CN117327816A - 一种特异性扩增鲍曼不动杆菌的引物对及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特异性扩增鲍曼不动杆菌的引物对及其应用，所述引物对包含正向引物和反向引物，所述正向引物的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明可以实现对待检测核酸样品中是否含有鲍曼不动杆菌的快速定性检测以及快速相对定量检测，且本发明检测方法与传统的qPCR方法的阴阳性符合率几乎达到100％，相关性较好，相关系数r达到0.964。

Description

一种特异性扩增鲍曼不动杆菌的引物对及其应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体地涉及一种特异性扩增鲍曼不动杆菌的引物对及其应用。
背景技术
鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanniie)非发酵需氧革兰阴性球杆菌，属于莫拉菌科，可以引起院内感染的机会致病菌，主要可引起菌血症，泌尿道感染，继发性脑膜炎或是由于诸如使用导尿管和呼吸机而引起的其他感染。过去被认为是一种低风险的病原菌，直到2010年在日本东京帝京大学医学部附属医院的第一次大规模暴发才引起日本当局以及全世界的重视。之后的很多研究都表明鲍曼不动杆菌是造成医院感染的重要条件致病菌，也是造成肺炎和败血症的常见病原体。此外，多重耐药及泛耐药鲍曼不动杆菌检出比例日益增高，以致于临床上可供选择的抗生素越来越少，很多患者甚至已无药可用。鲍曼不动杆菌感染常见于危重患者，常伴有其他细菌和(或)真菌的感染。鲍曼不动杆菌感染患者病死率高。目前已发展至多重耐药鲍曼不动杆菌(MDRAB)、广泛耐药鲍曼不动杆菌(XDRAB)、全耐药鲍曼不动杆菌(PDRAB)。2010年中国CHINET监测数据显示不动杆菌对头孢哌酮/舒巴坦耐药率为30.7％、米诺环素为31.2％。目前，临床上耐药细菌的检测主要通过纸片扩散法、试纸条和自动化微生物系统方法检测药敏试验的结果，或者采用PCR的方法检测耐药基因。常规药敏试验通常需要24h才能报告结果，而PCR的方法虽然用时短但较为繁琐，对实验室要求太高，不适合在临床推广。
胶乳增强免疫比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后,直接测定反应液的吸光度值,省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。
RPA等温扩增技术，也称重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymeraseamplification，RPA)是2006年Piepenburg等人利用参与细胞DNA合成的蛋白重组和修复开发出的一种新的核酸恒温扩增技术，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。RPA的反应过程首先是重组酶与引物结合，形成蛋白-DNA复合物，然后蛋白-DNA复合物在双链DNA寻找同源序列。一旦引物寻找到目标同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，针对模板上的靶序列在数分钟之内完成指数级别的扩增。而被替换的DNA链与SSB(单链DNA结合蛋白)结合，保持DNA维持单链状态，防止被核酸酶水解这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右，只需少量的样本制备，即可在10min内扩增低至1-10个DNA拷贝，具有高灵敏度、可选择性、便携性、快速与可以进行多重扩增等优点。
发明内容
本发明在胶乳增强技术的原理上进行创新，利用全自动生化平台上结合核酸等温扩增技术进行了一种全新的尝试。将市面上几乎所有全自动生化仪都自带的恒温孵育模块对核酸样本进行恒温扩增，将扩增后产物(每个扩增产物两端各连接一个生物素)通过与偶联有链霉亲和素的胶乳微球特异性结合形成多个胶乳-扩增产物聚集体，从而形成浊度被生化仪检测到；该技术不但可以快速解决普通核酸检测样本的时间限制，还具备胶乳增强比浊技术的高灵敏特性，从而具备了高灵敏检测核酸分子的能力。
为解决现有技术中缺乏检测鲍曼不动杆菌的问题，本发明提供了一种特异性扩增鲍曼不动杆菌的引物对及其应用。
本发明通过以下技术方案实现上述问题：
本发明的第一方面提供一种用于特异性扩增鲍曼不动杆菌的引物对，所述引物对包含正向引物和反向引物，所述正向引物的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的第二方面提供一种用于检测鲍曼不动杆菌的试剂盒，所述试剂盒除包括如本发明第一方面所述的引物对外，还包括至少两种粒径的聚苯乙烯羧基微球，使其在线性范围内可以定量检测所述鲍曼不动杆菌。
在本发明一些具体实施方案中，所述引物对的正向引物和/或反向引物的5’端和/或3’端缀合有标记物；所述聚苯乙烯羧基微球偶联有可以与标记物特异性结合的分子，以实现定性和/或定量检测。
在本发明一些较佳实施方案中，所述标记物为生物素，与标记物特异性结合的分子为链霉亲和素。
在本发明一些具体实施方案中，所述试剂盒还包括扩增酶、醋酸镁、促凝剂、防腐剂、封闭剂、离子稳定剂、微球储存液和缓冲液中的一种或多种。
在本发明另一些具体实施方案中，所述试剂盒包括以下一种或多种：
(1)所述扩增酶为RPA酶组合，其包括结合单链核酸的重组酶单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶；优选还包括重组酶辅助因子和肌酸激酶；
(2)所述促凝剂选自聚乙二醇PEG、壳聚糖、葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种；
(3)所述防腐剂选自叠氮化钠、硫柳汞和ProClin300中的一种或多种；
(4)所述封闭剂选自酪蛋白、甘氨酸和BSA中的一种或多种；
(5)所述离子稳定剂选自0.4～2％ NaCl、KCl和MgCl2中的一种或多种，优选0.9％NaCl；
(6)所述微球储存液选自50～500mM Tris、HEPES和PBS缓冲液，pH6.5～7.8；优选100mM PBS，pH7.4；
(7)所述缓冲液为10～500mM Tris或PBS，pH6.5～8.8；优选10mM Tris，pH8.0。
在本发明一些具体实施方案中，所述至少两种粒径的聚苯乙烯羧基微球的粒径为88±5nm和309±5nm。
优选地，所述试剂盒还包括粒径为147±5nm的聚苯乙烯羧基微球；
更优选地，所述聚苯乙烯羧基微球的粒径分别为88nm、147nm和309nm。
本发明的第三方面提供一种对样品中是否包含鲍曼不动杆菌进行定性的方法，使用如本发明第二方面所述的试剂盒进行检测，其包括以下步骤：
(1)使用引物对和扩增酶对样品中的核酸进行扩增，
(2)加入最大粒径聚苯乙烯羧基微球和地高辛抗体，读取吸光度A1数据组，
(3)凝集反应后，再次进行吸光度读取A2数据组，并计算每组对应的ΔA＝A2-A1,
(4)若ΔA>X，则判定样品中存在鲍曼不动杆菌，所述X为实际检测定量限所对应的ΔA的值；例如ΔA＞200时，则可以判定该样本为鲍曼不动杆菌阳性。
本发明的第四方面提供一种对样品中的鲍曼不动杆菌进行相对定量的方法，使用如本发明第二方面所述的试剂盒进行检测，步骤是：
(1)使用引物对和扩增酶对样品中的核酸进行扩增；
(2)加入不同粒径聚苯乙烯羧基微球和地高辛抗体，读取吸光度A1数据组；
(3)凝集反应后，再次进行吸光度读取A2数据组，并计算每组对应的ΔA＝A2-A1；
(4)利用不同粒径的聚苯乙烯羧基微球的线性标准曲线，将ΔA代入计算得到样品中鲍曼不动杆菌的核酸浓度；
(5)将不同粒径微球测得的核酸浓度与其可信范围相比较，取落在可信范围内的核酸浓度为最终报告值；
优选地，所述步骤(5)中，若有多个不同粒径微球测得的核酸浓度均落在其可信范围内，则以线性范围更宽的微球测得的核酸浓度为最终报告值。
在本发明一些具体实施方案中，所述方法包括以下条件的一种或多种：
(i)提取样品中的核酸，以用于所述扩增；
(ii)在提取的核酸中加入如本发明第二方面所述的试剂盒所述的激活剂；
(iii)所述标记物与标记物特异性结合的分子结合，产生凝集反应；
(iv)所述凝集反应在37℃下进行3-6min；
优选地，所述(i)中，将1份样本和4-5份0.5％ SDS等渗葡萄糖溶液混合；并加入4-5份0.1M KOH，0.5mM EDTA混合；置于80-100℃金属浴孵育2-10min，例如90℃金属浴中孵育5min；静置待絮状沉淀析出后取上清即得样品中的核酸。
在本发明另一些具体实施方案中，所述聚苯乙烯羧基微球与标记物特异性结合的分子结合包括以下步骤：
(a)将聚苯乙烯羧基微球以1％浓度分散在MES中，加入NHS和EDC，反应；
(b)离心弃上清，用缓冲液例如HEPES重悬浮超声；
(c)加入链霉亲和素，反应；
(d)加入封闭剂例如1％BSA终止偶联反应；
(e)离心弃上清，用微球储存液冲悬浮超声，制成偶联有链霉亲和素的聚苯乙烯羧基微球溶液。
本发明的第五方面提供一种如本发明第一方面所述的引物对或本发明第二方面所述的试剂盒在检测样品中鲍曼不动杆菌中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1、应用本发明可以实现对待检测核算样品中是否含有鲍曼不动杆菌的快速定性检测。
2、应用本发明可以实现对待检测核酸样品中是否含有鲍曼不动杆菌的快速定性检测以及快速相对定量检测，且本发明检测方法与传统的qPCR方法的阴阳性符合率几乎达到100％，相关性较好，相关系数r达到0.964。
附图说明
图1显示了不同碱解试剂处理后的样本核酸提取效果；其中，
M为Marker；1为金黄色葡萄球菌；2为铜绿假单胞菌；3为鲍曼不动杆菌；4为肺炎克雷伯菌；5为米根霉；6为卷枝毛霉菌。
图2显示了不同核酸提取方法提取的核酸在qPCR反应中的表现。
图3显示了不同引物对对鲍曼不动杆菌的扩增效果；其中，M为Marker。
图4显示了不同引物对浓度对鲍曼不动杆菌的扩增效果；其中，
M为Marker；1为引物浓度为0.6μM，2为引物浓度为0.5μM，3为引物浓度为0.2μM，4为引物浓度为0.1μM。
图5显示了不同粒径聚苯乙烯羧基微球检测校准品的校准曲线。
图6显示了KPS和SPS基质溶解的校准品的校准曲线；其中，
图6A显示了KPS和SPS基质溶解的校准品在低敏试剂组中的校准曲线；
图6B显示了KPS和SPS基质溶解的校准品在中敏试剂组中的校准曲线；图6C显示了KPS和SPS基质溶解的校准品在高敏试剂组中的校准曲线。
图7显示了本发明检测方法与传统qPCR检测方法的Passing-Bablok回归分析结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
试剂准备：
1、校准品：包含鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的保守序列质粒和器官保存液基质、血清及防腐剂(0.1％叠氮化钠)；
2、样本释放试剂(细菌提取剂)包含有包含有SDS、KOH、EDTA等；
样本释放剂1：0.5％ SDS等渗葡萄糖溶液
样本释放剂2：0.1M KOH，0.5mM EDTA
3、样本保存液：Tris-HCl缓冲液，pH8.0
4、激活剂：150mM醋酸镁(MgOAc)
核酸提取操作步骤：
(1)取20μl样本，加入到95μl的样本释放剂1，涡旋混匀；
(2)再加入95μl样本释放剂2，涡旋混匀；
(3)置于90℃金属浴中孵育5min；
(4)随后室温静置使温度恢复至室温，有SDS絮状沉淀析出，置于离心机10000rpm离心2min，取上清加入样本保存液即可得到提取的基因组溶液。(注：可将提取后的基因组溶液放在-80℃保存以备下次使用，也可直接进行下一步生化仪的检测)
实施例1样本核酸提取方法的优化
1.1碱试剂的优化
分别对真菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌株进行样本初提方法测试。对于碱试剂的选择，选择0.1M氢氧化钠(NaOH)和0.1M氢氧化钾(KOH)作为待测试剂，其余步骤与样本释放剂处理菌株方法一致。对于提取的菌株样本DNA进行PCR扩增验证。
对于细菌验证的引物对选择16sDNA-F/R，其正向引物核酸序列如SEQ ID NO:3所示，其反向引物核酸序列SEQ ID NO:4所示。对于真菌验证的引物对选择ITS1/ITS4引物对，其正向引物核酸序列如SEQ ID NO:5所示，其反向引物核酸序列如SEQ ID NO:6所示。
SEQ ID NO:3：
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；
SEQ ID NO:4：
AAGGAGGTGATCCAGCCGCA；
SEQ ID NO:5：
TCCGTAGGTGAACCTGCGG；
SEQ ID NO:6：
TCCTCCGCTTATTGATATGC。
PCR扩增的体系和扩增程序如下表1和表2：
表1 PCR鉴定扩增体系
试剂 体积(μl)
PCR buffer 20.3
5μM正向引物 2
5μM反向引物 2
模板 2.5
Tap酶 0.2
表2 PCR鉴定扩增程序
对于扩增的结果用2％的琼脂糖凝胶进行鉴定，结果见图1，可知对于裂解试剂中的碱解试剂选择氢氧化钾(KOH)可对提取起到显著作用。
1.2样本核酸提取方法的优化
方案1：取20μl样本，加入到100μl的0.5％ SDS溶液中，涡旋混匀；再加入100μl0.1M KOH溶液，涡旋混匀，置于90℃金属浴中孵育5min；随后室温静置使温度恢复至室温，有SDS絮状沉淀析出，置于离心机10000rpm离心2min，取上清加入pH8.0的Tris-HCl缓冲液即可得到提取的基因组溶液。
方案2：取20μl样本，加入到95μl的0.5％ SDS溶液中，涡旋混匀；再加入95μl 0.1MKOH溶液，涡旋混匀；再加入10μl 10mM EDTA置于90℃金属浴中孵育5min；随后室温静置使温度恢复至室温，有SDS絮状沉淀析出，置于离心机10000rpm离心2min，取上清加入pH8.0的Tris-HCl缓冲液即可得到提取的基因组溶液。
方案3：取20μl样本，加入95μl的样本释放剂1，涡旋混匀；再加入95μl样本释放剂2，涡旋混匀；置于90℃金属浴中孵育5min；随后室温静置使温度恢复至室温，有絮状沉淀析出，置于离心机10000rpm离心2min，取上清加入样本保存液即可得到提取的基因组溶液。
对于上述方案，用qPCR进行检测，qPCR引物对为AB-F与AB-R，其正向引物的核酸序列如SEQ ID NO:7所示，反向引物的核酸序列如SEQ ID NO:8所示。检测结果见表3和图2，可知对于方案3的稳定性和Ct值均较好。
SEQ ID NO:7：
CAACAACCTTGACATTGAAGACATC；
SEQ ID NO:8：
TAGATGAATGGCTGACCTACAG；
表3 qPCR结果统计
Ct值 方差
方案1 28.58 0.01
方案2 24.4 0.01
方案3 24.36 0.05
实施例2RPA扩增的优化
2.1对于RPA酶扩增引物的优化
对于快速扩增反应体系，对应引物的进行优化，引物对分别选择AB-1引物对，其正向引物的核酸序列如SEQ ID NO:9所示，反向引物的核酸序列如SEQ ID NO:10所示；AB-2引物对，其正向引物的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物的核酸序列如SEQ ID NO:2所示；AB-3引物对，其正向引物的核酸序列如SEQ ID NO:11所示，反向引物的核酸序列如SEQID NO:12所示。
SEQ ID NO:1：
CTTGTAAGCAAACTGTGCCTCTTGCTGAGG；
SEQ ID NO:2：
ACATGACCCTAGGCGATGCTATGAAAGCTTC；
SEQ ID NO:9:
ACGGTAATTAGTGTGATCTGACGAAGACACT；
SEQ ID NO:10：
CACTGTGCACTTAAGCACTGTACAGCTTCAATCG；
SEQ ID NO:11：
TATCACAACAACCTTGACATTGAAGACATCAAC；
SEQ ID NO:12：
ATTGCACGAGCAAGAACAGGGTTTACTTTGT。
其余体系均不变，步骤如下：
(1)取5μl样本中，加入5μl激活剂混匀。
(2)RPA酶体系为25μl，10mM dNTP 8μl，正反向引物，补水至40μl。
(3)将第一步的混有激活剂的样本加入到反应体系中，涡旋混匀，37℃恒温孵育10min。
反应结束后用2％琼脂糖凝胶电泳验证，结果见图3，可以看出当引物对AB-2得到的条带亮度和扩增的特异性最高，因此后续选择AB-2作为反应扩增选用的引物对。
2.2对于RPA酶扩增反应体系的优化
对于快速扩增反应体系，对应引物的浓度进行体系优化，AB-2引物对在反应体系中的浓度分别为：0.6μM，0.5μM，0.2μM，0.1μM。分别对应的10μM引物反应体积为：3μl，2.5μl，1μl，0.5μl。
其余体系均不变，步骤如下：
(1)取5μl样本中，加入5μl激活剂混匀。
(2)RPA酶体系为25μl，10mM dNTP 8μl，正反向引物，补水至40μl。
(3)将第一步的混油激活剂的样本加入到反应体系中，涡旋混匀，37℃恒温孵育10min。
反应结束后用2％琼脂糖凝胶电泳验证，结果见图4，可以看出当引物浓度为0.6μM时的条带大小和亮度最合适，因此选择反应体系的引物浓度为0.6μM。
实施例3制备偶联有链霉亲和素(SA)的聚苯乙烯羧基微球
其制备有以下步骤：
使用官能团为羧基的聚苯乙烯羧基微球(北京博尔迈生物技术有限公司)通过NHS(N-羟基丁二酰亚胺)和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的活化后，再与链霉亲和素上的氨基偶联形成酰胺反应，本发明采用的偶联方法如下：
(1)将10mg羧基胶乳微球(粒径采用88nm、147nm、220nm、309nm微球4个实验组)分散在1mL MES(pH6.1)中(微球浓度1％)，加入50mgNHS(N-羟基丁二酰亚胺)和10mgEDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)，于室温反应45mins；
(2)12000rmp离心30mins弃去上清，用HEPES(pH 7.4)重悬浮超声；
(3)加入1.2mg/mL链霉亲和素,搅拌反应1.5h；
(4)加入1％的BSA进行封闭终止偶联反应，封闭过夜；
(5)12000rmp离心30mins弃去上清，用微球储存液重悬浮超声，制成偶联有链霉亲和素(SA)的聚苯乙烯羧基微球溶液；
得到的偶联有链霉亲和素的聚苯乙烯羧基微球储存在微球储存液中，微球储存液配方为：
100mM HEPES缓冲液(pH7.5),0.9％ NaCl、0.5％海藻糖，0.1％ BSA，0.1％ProClin300
实施例4使用试剂盒检测不同浓度鲍曼不动杆菌
4.1试剂盒试剂准备
1、主试剂R1包含扩增用的正向引物、反向引物、dNTP、RPA酶组合、促凝剂、防腐剂和缓冲液，其中：
缓冲液：10mM Tris-Hcl pH 8.0
引物：0.6μM AB2-F(正向引物)、0.6μM AB2-R(反向引物)
扩增酶组合及底物：10mM dNTP溶液，聚合酶(Bsu DNA polymerase，翌圣生物，货号：11078ES72)，重组酶(T4 UvsX Recombinase，翌圣生物，货号：11079ES60)，重组酶辅助因子(T4 UvsY Protein，翌圣生物，货号：11080ES60)，单链结合蛋白(T4 gene 32protein，翌圣生物，货号：11081ES72)，肌酸激酶(Creatine Kinase，翌圣生物，货号：14502ES05)；
稳定剂：0.9％NaCl、0.2％KCl
促凝剂：PEG 8000(不同浓度可以调控促凝反应的强度，可调整；实例中为调整后最优浓度)
防腐剂：0.1％ ProCline 300
2、主试剂R2包含偶联有链霉亲和素(SA)的聚苯乙烯羧基微球、地高辛单克隆抗体、离子稳定剂、蛋白稳定剂、防腐剂和缓冲液，其中：
R2(低灵敏试剂组)为88nm偶联有链霉亲和素的聚苯乙烯羧基微球溶液；
R2(中灵敏试剂组)为147nm偶联有链霉亲和素的聚苯乙烯羧基微球溶液；
R2(高灵敏试剂组)为309nm偶联有链霉亲和素的聚苯乙烯羧基微球溶液；
缓冲液：(50～500mM，优选100mM)(Tris、HEPES、PBS、EDTA,优选PBS)pH6.5～7.8,优选pH 7.4
离子稳定剂：(浓度可选范围0.4～2％，优选0.9％)(可选NaCl、KCl、MgCl2，优选NaCl)
蛋白稳定剂：0.5％海藻糖
封闭剂：酪蛋白、甘氨酸、BSA等，优选0.1％BSA
防腐剂：可选叠氮钠、硫柳汞、ProClin300，优选0.1％ ProClin300
地高辛单克隆抗体：1μg/mL
4.2绘制不同粒径聚苯乙烯羧基微球测定校准品核酸浓度的标准曲线其步骤包括：
(1)全自动生化仪(日立，7180)参数设置为：主波长546nm；
(2)将20μl浓度梯度的校准品分为三组，与100μl R1混匀，37℃孵育3-5min；
(3)将(2)中三组混合液分别与100μl三组不同灵敏度R2，37℃孵育20s后，置于生化仪，读取吸光度A1；
(4)37℃孵育5min后，置于生化仪，读取吸光度A2；
(5)计算得到ΔA(生化仪检测吸光度值)＝A2-A1。
(6)以校准品浓度梯度为横坐标，以ΔA值为纵坐标绘制标准曲线。
实验结果见表4和图5
表4吸光度值
本发明中，粒径越大的胶乳微球表现出对于样本扩增后产物的检测灵敏度也越高。使用309nm胶乳微球偶联的链霉亲和素最高可以检测到质粒校准品大约5copies/μl左右的样本，但越大的微球的线性越窄，根据不同粒径聚苯乙烯羧基微球的检测能力设定不同的可信范围：使用88nm微球试剂组测得的核酸浓度可信范围为≥1000copies/μl；使用147nm微球试剂组测得的核酸浓度可信范围为100～5000copies/μl；使用309nm微球试剂组测得的核酸浓度可信范围为5～500copies/μl。
4.3绘制不同基质的校准品检测较准曲线
采用三种胶乳微球粒径偶联链霉亲和素的试剂组，按照上述实验中筛选出的鲍曼不动杆菌质粒浓度配制成三组校准品(含KPS或SPS、5％牛血清、鲍曼不动杆菌特异性序列质粒、防腐剂)，每组校准品浓度范围不同，如表5；
表5不同灵敏度试剂组的校准品浓度范围
检测前，按表6数据设置设备参数：
表6设备参数
反应步骤如下：
(1)制备KPS基质以及SPS基质的浓度梯度的校准品溶液并按表5浓度范围分为三组，每组包括两种基质溶解的浓度梯度核酸溶液；
(2)将20μl(1)中的三组校准品溶液与100μl R1混匀，37℃孵育3-5min；
(3)将(2)中的三组混合液分别与100μl三组不同灵敏度R2混匀，37℃孵育20s后，置于生化仪，读取吸光度A1；
(4)37℃孵育5min后，置于生化仪，读取吸光度A2；
(5)计算得到ΔA(生化仪检测吸光度值)＝A2-A1，结果如表7所示。
表7生化仪检测结果
绘制KPS和SPS两种基质溶解的校准品在本发明中的检测较准曲线，如图6所示。使用以上方法，可以快速对样本进行定性，例如当ΔA＞200时，则可以判定该样本为鲍曼不动杆菌阳性。ΔA的具体取值标准，本领域技术人员可以根据本说明书记载或阴性样本对照结合公知常识来判定。
4.4临床样本检测以及与qPCR检测效果进行比较
采用qPCR方法作为对照，同时与本发明的方法一起检测15例KPS基质样本和30例SPS基质样本，每组样本中都含有鲍曼不动杆菌阴性或阳性，KPS基质校准品定标的试剂只检测15例KPS基质样本(其中，天然样本6例，人工添加非鲍曼不动杆菌的阴性样本5例，人工添加鲍曼不动杆菌的阳性样本4例)，SPS基质校准品定标的试剂只检测30例SPS基质样本(其中，天然样本16例，人工添加非鲍曼不动杆菌的阴性样本5例，人工添加鲍曼不动杆菌的阳性样本9例)。对于qPCR检测的结果，为了避免取样等人为因素造成的结果偏差，暂定对于Ct值<38(对应样本约为5copies/μl)为有效样本。
具体的反应步骤如下：
(1)将20μl含核酸的样本溶液与100μl R1混匀，37℃孵育3-5min；
(2)将(1)中的混合液分别与100μl三组不同灵敏度R2混匀，37℃孵育20s后，置于生化仪，读取吸光度A1；
(3)37℃孵育5min后，置于生化仪，读取吸光度A2；
(4)计算得到ΔA(生化仪检测吸光度值)＝A2-A1。
计算以及分析过程如下：
(1)利用不同粒径的聚苯乙烯羧基微球的线性标准曲线，将ΔA代入计算得到样品中鲍曼不动杆菌的核酸浓度；
(2)将不同粒径微球测得的核酸浓度与其可信范围相比较，取落在可信范围内的核酸浓度为最终报告值；
(3)若有多个不同粒径微球测得的核酸浓度均落在其可信范围内，为防止报告结果落在有些组的hook效应区段中，应以线性范围更宽的组作为报告组。
可信范围：低灵敏度试剂组报告5000copies/μl以上结果；中灵敏度试剂组报告250～5000copies/μl范围内的结果；高敏试剂组报告5～250copies/μl范围内的结果。
得到的数据结果如表8所示：
表8临床样本检测结果
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注：KPS基质中7-11号样本为KPS基质的阴性样本中加入其它非目标检测阴性菌株，对应编号添加的菌株分别为：7号为大肠杆菌，8号为肺炎克雷伯菌，9号为铜绿假单胞菌，10号为金黄色葡萄球菌，11号为表皮葡萄球菌。SPS基质样本中17-21号样本为KPS基质的阴性样本中加入其它非目标检测阴性菌株，对应编号添加的菌株分别为：17号为大肠杆菌，18号为肺炎克雷伯菌，19号为铜绿假单胞菌，20号为金黄色葡萄球菌，21号为表皮葡萄球菌。
上表中应用qPCR检测方法以及本发明检测方法的报告值低于5copies/μl的样品，不在检测方法线性范围内，其检测结果均为鲍曼不动杆菌阴性。从阴阳性符合率比较可以看到本发明检测方法与qPCR方法在45例样本的阴阳性符合率几乎达到100％。
与传统的qPCR方法测得的结果做Passing-Bablok比对分析，分析结果如图7所示，本发明检测方法与传统的qPCR方法比相关性较好，本实例检测45个样本相关系数r达到0.964。
从上述实施例可知本发明的鲍曼不动杆菌核酸检测试剂盒具快速、方便，可产业化等优势，相比传统的qPCR方法检测核酸来说检测时间上大幅度缩短，对需要快速检测场景的情况下样本有很大的优势和前景。

Claims (10)

1.一种用于特异性扩增鲍曼不动杆菌的引物对，其特征在于，所述引物对包含正向引物和反向引物，所述正向引物的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种用于检测鲍曼不动杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒除包括如权利要求1所述的引物对外，还包括至少两种粒径的聚苯乙烯羧基微球，使其在线性范围内可以定量检测所述鲍曼不动杆菌。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对的正向引物和/或反向引物的5’端和/或3’端缀合有标记物；所述聚苯乙烯羧基微球偶联有可以与标记物特异性结合的分子，以实现定性和/或定量检测；
优选地，所述标记物为生物素，与标记物特异性结合的分子为链霉亲和素。
4.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增酶、醋酸镁、促凝剂、防腐剂、封闭剂、离子稳定剂、微球储存液和缓冲液中的一种或多种；
优选地，所述试剂盒包括以下一种或多种：
(1)所述扩增酶为RPA酶组合，其包括结合单链核酸的重组酶单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶；优选还包括重组酶辅助因子和肌酸激酶；
(2)所述促凝剂选自聚乙二醇PEG、壳聚糖、葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种；
(3)所述防腐剂选自叠氮化钠、硫柳汞和ProClin300中的一种或多种；
(4)所述封闭剂选自酪蛋白、甘氨酸和BSA中的一种或多种；
(5)所述离子稳定剂选自0.4～2％NaCl、KCl和MgCl2中的一种或多种，优选0.9％NaCl；
(6)所述微球储存液选自50～500mM Tris、HEPES和PBS缓冲液，pH6.5～7.8；优选100mMPBS，pH7.4；
(7)所述缓冲液为10～500mM Tris或PBS，pH6.5～8.8；优选10mM Tris，pH8.0。
5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述至少两种粒径的聚苯乙烯羧基微球的粒径为88±5nm和309±5nm；
优选地，所述试剂盒还包括粒径为147±5nm的聚苯乙烯羧基微球；
更优选地，所述聚苯乙烯羧基微球的粒径分别为88nm、147nm和309nm。
6.一种对样品中是否包含鲍曼不动杆菌进行定性的方法，其特征在于，使用如权利要求2-5任一项所述的试剂盒进行检测，其包括以下步骤：
(1)使用引物对和扩增酶对样品中的核酸进行扩增，
(2)加入不同粒径聚苯乙烯羧基微球和地高辛抗体，读取吸光度A1数据组，
(3)凝集反应后，再次进行吸光度读取A2数据组，并计算每组对应的ΔA＝A2-A1,
(4)若ΔA＞X，则判定样品中存在鲍曼不动杆菌，所述X为实际检测定量限所对应的ΔA的值。
7.一种对样品中的鲍曼不动杆菌进行相对定量的方法，其特征在于，使用如权利要求2-5任一项所述的试剂盒进行检测，步骤是：
(1)使用引物对和扩增酶对样品中的核酸进行扩增；
(2)加入不同粒径聚苯乙烯羧基微球和地高辛抗体，读取吸光度A1数据组；
(3)凝集反应后，再次进行吸光度读取A2数据组，并计算每组对应的ΔA＝A2-A1；
(4)利用不同粒径的聚苯乙烯羧基微球的线性标准曲线，将ΔA代入计算得到样品中鲍曼不动杆菌的核酸浓度；
(5)将不同粒径微球测得的核酸浓度与其可信范围相比较，取落在可信范围内的核酸浓度为最终报告值；
优选地，所述步骤(5)中，若有多个不同粒径微球测得的核酸浓度均落在其可信范围内，则以线性范围更宽的微球测得的核酸浓度为最终报告值。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下条件的一种或多种：
(i)提取样品中的核酸，以用于所述扩增；
(ii)在提取的核酸中加入如权利要求2-5中任一项所述的试剂盒所定义的激活剂；
(iii)所述标记物与标记物特异性结合的分子结合，产生凝集反应；
(iv)所述凝集反应在37℃下进行3-6min；
优选地，所述(i)中，将1份样本和4-5份0.5％SDS等渗葡萄糖溶液混合；并加入4-5份0.1M KOH，0.5mM EDTA混合；置于80-100℃金属浴孵育2-10min，例如90℃金属浴中孵育5min；静置待絮状沉淀析出后取上清即得样品中的核酸。
9.如权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，所述聚苯乙烯羧基微球与标记物特异性结合的分子结合包括以下步骤：
(a)将聚苯乙烯羧基微球以1％浓度分散在MES中，加入NHS和EDC，反应；
(b)离心弃上清，用缓冲液例如HEPES重悬浮超声；
(c)加入链霉亲和素，反应；
(d)加入封闭剂例如1％BSA终止偶联反应；
(e)离心弃上清，用微球储存液冲悬浮超声，制成偶联有链霉亲和素的聚苯乙烯羧基微球溶液。
10.一种如权利要求1所述的引物对或权利要求2-5中任一项所述的试剂盒在检测样品中鲍曼不动杆菌中的应用。
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