CN117327815A - 一种特异性扩增铜绿假单胞菌的引物对及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特异性扩增铜绿假单胞菌的引物对及其应用，应用本发明可以实现对待检测核酸样品中是否含有铜绿假单胞菌的快速定性检测以及快速相对定量检测，且本发明检测方法与传统的qPCR方法的阴阳性符合率达到97.6％，相关性较好，相关系数r达到0.953。

Description

一种特异性扩增铜绿假单胞菌的引物对及其应用
技术领域
本发明属于体外检测领域，具体地涉及一种特异性扩增铜绿假单胞菌的引物对及其应用。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosae)是一种革兰氏阴性菌、好氧、呈长棒形的细菌，属假单胞菌属。它是一种机会性感染细菌，是引起慢性感染和医院内感染的常见病原菌之一。且对植物亦是机会性感染的。一般影响肺部及泌尿道，或造成烧伤、伤口及其他血液感染，如败血病。虽然很不常有，但铜绿假单胞菌亦会造成肺炎。在隐形眼镜清洁不完全的状况下也有机会造成眼睛角膜感染。各国历年的细菌耐药性监测显示该菌是引起院内感染的前几位病原菌，在一些国家或地区检出率可达10.78％，在非发酵菌中占首位。细菌耐药性监测结果显示铜绿假单胞菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率逐步提高。目前，临床上耐药细菌的检测主要通过纸片扩散法、试纸条和自动化微生物系统方法检测药敏试验的结果，或者采用PCR的方法检测耐药基因。常规药敏试验通常需要24h才能报告结果，而PCR的方法虽然用时短但较为繁琐，对实验室要求太高，不适合在临床推广。
胶乳增强免疫比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后,直接测定反应液的吸光度值,省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。
RPA等温扩增技术，也称重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymeraseamplification，RPA)是2006年Piepenburg等人利用参与细胞DNA合成的蛋白重组和修复开发出的一种新的核酸恒温扩增技术，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。RPA的反应过程首先是重组酶与引物结合，形成蛋白-DNA复合物，然后蛋白-DNA复合物在双链DNA寻找同源序列。一旦引物寻找到目标同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，针对模板上的靶序列在数分钟之内完成指数级别的扩增。而被替换的DNA链与SSB(单链DNA结合蛋白)结合，保持DNA维持单链状态，防止被核酸酶水解这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右，只需少量的样本制备，即可在10min内扩增低至1-10个DNA拷贝，具有高灵敏度、可选择性、便携性、快速与可以进行多重扩增等优点。
发明内容
为解决现有技术中缺乏检测铜绿假单胞菌的试剂的问题，本发明提供了一种特异性扩增铜绿假单胞菌的引物对及其应用。
本发明通过以下技术方案实现上述问题：
本发明的第一方面提供一种用于特异性扩增铜绿假单胞菌的引物对，所述引物对包含正向引物和反向引物，所述正向引物的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的第二方面提供一种用于检测铜绿假单胞菌的试剂盒，所述试剂盒除包括如本发明第一方面所述的引物对外，还包括至少两种粒径的聚苯乙烯羧基微球，使其在线性范围内可以定量检测所述铜绿假单胞菌。
在本发明的一些具体的实施方案中，所述引物对的正向引物和/或反向引物的5’端和/或3’端缀合有标记物；所述聚苯乙烯羧基微球偶联有可以与标记物特异性结合的分子，以实现定性和/或定量检测。
在本发明的一些优选实施方案中，所述标记物为生物素，与标记物特异性结合的分子为链霉亲和素；和/或，所述标记物为地高辛，与标志物特异性结合的分子为抗地高辛抗体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒还包括扩增酶、醋酸镁、促凝剂、防腐剂、封闭剂、离子稳定剂、微球储存液和缓冲液中的一种或多种。
在本发明的另一些具体实施方案中，所述试剂盒包括以下一种或多种：
(1)所述扩增酶为RPA酶组合，其包括结合单链核酸的重组酶、重组酶辅助因子、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶和肌酸激酶；
(2)所述促凝剂选自聚乙二醇PEG、壳聚糖、葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种；
(3)所述防腐剂选自叠氮化钠、硫柳汞和ProClin300中的一种或多种；
(4)所述封闭剂选自酪蛋白、甘氨酸和BSA中的一种或多种；
(5)所述离子稳定剂选自0.4～2％ NaCl、KCl和MgCl2中的一种或多种，优选0.9％NaCl；
(6)所述微球储存液选自50～500mM Tris、HEPES和PBS缓冲液，pH为6.5～7.8；优选100mM PBS，pH为7.4；
(7)所述缓冲液为10～500mM Tris或PBS，pH为6.5～8.8；优选10mM Tris，pH为8.0。
在本发明的一些具体实施方案中，所述至少两种粒径的聚苯乙烯羧基微球的粒径为100±5nm和309±5nm；
优选地，所述试剂盒还包括粒径为244±5nm的聚苯乙烯羧基微球；
更优选地，所述聚苯乙烯羧基微球的粒径分别为100nm、244nm和309nm。
本发明的第三方面提供一种对样品中是否包含铜绿假单胞菌进行定性的方法，使用如本发明第二方面所述的试剂盒进行检测，其包括以下步骤：
(1)使用引物对和扩增酶对样品中的核酸进行扩增，
(2)加入最大粒径聚苯乙烯羧基微球和链霉亲和素，读取吸光度A1数据组，
(3)凝集反应后，再次进行吸光度读取A2数据组，并计算每组对应的ΔA＝A2-A1,
(4)若ΔA>X，则判定样品中存在铜绿假单胞菌，所述X为实际检测定量限所对应的ΔA的值。
本发明的第四方面提供一种对样品中的铜绿假单胞菌进行相对定量的方法，使用如本发明第二方面所述的试剂盒进行检测，步骤是：
(1)使用引物对和扩增酶对样品中的核酸进行扩增；
(2)加入不同粒径聚苯乙烯羧基微球和链霉亲和素，读取吸光度A1数据组；
(3)凝集反应后，再次进行吸光度读取A2数据组，并计算每组对应的ΔA＝A2-A1；
(4)利用不同粒径的聚苯乙烯羧基微球的线性标准曲线，将ΔA代入计算得到样品中铜绿假单胞菌的核酸浓度。
(5)将不同粒径微球测得的核酸浓度与其可信范围相比较，取落在可信范围内的核酸浓度为最终报告值；
优选地，所述(5)中，若有多个不同粒径微球测得的核酸浓度均落在其可信范围内，则以线性范围更宽的微球测得的核酸浓度为最终报告值。
在本发明的一些具体的实施方案中，所述方法包括以下条件的一种或多种：
(i)提取样品中的核酸，以用于所述扩增；
(ii)在提取的核酸中加入如本发明第二方面所述的试剂盒所定义的激活剂；
(iii)所述标记物与标记物特异性结合的分子结合，产生凝集反应；
(iv)所述凝集反应在37℃下进行3-6min；
优选地，所述(i)中，将1份样本和4-5份0.5％SDS等渗葡萄糖溶液混合；并加入4-5份0.1M KOH，0.5mM EDTA混合；置于80-100℃金属浴孵育2-10min，例如90℃金属浴中孵育5min；静置待絮状沉淀析出后取上清即得样品中的核酸。
在本发明的另一些具体的实施方案中，所述聚苯乙烯羧基微球与标记物特异性结合的分子结合包括以下步骤：
(a)将聚苯乙烯羧基微球以1％浓度分散在MES中，加入NHS和EDC，反应；
(b)离心弃上清，用缓冲液例如HEPES重悬浮超声；
(c)加入地高辛抗体，反应；
(d)加入封闭剂例如1％BSA终止偶联反应；
(e)离心弃上清，用微球储存液冲悬浮超声，制成偶联有地高辛抗体的聚苯乙烯羧基微球溶液；
本发明的第五方面提供一种如本发明第一方面所述的引物对或本发明第二方面所述的试剂盒在检测样品中铜绿假单胞菌中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。
如本发明第二方面提供的试剂盒在胶乳增强技术的原理上进行创新，利用全自动生化平台上结合核酸等温扩增技术进行了一种全新的尝试。将市面上几乎所有全自动生化仪都自带的恒温孵育模块对核酸样本进行恒温扩增，将扩增后产物(每个扩增产物两端各连接一个生物素)通过与偶联有链霉亲和素的胶乳微球特异性结合形成多个胶乳-扩增产物聚集体，从而形成浊度被生化仪检测到；该技术不但可以快速解决普通核酸检测样本的时间限制，还具备胶乳增强比浊技术的高灵敏特性，从而具备了高灵敏检测核酸分子的能力。
本发明的积极进步效果在于：
1、应用本发明可以实现对待检测核酸样品中是否含有铜绿假单胞菌的快速定性检测。
2、应用本发明可以实现对待检测核酸样品中是否含有铜绿假单胞菌的快速相对定量检测，且本发明检测方法与传统的qPCR方法的阴阳性符合率达到97.6％，相关性较好，相关系数r达到0.953。
附图说明
图1显示了不同碱解试剂处理后的样本核酸提取效果；其中，
1为金黄色葡萄球菌；2为铜绿假单胞菌；3为鲍曼不动杆菌；4为肺炎克雷伯菌；5为米根霉；6为卷枝毛霉菌；NC为阴性对照。
图2显示了不同核酸提取方法提取的核酸在qPCR反应中的表现。
图3显示了不同引物对对铜绿假单胞菌的扩增效果。
图4显示了不同引物对浓度对铜绿假单胞菌的扩增效果；其中，
1为引物浓度为0.6μM，2为引物浓度为0.5μM，3为引物浓度为0.2μM，4为引物浓度为0.1μM。
图5显示了不同粒径聚苯乙烯羧基微球检测校准品的校准曲线。
图6显示了KPS和SPS基质溶解的校准品的校准曲线；其中，
图6中A显示了KPS和SPS基质溶解的校准品在低敏试剂组中的校准曲线；图6中B显示了KPS和SPS基质溶解的校准品在中敏试剂组中的校准曲线；图6中C显示了KPS和SPS基质溶解的校准品在高敏试剂组中的校准曲线。
图7显示了本发明检测方法与传统qPCR检测方法的Passing-Bablok回归分析结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1样本核酸提取方法优化：
1.1碱解试剂的选择优化
分别对真菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌株进行样本核酸初提方法测试。对于碱试剂的选择，选择0.1M氢氧化钠(NaOH)和0.1M氢氧化钾(KOH)作为待测试剂，其余步骤与样本释放剂处理菌株方法一致。对于提取的菌株样本DNA进行PCR扩增验证。对于细菌验证的引物对选择16s DNA-F/R，其正向引物核酸序列如SEQ ID NO:3所示，其反向引物的核酸序列如SEQ ID NO:4所示。对于真菌验证的引物对选择ITS1/ITS4引物对，其正向引物核酸序列如SEQ ID NO:5所示，其反向引物的核酸序列如SEQ ID NO:6所示。
SEQ ID NO:3序列为：
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；
SEQ ID NO:4序列为：
AAGGAGGTGATCCAGCCGCA；
SEQ ID NO:5序列为：
TCCGTAGGTGAACCTGCGG；
SEQ ID NO:6序列为：
TCCTCCGCTTATTGATATGC。
PCR扩增的体系和扩增程序如下：
试剂 体积(μl)
PCR buffer 20.3
5μM正向引物 2
5μM反向引物 2
模板 2.5
Taq酶 0.2
表1PCR鉴定扩增体系
表2PCR鉴定扩增程序
对于扩增的结果用2％的琼脂糖凝胶进行鉴定，结果如图1所示，对于裂解试剂中的碱解试剂选择氢氧化钾(KOH)可对提取起到显著作用。
1.2样本核酸提取方法的优化
方案1：取20μl样本，加入到100μl的0.5％SDS溶液中，涡旋混匀；再加入100μl0.1M KOH溶液，涡旋混匀，置于90℃金属浴中孵育5min；随后室温静置使温度恢复至室温，有SDS絮状沉淀析出，置于离心机10000rpm离心2min，取上清加入pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液即可得到提取的基因组溶液。
方案2：取20μl样本，加入到95μl的0.5％ SDS溶液中，涡旋混匀；再加入95μl 0.1MKOH溶液，涡旋混匀；再加入10μl 10mM EDTA置于90℃金属浴中孵育5min；随后室温静置使温度恢复至室温，有SDS絮状沉淀析出，置于离心机10000rpm离心2min，取上清加入pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液即可得到提取的基因组溶液。
方案3：取20μl样本，加入到95μl的0.5％ SDS等渗葡萄糖溶液，涡旋混匀；再加入95μl 0.1M KOH，0.5mM EDTA，涡旋混匀；置于90℃金属浴中孵育5min；随后室温静置使温度恢复至室温，有SDS絮状沉淀析出，置于离心机10000rpm离心2min，取上清加入样本保存液即可得到提取的基因组溶液。
取上清加入样本保存液即可得到提取的基因组溶液。
对于上述方案，用qPCR进行检测，qPCR引物对为PA-F与PA-R，其正向引物核酸序列如SEQ ID NO:7所示，其反向引物的核酸序列如SEQ ID NO:8所示。
SEQ ID NO:7序列为：
GCAACTGGACCACGGAAAG；
SEQ ID NO:8序列为：
CGTTGTGCCACTCCCAGT；
检测结果如图2所示，可知对于方案3的稳定性和Ct值均较好。
Ct值 方差
方案1 28.08 0.33
方案2 26.21 0.266
方案3 24.6 0.23
表3qPCR结果统计
实施例2RPA等温扩增优化
2.1对于RPA酶扩增引物的优化
对于快速扩增反应体系，对应引物的进行优化，引物对分别选择PA-1引物对，其正向引物核酸序列如SEQ ID NO:9所示，其反向引物的核酸序列如SEQ ID NO:10所示；PA-2引物对，其正向引物核酸序列如SEQ ID NO:11所示，其反向引物的核酸序列如SEQ ID NO:12所示；PA-3引物对，其正向引物核酸序列如SEQ ID NO:1所示，其反向引物的核酸序列如SEQID NO:2所示；
SEQ ID NO:1序列为：
GTTACAGCGGCACAGCCTGTTCGTCGAGGA；
SEQ ID NO:2序列为：
TAGTGGTTCTCGCAATAGCCCTGCGGATAC；
SEQ ID NO:9序列为：
GAGAATGACAAAGTGGAACTGGTGATCCGCCTG；
SEQ ID NO:10序列为：
GCCAGGCCTTCCCCTGATCGACACTTCCG；
SEQ ID NO:11序列为：
TTGAAAGGGTTTACCGACAACCTGGAATTGCGTCG；
SEQ ID NO:12序列为：
TTCGGATCCTCGGTCTCGAAGATCCGCACGTT。
RPA酶组合选用翌圣生物，体系中包括以下组分：
聚合酶(Bsu DNA polymerase，货号：11078ES72)，重组酶(T4 UvsX Recombinase，货号：11079ES60)，重组酶辅助因子(T4 UvsY Protein，货号：11080ES60)，单链结合蛋白(T4 gene 32protein，货号：11081ES72)，肌酸激酶(Creatine Kinase，货号：14502ES05)。
反应步骤如下：
(1)取5μl样本中，加入5μl激活剂混匀。
(2)RPA酶体系为25μl，10mM dNTP 8μl，正反向引物，补水至40μl。
(3)将第一步的混有激活剂的样本加入到反应体系中，涡旋混匀，37℃恒温孵育10min。
反应结束后用2％琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图3所示，引物对PA-3得到的条带亮度和扩增的特异性最高，因此后续选择PA-3作为反应扩增选用的引物对。
2.2对于RPA酶扩增反应体系的优化
对于快速扩增反应体系，对应引物的浓度进行体系优化，PA-3引物对在反应体系中的浓度分别为：0.6μM，0.5μM，0.2μM，0.1μM。分别对应的10μM引物反应体积为：3μl，2.5μl，1μl，0.5μl。
其余体系均不变，反应步骤如下：
(1)取5μl样本中，加入5μl激活剂混匀。
(2)RPA酶体系为25μl，10mM dNTP 8μl，正反向引物，补水至40μl。
(3)将第一步的混油激活剂的样本加入到反应体系中，涡旋混匀，37℃恒温孵育10min。
反应结束后用2％琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图4所示，当引物浓度为0.6μM和0.5μM时的条带大小和亮度一致，因此选择反应体系的引物浓度为0.5μM。
实施例3制备偶联有地高辛抗体的聚苯乙烯羧基微球
本实施例也可适用于其他微球的抗体偶联反应，例如氨基微球。
其制备有以下步骤：
使用官能团为羧基的聚苯乙烯羧基微球(北京博尔迈生物技术有限公司)通过NHS(N-羟基丁二酰亚胺)和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的活化后，再与地高辛抗体上的氨基偶联形成酰胺反应，本发明采用的偶联方法如下：
(1)将10mg聚苯乙烯羧基微球(粒径采用50nm～350nm)分散在1ml MES(pH＝6.1)中(微球浓度1％)，加入NHS(N-羟基丁二酰亚胺)和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)，于室温反应1h；
(2)12000rpm离心30min弃去上清，用MES或者HEPES缓冲液重悬浮超声；
(3)加入0.5mg/ml地高辛抗体,搅拌反应1h；
(4)加入0.1％～1％的BSA进行封闭终止偶联反应，封闭过夜；
(5)12000rpm离心30min弃去上清，用微球储存液重悬浮超声，制成偶联有地高辛抗体的聚苯乙烯羧基微球；
得到的偶联有地高辛抗体的聚苯乙烯羧基微球储存在微球储存液中，微球储存液配方为：
100mM HEPES缓冲液pH＝7.4,0.9％NaCl、0.5％海藻糖，0.1％BSA，0.1％ProClin300。
实施例4使用试剂盒检测不同浓度铜绿假单胞菌
4.1试剂盒试剂准备
(1)校准品：包含铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的保守序列质粒和器官保存液基质、5％牛血清及防腐剂(0.1％叠氮化钠)；
(2)样本释放试剂(细菌提取剂)包含有SDS、KOH、EDTA等；其中：
样本释放剂1：0.5％SDS等渗葡萄糖溶液；
样本释放剂2：0.1M KOH，0.5mM EDTA；
(3)样本保存液：Tris-HCl缓冲液，pH＝8.0；
(4)激活剂：150mM醋酸镁(MgOAc)；
(5)R1：包含扩增用的正向引物、反向引物、dNTP、RPA酶组合、促凝剂、防腐剂和缓冲液；其中：
缓冲液：10mM Tris-Hcl pH＝8.0；
引物：0.5μM PA3-F(正向引物)、0.5μM PA3-R(反向引物)；
扩增酶组合及底物：10mM dNTP溶液，含聚合酶(Bsu DNA polymerase),重组酶(T4UvsX Recombinase),重组酶辅助因子(T4 UvsY Protein),单链结合蛋白(T4 gene32protein),肌酸激酶(Creatine Kinase)；
离子稳定剂：0.9％ NaCl；
促凝剂：PEG 6000(不同浓度可以调控促凝反应的强度，可调整；实例中为调整后最优浓度)；
防腐剂：0.1％ ProClin 300；
(6)R2：包含偶联有地高辛抗体的聚苯乙烯羧基微球溶液、链霉亲和素、缓冲液、离子稳定剂、蛋白稳定剂、封闭剂、防腐剂，其中：
R2(低灵敏试剂组)为100nm偶联有地高辛抗体的聚苯乙烯羧基微球溶液；
R2(中灵敏试剂组)为244nm偶联有地高辛抗体的聚苯乙烯羧基微球溶液；
R2(高灵敏试剂组)为309nm偶联有地高辛抗体的聚苯乙烯羧基微球溶液；链霉亲和素：200ng/ml
缓冲液：100mM HEPES，pH＝7.4；
离子稳定剂：0.9％NaCl；
蛋白稳定剂：0.5％海藻糖；
封闭剂：0.1％BSA；
防腐剂：0.1％ ProClin300。
4.2绘制不同粒径聚苯乙烯羧基微球测定校准品核酸浓度的标准曲线其步骤包括：
(1)全自动生化仪(日立，7180)参数设置为：主波长546nm；
(2)将20μl浓度梯度的校准品分为三组，与100μl R1混匀，37℃孵育3-5min；
(3)将(2)中三组混合液分别与100μl三组不同灵敏度R2，37℃孵育20s后，置于生化仪，读取吸光度A1；
(4)37℃孵育5min后，置于生化仪，读取吸光度A2；
(5)计算得到ΔA(生化仪检测吸光度值)＝A2-A1。
(6)以校准品浓度梯度为横坐标，以ΔA值为纵坐标绘制标准曲线，如图5所示。
表4生化仪检测吸光度值
粒径越大的聚苯乙烯羧基微球表现出对于样本扩增后产物的检测灵敏度也越高。使用309nm聚苯乙烯羧基微球偶联链霉亲和素最高可以检测到质粒校准品大约5copies/μl左右的样本，但越大的微球的线性约窄；根据不同粒径聚苯乙烯羧基微球线性范围可以确定：使用100nm微球试剂组测得的核酸浓度可信范围为≥1000copies/μl；使用244nm微球试剂组测得的核酸浓度可信范围为250～1000copies/μl；使用309nm微球试剂组测得的核酸浓度可信范围为5～250copies/μl。
4.3绘制不同基质的校准品检测较准曲线
采用三种胶乳微球粒径偶联链霉亲和素的试剂组，按照上述实验中筛选出的铜绿假单胞菌质粒浓度配制成校准品，校准品包含铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的保守序列质粒和器官保存液基质、5％牛血清及防腐剂(0.1％叠氮化钠)。其中器官保存液基质为使用上海健耕医药股份有限公司的器官保存液或/>器官保存液作为校准品的基础基质，并加入5％牛血清，防腐剂可选叠氮钠、硫柳汞、ProClin300制备得到。
(含KPS或SPS、5％牛血清、铜绿假单胞菌特异性序列质粒、防腐剂)，每组校准品浓度范围不同，如下表：
表5不同灵敏度试剂组的校准品浓度范围
检测前，按下表数据设置设备参数：
波长 546nm/无(主/副)
比色杯光径 1cm
反应温度 37℃
反应方法 两点终点法
校准类型 Spline/Logit-log(4p)
反应方向 向上
表6设备参数
反应步骤如下：
(1)制备KPS基质以及SPS基质的浓度梯度的校准品溶液并按表5浓度范围分为三组，每组包括两种基质溶解的浓度梯度核酸溶液；
(2)将20μl(1)中的三组校准品溶液与100μl R1混匀，37℃孵育3-5min；
(3)将(2)中的三组混合液分别与100μl三组不同灵敏度R2混匀，37℃孵育20s后，置于生化仪，读取吸光度A1；
(4)37℃孵育5min后，置于生化仪，读取吸光度A2；
(5)计算得到ΔA(生化仪检测吸光度值)＝A2-A1，结果如表7所示。
表7生化仪检测结果
绘制KPS和SPS两种基质溶解的校准品在本发明中的检测较准曲线，如图6所示。使用以上方法，可以快速对样本进行定性，例如当ΔA＞200时，则可以判定该样本为铜绿假单胞菌阳性。ΔA的具体取值标准，本领域技术人员可以根据本说明书记载或阴性样本对照结合公知常识来判定。
4.4临床样本检测以及与qPCR检测效果进行比较
采用qPCR方法作为对照，同时与本发明的方法一起检测14例KPS基质样本和27例SPS基质样本，每组样本中都含有铜绿假单胞菌阴性或阳性，KPS基质校准品定标的试剂只检测14例KPS基质样本(其中，天然样本5例，人工添加非铜绿假单胞菌的阴性样本5例，人工添加铜绿假单胞菌的阳性样本4例)，SPS基质校准品定标的试剂只检测27例SPS基质样本(其中，天然样本16例，人工添加非铜绿假单胞菌的阴性样本5例，人工添加铜绿假单胞菌的阳性样本6例)。对于qPCR检测的结果，为了避免取样等人为因素造成的结果偏差，暂定对于Ct值<38(对应样本约为5copies/ul)为有效样本。
具体的反应步骤如下：
(1)将20μl含核酸的样本溶液与100μl R1混匀，37℃孵育3-5min；
(2)将(1)中的混合液分别与100μl三组不同灵敏度R2混匀，37℃孵育20s后，置于生化仪，读取吸光度A1；
(3)37℃孵育5min后，置于生化仪，读取吸光度A2；
(4)计算得到ΔA(生化仪检测吸光度值)＝A2-A1。
计算以及分析过程如下：
(1)利用不同粒径的聚苯乙烯羧基微球的线性标准曲线，将ΔA代入计算得到样品中铜绿假单胞菌的核酸浓度；
(2)将不同粒径微球测得的核酸浓度与其可信范围相比较，取落在可信范围内的核酸浓度为最终报告值；
(3)若有多个不同粒径微球测得的核酸浓度均落在其可信范围内，则以线性范围更宽的微球测得的核酸浓度为最终报告值。
可信范围：低灵敏度试剂组报告1000copies/μl以上结果；中灵敏度试剂组报告250～1000copies/μl范围内的结果；高敏试剂组报告5～250copies/μl范围内的结果。
结果如表8所示。
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表8临床样本检测结果注：KPS基质中6-10号样本为KPS基质的阴性样本中加入其它非目标检测阴性菌株，对应编号添加的菌株分别为：6号为大肠杆菌，7号为肺炎克雷伯菌，8号为鲍曼不动杆菌，9号为金黄色葡萄球菌，10号为表皮葡萄球菌。SPS基质样本中17-21号样本为KPS基质的阴性样本中加入其它非目标检测阴性菌株，对应编号添加的菌株分别为：17号为大肠杆菌，18号为肺炎克雷伯菌，19号为鲍曼不动杆菌，20号为金黄色葡萄球菌，21号为表皮葡萄球菌。
上表中应用qPCR检测方法以及本发明检测方法，检测的样本报告值低于5copies/μl的，不在检测方法线性范围内，其检测结果为铜绿假单胞菌阴性。从阴阳性符合率比较可以看到本发明检测方法与qPCR方法在41例样本中仅有1例(SPS基质样本7号)存在不同，阴阳性符合率达到97.6％。
与传统的qPCR方法测得的结果做Passing-Bablok比对分析，分析结果如图7所示，本发明检测方法与传统的qPCR方法比相关性较好，本实例检测41个样本相关系数r达到0.953。

Claims (10)

1.一种用于特异性扩增铜绿假单胞菌的引物对，其特征在于，所述引物对包含正向引物和反向引物，所述正向引物的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种用于检测铜绿假单胞菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒除包括如权利要求1所述的引物对外，还包括至少两种粒径的聚苯乙烯羧基微球，使其在线性范围内可以定量检测所述铜绿假单胞菌。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对的正向引物和/或反向引物的5’端和/或3’端缀合有标记物；所述聚苯乙烯羧基微球偶联有可以与标记物特异性结合的分子，以实现定性和/或定量检测；
优选地所述标记物为生物素，与标记物特异性结合的分子为链霉亲和素；和/或，所述标记物为地高辛，与标志物特异性结合的分子为抗地高辛抗体。
4.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增酶、醋酸镁、促凝剂、防腐剂、封闭剂、离子稳定剂、微球储存液和缓冲液中的一种或多种；
优选地，所述试剂盒包括以下一种或多种：
(1)所述扩增酶为RPA酶组合，其包括结合单链核酸的重组酶、重组酶辅助因子、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶和肌酸激酶；
(2)所述促凝剂选自聚乙二醇PEG、壳聚糖、葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种；
(3)所述防腐剂选自叠氮化钠、硫柳汞和ProClin300中的一种或多种；
(4)所述封闭剂选自酪蛋白、甘氨酸和BSA中的一种或多种；
(5)所述离子稳定剂选自0.4～2％NaCl、KCl和MgCl2中的一种或多种，优选0.9％NaCl；
(6)所述微球储存液选自50～500mM Tris、HEPES和PBS缓冲液，pH为6.5～7.8；优选100mM PBS，pH为7.4；
(7)所述缓冲液为10～500mM Tris或PBS，pH为6.5～8.8；优选10mM Tris，pH为8.0。
5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述至少两种粒径的聚苯乙烯羧基微球的粒径为100±5nm和309±5nm；
优选地，所述试剂盒还包括粒径为244±5nm的聚苯乙烯羧基微球；
更优选地，所述聚苯乙烯羧基微球的粒径分别为100nm、244nm和309nm。
6.一种对样品中是否包含铜绿假单胞菌进行定性的方法，其特征在于，使用如权利要求2-5任一项所述的试剂盒进行检测，其包括以下步骤：
(1)使用引物对和扩增酶对样品中的核酸进行扩增；
(2)加入最大粒径聚苯乙烯羧基微球和链霉亲和素，读取吸光度A1数据组；
(3)凝集反应后，再次进行吸光度读取A2数据组，并计算每组对应的ΔA＝A2-A1；
(4)若ΔA＞X，则判定样品中存在铜绿假单胞菌，所述X为实际检测定量限所对应的ΔA的值。
7.一种对样品中的铜绿假单胞菌进行相对定量的方法，其特征在于，使用如权利要求2-5任一项所述的试剂盒进行检测，步骤是：
(1)使用引物对和扩增酶对样品中的核酸进行扩增；
(2)加入不同粒径聚苯乙烯羧基微球和链霉亲和素，读取吸光度A1数据组；
(3)凝集反应后，再次进行吸光度读取A2数据组，并计算每组对应的ΔA＝A2-A1；
(4)利用不同粒径的聚苯乙烯羧基微球的线性标准曲线，将ΔA代入计算得到样品中铜绿假单胞菌的核酸浓度；
(5)将不同粒径微球测得的核酸浓度与其可信范围相比较，取落在可信范围内的核酸浓度为最终报告值；
优选地，所述(5)中，若有多个不同粒径微球测得的核酸浓度均落在其可信范围内，则以线性范围更宽的微球测得的核酸浓度为最终报告值。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下条件的一种或多种：
(i)提取样品中的核酸，以用于所述扩增；
(ii)在提取的核酸中加入如权利要求2-5中任一项所述的试剂盒所定义的激活剂；
(iii)所述标记物与标记物特异性结合的分子结合，产生凝集反应；
(iv)所述凝集反应在37℃下进行3-6min；
优选地，所述(i)中，将1份样本和4-5份0.5％SDS等渗葡萄糖溶液混合；并加入4-5份0.1M KOH，0.5mM EDTA混合；置于80-100℃金属浴孵育2-10min，例如90℃金属浴中孵育5min；静置待絮状沉淀析出后取上清即得样品中的核酸。
9.如权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，所述聚苯乙烯羧基微球与标记物特异性结合的分子结合包括以下步骤：
(a)将聚苯乙烯羧基微球以1％浓度分散在MES中，加入NHS和EDC，反应；
(b)离心弃上清，用缓冲液例如HEPES重悬浮超声；
(c)加入地高辛抗体，反应；
(d)加入封闭剂例如1％BSA终止偶联反应；
(e)离心弃上清，用微球储存液冲悬浮超声，制成偶联有地高辛抗体的聚苯乙烯羧基微球溶液。
10.一种如权利要求1所述的引物对或权利要求2-5中任一项所述的试剂盒在检测样品中铜绿假单胞菌中的应用。
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