的核酸进行扩增；
(2)加入不同粒径聚苯乙烯羧基微球和链霉亲和素，读取吸光度A1数据组；
(3)凝集反应后，再次进行吸光度检测，读取A2数据组，并计算每组对应的ΔA＝A2-A1；
(4)若ΔA＞x，则判定样品中存在肺炎克雷伯菌，所述x为实际检测定量限所对应的ΔA的值。
7.一种对样品中的肺炎克雷伯菌进行相对定量的方法，其特征在于，使用如权利要求1-4任一项所述的试剂盒进行检测，步骤是：
(1)使用引物对和扩增酶对样品中的核酸进行扩增；
(2)加入不同粒径的聚苯乙烯羧基微球和链霉亲和素，读取吸光度A1数据组；
(3)凝集反应后，再次进行吸光度检测，读取A2数据组，并计算每组对应的ΔA＝A2-A1；
(4)利用不同粒径的聚苯乙烯羧基微球的线性标准曲线，将ΔA代入，计算得到样品中肺炎克雷伯菌的核酸浓度；
(5)将不同粒径微球测得的核酸浓度与其可信范围相比较，取落在可信范围内的核酸浓度作为最终报告值；
优选地，所述(5)中，若有多个不同粒径微球测得的核酸浓度均落在其可信范围内，则以线性范围更宽的微球测得的核酸浓度为最终报告值。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下条件的一种或多种：
(i)提取样品中的核酸，以用于所述扩增；
(ii)在提取的核酸中加入如权利要求1-4中任一项所述的试剂盒所定义的激活剂；
(iii)试剂盒中的标记物与标记物特异性结合的分子结合，产生凝集反应；
(iv)所述凝集反应在37℃下进行3-6min；
优选地，所述(i)中，将1份样本和4-5份0.5％SDS等渗葡萄糖溶液混合；并加入4-5份0.1M KOH，0.5mM EDTA混合；置于80-100℃金属浴孵育2-10min，例如90℃金属浴中孵育5min；静置待絮状沉淀析出后取上清即得样品中的核酸。
9.如权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，所述聚苯乙烯羧基微球与标记物特异性结合的分子结合包括以下步骤：
(a)将聚苯乙烯羧基微球以1％浓度分散在MES中，加入NHS和EDC，反应；
(b)离心弃上清，用缓冲液例如HEPES重悬浮超声；
(c)加入链霉亲和素，反应；
(d)加入封闭剂例如1％BSA终止偶联反应；
(e)离心弃上清，用微球储存液重悬浮超声，制成偶联有链霉亲和素的聚苯乙烯羧基微球溶液。
10.一种如权利要求5所述的引物对或权利要求1-4中任一项所述的试剂盒在检测样品中肺炎克雷伯菌中的应用。
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