CN118272492A - 一种基于CRISPR/Cas系统的核酸片段检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于CRISPR/Cas系统的核酸片段检测方法。首先对待测核酸片段进行扩增，然后根据目标核酸序列设计crRNA，同时设计两端具有可识别的特异性分子的寡核苷酸链，利用Cas12、Cas13的非定向剪切的性质，在目标核酸配对的crRNA的引导下，降解寡核苷酸链。完成降解的核苷酸寡链溶液与包被了识别末端特异性分子的抗体等分子的纳米微球反应，引起溶液的浊度变化。通过观察或者测量浊度的变化，可以定性或者定量地检测目标核酸序列。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是一种基于CRISPR/Cas系统的核酸片段的检测方法。。
背景技术
核酸分子是地球上所有生物的遗传物质。每一种生物都有自己独特的核酸序列，通过检测生物样本中的特征核酸序列，可以鉴定样本的生物来源。在临床医学的应用中，通过检测病人样本中的特征核酸片段，可以发现和确认病原体，找到致病原因，从而帮助临床医生做出的正确的诊断和治疗。
目前临床上最常用的核酸检测技术是基于PCR（聚合酶链式反应）原理的分子诊断技术。通过设计针对特征核酸片段的引物（Primers），在核酸聚合酶的作用下，以样本中的目标核酸分子为模版大量扩增复制目标核酸片段，然后通过荧光染料显色来定性或者定量地报告目标核酸片段。其优势在于高度准确，但可能需要超过24-48小时出结果，需要专业工具和人员，成本更高，并且在感染期之后的几周内也会出现阳性结果。除了PCR，还有其他如荧光定量PCR和反转录PCR等技术，都是通过扩增病原体的核酸来检测特定的基因序列。
抗体检测则是通过检测血液样本中特异性抗体IgM和IgG的存在及含量来间接判断体内有无病毒及病毒感染情况。抗体检测方法包括酶联免疫吸附试验法（ELISA）、化学发光免疫分析法和胶体金免疫层析法。这些方法各有优势和局限性，如ELISA的灵敏度较高，但检测速度慢、易污染、步骤较为繁琐；胶体金免疫层析法操作方便快速，但可能需要通过分子检测进行确认。
近年来，基因编辑技术迅速发展，尤其是基于CRISPR/Cas系统的基因编辑技术被广泛应用。CRISPR,成簇规律间隔短回文重复序列，存在于细菌或者古菌的核酸序列中，编码crRNA.是细菌或者古菌的获得性免疫系统的组成部分。Cas蛋白是CRISPR系统的效应蛋白，与crRNA结合。当探测到环境中存在与crRNA匹配的DNA或者RNA序列时，Cas蛋白被激活，可以限制性或者非限制性地降解核酸序列(DNA或者RNA序列)。根据Cas效应蛋白以及降解的核酸对象的不同，CRISPR/Cas系统分为2个群，6个不同的类型。其中以Cas12a和Cas13为代表的两类CRISPR/Cas系统能够非限制性地降解DNA或者RNA序列，可以方便地引入信号分子，非常适合于开发成临床核酸诊断的方法。比如DETECTR技术(Science 2018;360:436-439),利用短序列的单链DNA作为信号分子，在单链DNA序列两端加上荧光分子和相对应的荧光淬灭分子。当待检样本中没有目标核酸序列时，Cas12a相关联的crRNA不能匹配到目标核酸序列，Cas12a不能被激活，因此信号分子的DNA序列不会被降解，荧光分子被紧邻的荧光淬灭分子抑制，不能发出荧光信号。当待检样本中存在目标核酸序列时，Cas12a相关联的crRNA匹配到目标核酸序列，Cas12a被激活，信号分子的DNA序列被降解，荧光淬灭分子远离荧光分子，在荧光检测仪上就可以探测到荧光信号，从而检测出目标核酸序列。基于Cas13的SHERLOCK技术(Science 2017;356:438-442;Science 2018;360:439-444),也是采用类似的方案，不同的地方在于Cas13的作用对象是短序列的单链RNA。因此，DETECTR技术适用于DNA的核酸样本，SHERLOCK技术适用于RNA的核酸样本。
由于CRISPR/Cas系统本身就具有高特异性和灵敏度的特点，基于CRISPR/Cas系统的检测技术可以与PCR等核酸扩增技术相结合，通过核酸扩增提高检测的灵敏度，通过CRISPR/Cas提高检测的特异性，将两种技术有机结合，不仅增强了CRISPR/Cas本身的优点，同时还融合了PCR的优点，保障了检测的精密度和准确度，从而开发出比较符合临床应用要求核酸检测技术。
然而目前这些基于CRISPR/Cas系统的检测技术都依赖荧光检测信号，需要配套荧光设备，成本较高，在临床应用尤其是快速诊断的临床应用中不是很方便。临床检测实践中最普遍应用的技术是免疫检测技术，最常见的免疫检测平台是生化分析仪或者特定蛋白分析仪，几乎所有的临床检验实验室都配有这样的检测平台。这类平台一般采用胶乳增强免疫比浊技术，具有极好的通用性，在我国各个等级的医院中都有使用，也是快速诊断的常用平台。因此，为了弥补CRISPR/Cas技术需要复杂的仪器设备和精密实验操作的缺点，将胶乳增强免疫诊断技术与CRISPR/Cas技术相结合，开发出可以在通用免疫检测平台上使用的核酸快速检测技术，就可以在不需要添加硬件设备的条件下将最先进的CRISPR/Cas技术引入到临床检测实践中，不仅能简化繁琐的实验操作还能大幅降低对实验设备的要求，这样可以节省大量的时间和经济成本，对提升临床检测服务有非常广泛的实用性和现实意义。
发明内容
本发明提供了一种基于CRISPR/Cas系统并利用通用免疫检测平台的核酸片段检测方法。
本发明提供的核酸检测方法包括以下步骤：
1.以目标核酸片段为蓝本，设计引物对待检的核酸样本进行扩增。如果目标核酸片段是RNA序列，则需要逆转录后再扩增。
2.扩增后的核酸样本转移到装有CRISPR/Cas效应系统的容器中反应。在样本中的目标核酸的引导下，匹配的靶向RNA激活Cas效应蛋白非特异性地剪切降解信号分子寡核苷酸链。
3.经过CRISPR/Cas反应的溶液作为样本进行免疫检测。免疫反应试剂含有纳米级别的胶乳微球，微球表面包被有与寡核苷酸端基分子对应的抗体、抗原、链霉亲和素等。通过抗体抗原等特异性识别反应，胶乳微球和寡核苷酸链端基可以结合，短链的寡核苷酸就形成了胶乳微球之间的桥联，引起胶乳微球的凝聚，从而改变反应体系的浊度。如果检测的核酸样本中有目标核酸序列，那么作为信号分子的寡核苷酸链就会被剪切降解，胶乳微球之间的桥联无法形成，反应体系的浊度就不会改变。通过测量反应体系的浊度，可以定性或者定量的检测出待检样本中的目标核酸片段。
进一步地，在步骤1中，目标核酸片段可以是DNA，也可以是RNA。
进一步地，对DNA核酸样本的扩增过程可以采用常规的PCR方案，循环次数可以是30到40次。对DNA核酸样本的扩增过程也可以采用恒温扩增方案比如RPA、LAMP等恒温扩增方案，扩增时间20到40分钟。类似地，如果目标核酸片段是RNA序列，需要先对RNA进行逆转录然后再扩增。相应地则可以采用RT-PCR、RT-RPA或者RT-LAMP等方案进行逆转录扩增。
进一步地，在扩增步骤中使用的试剂包括引物，聚合链式反应液，聚合酶等。以典型的PCR反应为例，一般地，反应体系中含有5uL待检DNA溶液，15uLqPCR聚合反应液，其中包括qPCR缓冲溶液、聚合酶、ATP、TTP、CTP、GTP等，1uL引物（10uM），10uL纯水。扩增循环35~40次，每次循环包括98摄氏度10秒，60摄氏度10秒，和72摄氏度15秒。
进一步地，在步骤2中，使用的试剂包括Cas效应蛋白，以目标核酸为模版的靶向RNA（crRNA）,信号分子寡核苷酸链，缓冲溶液等。
其中，Cas效应蛋白可以是Cas12或者Cas13效应蛋白。Cas12效应蛋白包括但不限于AsCas12a、LbCas12a等效应蛋白。Cas13效应蛋白包括但不限于LbaCas13a、LbuCas13a、LwaCas13a、CcaCas13b、PsmCas13b等效应蛋白。
进一步地，Cas12效应蛋白的效应分子是DNA，Cas13效应蛋白的效应分子是RNA。在使用Cas12效应蛋白时，对应的信号分子寡核苷酸链是单链DNA（ssDNA）。在使用Cas13效应蛋白时，对应的信号分子寡核苷酸链是单链RNA（ssRNA）。寡核苷酸链的长度为10~40核苷酸长度。寡核苷酸链的序列没有特殊的要求，一般只需不干扰crRNA识别目标核酸序列即可。优选地，可以采取重复的A序列、T序列、C序列、G序列或者是U序列（ssRNA）。
进一步地，信号分子寡核苷酸链的两端连接可以被特异性识别的分子。这些分子可以通过抗原抗体的特异性反应来识别，也可以是通过分子间的作用力来特异性识别。例如这些分子可以是荧光分子如FITC、FAM等，它们能够被Anti-FITC、Anti-FAM特异性地识别。这些分子也可以是非荧光分子如生物素（Biotin）、维生素D等，他们可以被链霉亲和素、维生素D抗体特异性地识别。这些分子还可以是抗体如羊抗鼠IgG、鸡抗鼠IgG等，他们能够和鼠IgG形成特异性识别。在寡核苷酸链两端的分子既可以是同一种分子，也可以是不同的分子。只要端基的分子能够被特异性识别，就可以使用。
进一步地，一个典型的CRISPR/Cas反应可以按如下方式进行：5uL核酸样本扩增后的溶液，30uLCRISPR/Cas反应液，其中包括3.5uL10X缓冲溶液,3uL300nM的靶向RNA，1uL1uM的Cas12a效应蛋白，1.5uL10uM的信号分子寡核苷酸。整个体系在37摄氏度反应5分钟。
进一步地，在步骤3中，采用的免疫检测的技术是胶乳增强免疫比浊法，通过检测反应体系的浊度变化来检测目标核酸。
进一步地，免疫反应的试剂是胶乳微球试剂。这种胶乳微球试剂中的胶乳微球是直径在50~500nm之间的胶乳材质（例如聚苯乙烯）的微球。这些微球表面具有官能团如-NH2、-COOH、-CHO、-SH等，可以通过常用的偶联反应于抗体、抗原、有活性基团的分子进行化学偶联。在本发明中，胶乳微球包被有与信号分子寡核苷酸链端基分子对应的抗体、抗原、链霉亲和素等。例如信号分子寡核苷酸链两端分别连接FITC和生物素，那么对应地，在免疫反应的试剂中，就有一半的微球包被有Anti-FITC，另一半的微球包被有链霉亲和素。当经过CRISPR/Cas反应的检测样本溶液与胶乳微球试剂反应时，溶液中的寡核苷酸链上的端基分子就会特异性地连接到对应的胶乳微球上。如果检测的核酸样本中没有目标核酸序列，那么作为信号分子的寡核苷酸链在CRISPR/Cas反应中就不会被剪切降解。信号分子寡核苷酸链的端基分子被胶乳微球上包被的分子特异性地识别（如FITC/Anti-FITC, 生物素/链霉亲和素等）后，短链的寡核苷酸就形成了胶乳微球之间的桥联，引起胶乳微球的凝聚，从而改变反应体系的浊度。如果检测的核酸样本中有目标核酸序列，那么作为信号分子的寡核苷酸链通过CRISPR/Cas反应就会被Cas效应蛋白非限制性地剪切降解。尽管微球上的包被分子仍然能够识别端基分子，但是由于寡核苷酸链已经被降解，胶乳微球之间的桥联无法形成，反应体系的浊度就不会改变或者改变的幅度较小。通过测量反应体系的浊度变化，可以检测出待检样本中的目标核酸片段。
进一步地，溶液浊度的变化可以通过测量吸光度来观测。吸光度的测量波长范围是450~750nm。优选地，波长可以选择520nm, 650nm，700nm。吸光度的测量可以在通用的全自动生化分析仪上进行，也可以在小型的特定蛋白分析仪上进行，还可以在半自动的POCT特定蛋白分析仪上进行。
进一步地，胶乳微球的质量浓度范围时0.05% ~ 2%。优选地，胶乳微球的质量浓度范围是0.1% ~ 0.5%。
进一步地，在全自动生化分析仪或者特定蛋白分析仪上，浊度变化以反应度来表示。空白对照（无目标核酸序列的样本）的反应度最高。以空白对照的反应度作为参考标准，待测样本的反应度低于标准的10%作为阳性判断标准。采用这样的判断标准，本发明的核酸片段最低检测限可以达到10-20M。
进一步地，可以用一系列不同浓度的目标核酸样本作为标准品系列，按本发明操作后，建立反应度和目标核酸浓度之间的校准曲线。通过校准曲线，结合检测样本的最终反应度，可以定量计算待测样本中目标核酸的浓度。
优选地，对于需要高灵敏度和定量结果的测量，校准品的目标核酸浓度的设置可以是0，0.1，2，20，200，1000拷贝/uL。如果待测样本的目标核酸浓度较高，当需要定性的结果，可以直接测量；当需要定量的结果，可以对待测样本稀释后进行测量。
有益效果
本发明结合了核酸扩增技术、CRISPR/Cas基因编辑技术和胶乳增强免疫检测技术，提供了一种新型的核酸片段检测方法，能够高灵敏度高特异性地检测出目标核酸片段。先将PCR技术和CRISPR/Cas因编辑技术进行结合提升检测特异性和灵敏度，核酸扩增的引物匹配和CRISPR/Cas基因编辑的crRNA匹配，保证了该方法的特异性。随后再和胶乳比浊的技术相结合以减少使用者操作步骤、检测时间和设备条件，胶乳增强免疫检测通过抗体抗原的反应以及胶乳浊度的放大效应提高了检测的灵敏度。与已有的CRISPR/Cas技术相比，本发明无需价格昂贵的荧光检测设备，只需要利用临床检测机构已大量使用的生化分析仪或者特定蛋白分析仪，就可以方便快速地使用本发明方法进行精确的核酸检测。此外，本发明可以进行定性或者定量检测，优于目前一般CRISPR/Cas技术的定性检测限制。
附图说明
1.图1为胶乳增强免疫比浊法示意图
2.图2为CRISPR/Cas-胶乳体系检测核酸示意图
3.图3为CRISPR/Cas-胶乳体系检测不同浓度靶标核酸，各检测反应的反应度差值与靶标核酸浓度的线性关系示意图
实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细阐述。下述的实施例是为了结合具体实例进一步阐述本发明，并非全部实施例。本领域技术人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。
实施例1
本实施例基于qPCR扩增联合Cas12a，定性检测肺炎支原体的特异性序列。
（1）扩增引物设计
肺炎支原体最保守的序列是ATP酶、P1粘附蛋白和16SrRNA的保守区。选择P1粘附蛋白基因的保守序列为目的基因。本实施例肺炎支原体的特异性P1序列为：
acgaacagagcttaggtctccgcttagagttctttaaacctgatcaagatacccaaccaaacaacaacgttcaggtcaatccgaataacggtgacttcttaccactgttaacggcctccagtcaaggtccccaaaccttgtttagtccgtttaaccagtgacctgattacgtgttgccgttagcgatcactgtacctattgttgtgattgtgctcagtgttaccttaggacttgccattggaatc
利用Primer3 Plus在线软件设计出引物，
正向引物DNA序列：acgaacagagcttaggtctc；
反向引物DNA序列：taggacttgccattggaatc
（2）qPCR扩增待测核酸样本
使用赛默飞公司的TaqPath qPCR Master Mix CG来扩增待测样本中肺炎支原体的DNA。肺炎支原体为保留在我们的实验室的M129(ATCC29342)菌株，及从苏州市立医院获取的肺炎支原体临床样本，待测样本均为已经提纯处理好的DNA溶液。具体扩增程序如下：5uL待测样本，正向和反向引物各0.5uL（浓度为10uM），10uLTaqPath qPCR的标准混合液，3.5uL的纯水（无核酸酶），混合反应。500C孵育2分钟，950C聚合酶反应激活20秒，然后开始聚合酶链式反应循环，950C 15秒，600C 1分钟，循环35次。
（3）扩增后的目标核酸激活CRASPR/Cas系统剪切信号分子
取5uL扩增后的DNA样本溶液与CRISPR/Cas体系反应。CRISPR/Cas反应液包含有50mM Tris-HCl, 0.9%NaCl, 0.1%BSA,10mM MgCl2,pH 7.8, 100nM AsCas12a, 200nMcrRNA, 200nM ssDNA核苷酸寡链信号分子，寡链一端链接FITC分子，寡链另一端链接生物素（Biotin）。370C下反应30分钟。反应原理示意图见附图1。
crRNA 序列：uaauuucuacuaaguguagaucuuuaaaccugaucaagau
信号分子核苷酸寡链序列：FITC-aaaaaaaaaaaa-Biotin
（4）制备胶乳增强免疫比浊试剂
用25mmol/L pH6.0的MES缓冲液稀释微球胶乳，加入碳二亚胺（EDC）活化2h，13000r/min离心15min，去上清液，沉淀重悬于上述MES缓冲液中，超声分散；边搅拌边分别加入anti-FITC抗体和包被链霉亲和素，室温反应2h。离心将沉淀重悬于含2% BSA的50mMPBS溶液，封闭2h。将包被anti-FITC抗体的胶乳微球和包被链霉亲和素的胶乳微球 1:1 混合，混合胶乳溶解于含表面活性剂、稳定剂及抗菌剂等的PBS缓冲液即得胶乳增强免疫比浊试剂。
（5）免疫检测
目标样本检测：
完成步骤（3）后，从反应液中取20uL溶液，加入免疫检测反应杯，在自动生化仪或者特定蛋白分析仪上检测。反应杯中预装胶乳增强免疫比浊试剂，反应2分钟，记录反应度A1。
空白检测：取20uL步骤（3）中的CRISPR/Cas空白反应液（没有加入DNA样本的反应液），加入免疫检测反应杯，在自动生化仪或者特定蛋白分析仪上检测。反应杯中预装胶乳增强免疫比浊试剂，反应2分钟，记录反应度A0。免疫检测原理示意见附图1。
（6）本发明的结果判定
使用本公司的EZ-100特定蛋白检测仪检测，根据得到的反应度计算比值，判断目标核酸序列是否存在：
比值=（A0 - A1）/A0
根据公式计算统计阳性样品的比值得出：
比值＞10%时，则判定待测样品检测阳性；
比值≤10%时，则判定待测样品检测阴性。
（7）特异性
特异性是指某一检测方法对可能引起交叉反应的相关非目标菌株的抗干扰能力。选择14种常见肺炎的病原菌,这些病原菌包括了引起呼吸道感染的常见革兰阳性菌和革兰阴性菌以及引起人类疾病的支原体。对这些病原菌进行检测,来评价本发明的特异性,具有一定的代表性。所选取的13株病原菌的纯化标准菌株的检测结果均为阴性，表明该发明方法在特异性上表现良好。
实施例2
本实施例基于qPCR扩增联合Cas12a，可定量检测肺炎支原体的核酸序列。
人工配制不同浓度的靶标核酸溶液（0，0.1，2，20，200，1000，2000拷贝/uL）。
使用实施例一（1）到（5）的方法检测不同核酸溶液的反应度。qPCR扩增反应5个循环后用EZ-100特定蛋白检测仪检测反应度，之后每5个循环检测一次，连续检测45个循环，结果显示反应度A1随靶标DNA浓度和反应时间的增加而减少。
选取扩增反应35个循环为节点，绘制反应度差值（A0-A1）与靶标核酸浓度的曲线(图2)，结果显示反应度差值和靶标核酸浓度具有较高的线性相关性；进一步选取线性相关性强的靶标核酸浓度范围（0.1，2，20，200，1000拷贝/uL）绘制标准曲线，线性方程为y＝8.0308x+19.306，相关系数R2＝0.9986。
（4）取已知浓度的肺炎支原体DNA溶液作为受检样品，进行反应。
在本实施例采用的反应体系下，核酸浓度在0.1-1000拷贝/ul范围内可以用该方法进行精确定量。
Claims (10)
1.一种基于CRISPR/Cas系统的核酸片段检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
待检测的核酸样本进行扩增或者逆转录后扩增；
根据目标核酸片段设计crRNA，以扩增后的核酸样本为模版引导CRISPR/Cas系统非限制性地剪切信号分子；
剪切后的信号分子与检测体系中的胶乳微球反应，引起浊度变化，通过测定浊度定性或者定量地检测目标核酸片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于待检测的核酸样本既可以是DNA样本，也可以是RNA样本。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于CRISPR/Cas系统采用的Cas蛋白是Cas12或者Cas13蛋白。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所用的信号分子是寡核苷酸链。
5.根据权利要求4所述的信号分子，其特征在于寡核苷酸链可以是单链DNA（ssDNA）,或者是单链RNA（ssRNA）。
6.根据权利要求5所述的寡核苷酸链，其特征在于寡核苷酸链的两端各有一个可以被特异性识别的分子。
7.根据权利要求6所述的被特异性识别的分子，其特征在于这个分子是抗原、抗体、生物素中的一种或两种。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的胶乳微球是包被有抗体、抗原或者链霉亲和素的胶乳微球。
9.根据权利要求8所述的胶乳微球，其特征在于微球的直径为50~500纳米。
10.根据权利要求8所述的胶乳微球，其特征在于所述微球包被的抗体、抗原或者链霉亲和素可以特异性地识别信号分子寡核苷酸链两端的分子。
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