CN117568451A - 一种乳制品免扩增的检测试剂盒、检测方法及应用 - Google Patents

一种乳制品免扩增的检测试剂盒、检测方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117568451A
CN117568451A CN202311714499.8A CN202311714499A CN117568451A CN 117568451 A CN117568451 A CN 117568451A CN 202311714499 A CN202311714499 A CN 202311714499A CN 117568451 A CN117568451 A CN 117568451A
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
detection
dna
milk
quality control
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311714499.8A
Other languages
English (en)
Inventor
陈爱亮
王楠
张娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of CAAS
Original Assignee
Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of CAAS filed Critical Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of CAAS
Priority to CN202311714499.8A priority Critical patent/CN117568451A/zh
Publication of CN117568451A publication Critical patent/CN117568451A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种乳制品免扩增的检测试剂盒、检测方法及应用，涉及乳制品检测技术领域。本发明提供的检测试剂盒可以简化检测步骤，无需进行核酸扩增，直接检测样品中牛奶DNA含量，有效地减少了扩增引入的潜在偏差，使得定量结果更加准确。乳制品DNA浓度与乳制品含量呈现直接正比关系。这种线性关系使得DNA含量成为一种可靠的指标，可直接反映样品中的乳制品含量。由此消除了对标准曲线的需求，减少了实验的复杂性和不确定性，并节省了时间和资源。同时，通过利用基于胶体金的侧流层析试纸条，可实现可视化检测和定量分析，避免了繁琐的操作步骤和昂贵的设备的需求，极大地提高了检测效率。

Description

一种乳制品免扩增的检测试剂盒、检测方法及应用
技术领域
本发明涉及乳制品检测技术领域，具体而言，涉及一种乳制品免扩增的检测试剂盒、检测方法及应用。
背景技术
目前，乳制品掺假形式繁多，需要多样性的检测技术来有效应对。提供高效、快速、准确的方法进行乳制品的检测，对于打击乳制品掺假，维护市场秩序，确保乳制品的质量和真实性具有重要意义。
传统核酸扩增技术如qPCR、LAMP和RPA等方法，尽管具有高灵敏度，能够检测微量存在的目标核酸，但通常需要几个小时才能产生结果，且需要昂贵的设备和专业技术人员的支持。
此外，核酸扩增过程容易受到引物偏好性、引物二聚体和非特异性扩增的影响，由此引入误差和偏差，导致难以实现准确的定量分析。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种乳制品免扩增的检测试剂盒、检测方法及应用，通过去除核酸扩增步骤，以更简便、迅速、经济实惠的方法进行乳制品中乳源性成分的鉴定。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种乳制品免扩增的DNA检测试剂盒，其包括：第一探针、第二探针、DNA聚合酶、无dNTP的反应缓冲液和试纸条，其中，第一探针带有可被检测的第一标记物和/或具有化学修饰物，第二探针带有可被检测的第二标记物或具有巯基修饰；且第一探针和第二探针至少一个探针上具有标记物；第一标记物与第二标记物不同；且第一探针和第二探针能分别与待测乳制品核酸分子的同一模板链的不同区域进行特异性结合形成DNA杂交链；
试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维膜上设置有质控线和检测线，质控线上包被有能与标记物结合的偶联物，和/或，能与第一探针或第二探针反向互补的质控序列；
检测线上包被有能与标记物结合的偶联物，和/或，能与第一探针或第二探针反向互补的质控序列；且质控线和检测线上不同时为质控序列。
本发明提供了一种适用于乳制品中DNA检测的试剂盒，与现有技术相比，本发明提供的试剂盒无需对待测核酸样本进行扩增，通过将待测核酸解螺旋，在DNA聚合酶的作用下，第一探针与第二探针分别通过碱基互补配对与模板链特异性结合，形成DNA杂交链，在反应体系中不添加dNTP，引物的延伸过程受到阻碍，扩增反应终止。借助试纸条实现目标DNA的捕获和检测，当待测样本含有目标DNA，在层析的作用下，目标DNA-第一探针-第二探针的复合体经过检测线时，检测线上的偶联物或质控序列能与该复合体上的标记物或探针序列结合，进而显色。过量的探针-标记物复合物或探针被试纸条上的质控线上的偶联物结合或被互补的质控序列捕获，进而显色。进而通过肉眼观察显色结果或设备检测条带信号强度实现乳制品中DNA检测。
本发明选择高丰度的线粒体DNA作为乳制品鉴别的标志物，设计并合成互补的第一探针和第二探针，以实现高灵敏度的检测。
本发明创新性地引入了一种新的DNA杂交方法，名为“LAMP-Like Hybridization(HybLAMP-Like)”，该方法在DNA杂交的过程中最大程度地减少了靶标互补链与DNA探针之间的竞争，从而提高了杂交的特异性和效率。
本发明提供的检测试剂盒可以简化检测步骤，无需进行核酸扩增，可以在短时间内完成检测。同时，通过利用基于胶体金的侧流层析试纸条，可实现可视化检测和定量分析，避免了繁琐的操作步骤和昂贵的设备的需求，极大地提高了检测效率。
本发明具有广泛应用潜力，能够在各种应用场景中发挥作用，为乳制品行业的可持续发展和市场竞争提供重要支持。经检测，本发明通过的试剂盒可检测低至1％含量的牛奶掺假。本发明有助于可靠、高效和经济实惠的乳制品鉴别。
在一种可选的实施方式中，上述第一探针和第二探针可以同时设置标记物；也可在其中一个探针上设置标记物，在另一个探针上修饰巯基；也可在其中一个探针上同时设置标记物和巯基修饰，在另一个探针上设置另一种标记物。本领域的技术人员可以根据需要进行调整设置，第一探针可以是报告探针，也可以是捕获探针；第二探针可以是报告探针，也可以是捕获探针。二者只要不同时标记相同的标记物均可行。
试纸条上的检测线或质控线可以设置质控序列也可不设置，仅仅通过与标记物特异性结合的偶联物进行结合，均可行。
在本发明应用较佳的实施方式中，第一探针的3’端修饰有化学修饰物；第二探针的3’端修饰有第二标记物。试纸条的质控线上包被有能与第一探针反向互补的质控序列；检测线上包被有能与第二标记物结合的偶联物。化学修饰物为巯基时，巯基修饰能够使得探针与胶体金颗粒进行共价偶联。巯基与金之间可以形成强烈的金硫键。
在一种可选的实施方式中，质控序列上偶联有第三标记物复合物。
在一种可选的实施方式中，第三标记物复合物选自如下至少一种的组合：多克隆抗体与单克隆抗体、生物素与链霉亲和素和抗蛋白质标签的抗体与蛋白质标签。
在一种可选的实施方式中，蛋白质标签包括不限于：谷胱甘肽转移酶、多聚组氨酸、V5标签、MBP标签、mCherry标签、Flag多肽以及免疫球蛋白的Fc段。
在一种可选的实施方式中，第一标记物和第二标记物选自生物素、荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体中的至少一种。当第一探针上带有第一标记物，同时第二探针上带有第二标记物时，此时第一标记物与所述第二标记物不同，以方便根据不同的标记物进行检测定量。
在一种可选的实施方式中，荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。
在可选的实施方式中，催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
在可选的实施方式中，放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。
在一种可选的实施方式中，化学发光试剂选自吖啶酯、鲁米诺、光泽精、甲壳动物荧光素、联吡啶钌、二氧环乙烷、洛粉碱、异鲁米诺和过氧草酸盐中的至少一种。
在一种可选的实施方式中，胶体选自胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶；
在一种可选的实施方式中，胶体金属选自胶体金、胶体银和胶体硒。
上述无dNTP的反应缓冲液例如选自dNTP-free LAMP mix。本领域的技术人员可以根据需要进行调整。
在一种可选的实施方式中，第一探针和第二探针能分别与待测乳制品的线粒体DNA中的特异性基因进行特异性结合。
线粒体DNA具有拷贝数高，且存在物种间差异的特点。对其差异片段的检测分析能够用于乳制品中掺假物质(如牛奶)的检测，针对线粒体DNA提供的免扩增DNA检测方法具有灵敏度高，特异性好，耗时少的技术优势。
本领域的技术人员可以根据现有的公共数据库(如NCBI)通过分析获得不同物种的特异性DNA序列，作为该物种的特异性基因，从而用于该物种乳制品的检测。
在一种可选的实施方式中，特异性基因选自12S RNA编码序列、D-loop基因、Bos-Cytb基因、coxI基因、编码ATP8的基因、编码ATP6的atp8基因和编码ATP6的atp6基因。
具体地，特异性基因包括不限于：编码细胞色素B的Cytochrome b基因(cytB)、核糖体小亚基12S RNA编码序列(12S ribosomal RNA)、细胞色素C亚基I(cytochrome Coxidase subunit I)的编码基因coxI、编码ATP8及ATP6的atp8及atp6基因以及控制区D-loop片段。这些区域的序列变异适中，即在种内有一定的保守性，又体现出一定的中间差异。
在一种可选的实施方式中，第一探针和第二探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1-2所示。质控序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
DNA聚合酶为Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶或Klenow片段；
优选地，DNA聚合酶选自等温扩增酶；
优选地，DNA聚合酶为具有解螺旋功能和促进探针与模板链结合功能的DNA聚合酶；
优选地，DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；
优选地，化学修饰物选自氨基、地高辛、巯基、叠氮、醛基、甲基、乙酰化和磷酸基。
在其他实施方式中，上述试剂盒还包括适用于上述方法的其他必要试剂和缓冲液。包括不限于ddH2O。
第二方面，本发明还提供了一种DNA检测试剂盒在乳制品中掺假定性检测或掺假定量检测中应用。
第三方面，本发明还提供了一种乳制品免扩增的DNA检测方法，其包括如下步骤：
(i)将待测乳制品的核酸分子、第一探针、第二探针和DNA聚合酶混合反应；混合反应的反应体系不含dNTP，其中，第一探针带有可被检测的第一标记物和/或具有化学修饰物，第二探针带有可被检测的第二标记物或具有巯基修饰；且第一探针和第二探针至少一个探针上具有标记物；第一标记物与第二标记物不同；且第一探针和第二探针能分别与待测乳制品核酸分子的同一模板链的不同区域进行特异性结合形成DNA杂交链；
(ii)将反应产物上样至试纸条上，获得试纸条的显色结果，和/或，检测标记物的水平；
试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维膜上设置有质控线和检测线，质控线上包被有能与标记物结合的偶联物，和/或，能与第一探针反向互补的质控序列；
检测线上包被有能与标记物结合的偶联物，和/或，能与第二探针反向互补的质控序列；且质控线和检测线上不同时为质控序列。
本发明创新性地引入了一种新的DNA杂交方法，名为“LAMP-Like Hybridization(HybLAMP-Like)”，该方法在DNA杂交的过程中最大程度地减少了靶标互补链与DNA探针之间的竞争，从而提高了杂交的特异性和效率。
本发明提供的检测方法，简化了检测步骤，无需进行核酸扩增，可以在短时间内完成检测。同时，通过利用基于胶体金的侧流层析试纸条，可实现可视化检测和定量分析，避免了繁琐的操作步骤和昂贵的设备的需求，极大地提高了检测效率。
本发明具有广泛应用潜力，能够在各种应用场景中发挥作用，为乳制品行业的可持续发展和市场竞争提供重要支持。经检测，本发明通过的试剂盒可检测低至1％含量的牛奶掺假。本发明有助于可靠、高效和经济实惠的乳制品鉴别。
在本发明应用较佳的实施方式中，待测乳制品选自非人哺乳动物的奶制品；
在一种可选的实施方式中，非人哺乳动物选自牛、羊、马、鼠、骆驼、驴、狗、兔、猴和鹿中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，非人哺乳动物的奶制品选自牛奶、水牛奶、牦牛奶、山羊奶、绵羊奶、马奶、驴奶和骆驼奶中的至少一种。
在本发明应用较佳的实施方式中，第一探针的3’端修饰有巯基；第二探针的3’端修饰有第二标记物；
试纸条的质控线上包被有能与第一探针反向互补的质控序列；检测线上包被有能与第二标记物结合的偶联物。
在一种可选的实施方式中，质控序列上偶联有第三标记物复合物；
在一种可选的实施方式中，第三标记物复合物选自如下至少一种的组合：多克隆抗体与单克隆抗体、生物素与链霉亲和素和抗蛋白质标签的抗体与蛋白质标签；
在一种可选的实施方式中，第一标记物和第二标记物选自生物素、荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，荧光染料选自荧光素类染料及其衍生物、罗丹明类染料及其衍生物、Cy系列染料及其衍生物、Alexa系列染料及其衍生物和蛋白类染料及其衍生物；
在一种可选的实施方式中，荧光素类染料选自异硫氰酸荧光素或其类似物、羟基荧光素或其类似物，和四氯光素或其类似物；
在一种可选的实施方式中，胶体选自胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶；
在一种可选的实施方式中，胶体金属选自胶体金、胶体银和胶体硒。
在本发明应用较佳的实施方式中，第一探针和第二探针能分别与待测乳制品的线粒体DNA中的特异性基因进行特异性结合；
在一种可选的实施方式中，特异性基因选自12S RNA编码序列、D-loop基因、Bos-Cytb基因、coxI基因、编码ATP8的基因、编码ATP6的atp8基因和编码ATP6的atp6基因。
在一种可选的实施方式中，第一探针和第二探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1-2所示。
在本发明应用较佳的实施方式中，DNA聚合酶为Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶或Klenow片段；
优选地，DNA聚合酶选自等温扩增酶；
优选地，DNA聚合酶为具有解螺旋功能和促进探针与模板链结合功能的DNA聚合酶；
优选地，DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；
优选地，当DNA聚合酶为BstDNA聚合酶时，将待测乳制品的核酸分子、第一探针、第二探针和DNA聚合酶混合反应的条件包括：62-65℃反应20 -30min，95℃反应5-10min。
在其他实施方式中，DNA聚合酶的浓度和反应温度可以根据特定的检测要求进行调整。
如Phi29 DNA聚合酶的最适温度为37-42℃，Taq酶最适温度为55-65℃，并需预先设置95℃反应5min从而使得DNA双链变性。
在本发明应用较佳的实施方式中，步骤(ii)中，将反应产物上样至试纸条上，20-40min，获得试纸条的显色结果，和/或，检测标记物的水平。本领域的技术人员可以直接根据试纸条的显色结果判断是否有目标乳制品DNA，从而初步判定是否掺假，也可根据检测装置的检测结果更为准确的进行目标乳制品的定量。
在一种可选的实施方式中，采用检测装置检测标记物的水平。
在一种可选的实施方式中，检测装置为光学检测设备、荧光读数仪、化学发光免疫分析仪、放射性免疫分析仪或时间分辨荧光免疫分析仪；
在一种可选的实施方式中，记录试纸条上检测线和质控线处的峰面积，计算检测线与质控线比值：T/C；建立含待测乳制品中的目标物质的标准品的浓度与T/C值的标准曲线，根据标准曲线获得待测样本中目标物质的含量；
在一种可选的实施方式中，目标物质为牛奶。
在本发明应用较佳的实施方式中，每50ul的步骤(i)中的反应体系包括：15μL的dNTP-free LAMP mix，4.5μL的10μM带有第一标记物的第一探针或带有第二标记物的第二探针(终浓度0.9μM)，1μL 10μM带有第二标记物的第二探针或带有第一标记物的第一探针(终浓度0.2μM)，80ng待测乳制品的核酸分子。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种适用于乳制品中DNA检测的试剂盒，与现有技术相比，本发明提供的试剂盒无需对待测核酸样本进行扩增，通过将待测核酸解螺旋，在DNA聚合酶的作用下，第一探针与第二探针分别通过碱基互补配对与模板链特异性结合，形成DNA杂交链，在反应体系中不添加dNTP，引物的延伸过程受到阻碍，扩增反应终止。借助试纸条实现目标DNA的捕获和检测，当待测样本含有目标DNA，在层析的作用下，目标DNA-第一探针-第二探针的复合体经过检测线时，检测线上的偶联物或质控序列能与该复合体上的标记物或探针序列结合，进而显色。过量的探针-标记物复合物或探针被试纸条上的质控线上的偶联物结合或被互补的质控序列捕获，进而显色。进而通过肉眼观察显色结果或设备检测条带信号强度实现乳制品中DNA检测。
(2)本发明选择高丰度的线粒体DNA作为乳制品鉴别的标志物，设计并合成互补的第一探针和第二探针，以实现高灵敏度的检测。
(3)本发明创新性地引入了一种新的DNA杂交方法，名为“LAMP-LikeHybridization(HybLAMP-Like)”，该方法在DNA杂交的过程中最大程度地减少了靶标互补链与DNA探针之间的竞争，从而提高了杂交的特异性和效率。
(4)本发明提供的检测试剂盒可以简化检测步骤，无需进行核酸扩增，直接检测样品中牛奶DNA含量，有效地减少了扩增引入的潜在偏差，使得定量结果更加准确。乳制品DNA浓度与乳制品含量呈现直接正比关系。这种线性关系使得DNA含量成为一种可靠的指标，可直接反映样品中的乳制品含量。由此消除了对标准曲线的需求，减少了实验的复杂性和不确定性，并节省了时间和资源。同时，通过利用基于胶体金的侧流层析试纸条，可实现可视化检测和定量分析，避免了繁琐的操作步骤和昂贵的设备的需求，极大地提高了检测效率。
(5)本发明具有广泛应用潜力，能够在各种应用场景中发挥作用，为乳制品行业的可持续发展和市场竞争提供重要支持。经检测，本发明通过的试剂盒可检测低至1％含量的牛奶掺假。本发明有助于可靠、高效和经济实惠的乳制品鉴别。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为基于试纸条的HybLAMP-Like检测法用于乳制品中牛奶的定性和定量检测示意图；
图2为通过可视化(A)和信号强度值(B)的特异性测试结果图(1：牛奶；2：牦牛奶；3：水牛奶；4：山羊奶；5：绵羊奶；6：马奶；7：驴奶；8：骆驼奶；0：空白对照；1a和1b、1c分别指代3次重复)；
图3为通过可视化(A)和信号强度值(B)的灵敏度分析结果图(1:200ng；2:100ng；3:50ng；4:25ng；5:12.5ng；6:6.25ng；7:3.125ng；8:1.5625ng；0:空白对照；a，b，c分别为不同的重复处理)；
图4为基于试纸条的HybLAMP-Like检测方法进行牛奶掺假适用性分析结果图((A)牛奶和水牛奶不同比例混合物的可视化检测结果；(B)牛奶掺假比例与T/C值之间的线性关系。1：100％牛奶(纯牛奶)；2：80％牛奶；3：60％牛奶；4：40％牛奶；5：20％牛奶；6：10％牛奶；7：5％牛奶；8：1％牛奶；9：0％牛奶(纯水牛奶)；0：空白对照；a，b，c分别为不同的重复处理)；
图5为使用基于试纸条的HybLAMP-Like检测法检测12种市售乳制品中的牛源性成分的结果图((A)可视化检测；(B)基于LFS阅读器的信号强度检测；(C)实时PCR检测(1：牦牛奶A；2：牦牛奶B；3：水牛奶A；4：水牛奶B；5：山羊奶A；6：山羊奶B；7：马奶A；8：马奶B；9：驴奶A；10：驴奶B；11：骆驼奶A；12：骆驼奶B；a，b，c分别为不同的重复处理))。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种用于检测乳制品中牛奶掺假的检测方法，该方法通过目标DNA的特异性杂交反应结合侧流层析试纸条实现可视化检测和定量分析。
具体而言，采用乳制品免扩增的DNA检测试剂盒进行检测，试剂盒包括：第一探针、第二探针、bst酶、dNTP-free LAMP mix和试纸条。
1.牛奶DNA特异性探针的设计
在本实施例中，以牛奶中的D-loop基因为特异性检测靶标。首先，通过使用MEGA软件进行多重序列比对，确定牛特异性区间。然后，设计两段特异性探针，并通过Primer 5.0软件进行检测，以确保探针之间不存在自杂交引物二聚体和交叉引物二聚体。探针的3'端分别修饰为巯基和FITC，以实现后续的LFS可视化检测(表1)序列1中的Poly(T)是为了提供一定的空间位阻，便于探针与模板单链的结合。
表1.本发明的探针序列
2.样品准备和DNA提取
本实施例中，涉及的样品包括各种类型的乳制品，如牛奶、水牛奶、牦牛奶、山羊奶、绵羊奶、马奶、驴奶和骆驼奶，这些样品购自多家奶厂和超市。在其他实施例中，可仅提取某一特定的待测乳制品中的DNA。
首先，从每个样品中提取DNA，以验证其真实性。DNA提取采用磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒(Tiangen,DP329)，并稍微修改了标准操作流程。具体步骤包括：取1ml奶于离心管中，加入等体积CL buffer。涡旋振荡混合，并离心以弃上清液。加入100μL GSbuffer，300μL裂解液GHL，和30μL蛋白酶K，混合均匀后置于65℃孵育30min。随后按照说明书的操作步骤继续进行DNA提取。使用Nanodrop 2000测量DNA的纯度和含量，并将提取得到的DNA在-20℃长期储存。
3.纳米金-DNA探针制备
使用24nm胶体金的制备方法制备纳米金-DNA探针。首先浓缩胶体金，然后将步骤1中巯基修饰的第一探针加入胶体金溶液中，进行反应。随后加入NaCl使其终浓度为0.3M，并继续反应。通过离心法分离未修饰的DNA探针。最后，用重悬缓冲液重悬红色沉淀，并在4℃保存备用，制得AuNPs-RP。
4.胶体金核酸侧流层析试纸条的制备
制备胶体金核酸试纸条，将样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫按指定顺序组装在PVC底板上，确保它们之间有2mm的重叠，以确保样品层析的顺利进行。制备生物素化质控序列(control capture probe)和抗FITC抗体，分别用于制备试纸条的质控线和检测线。
200μL生物素化的控制捕获探针(50μM)与等体积的链酶亲和素(1mg/mL)混合均匀，室温下反应2h。反应完成后，将连接有DNA的生物素与链酶亲和素形成的复合物用划膜喷金仪划到NC膜上，形成质控线。同样，将2mg/mL的抗FITC抗体直接喷在NC膜上作为检测线，两条线之间的距离为5mm。在37℃条件下干燥2h，然后使用KM-3100型数字切割机将LFS切成3mm的宽度，将制备好的试纸条在4℃条件下干燥保存。
5.牛奶DNA杂交反应和LFS检测。
将第一探针和第二探针与牛奶DNA混合进行杂交反应。总反应体系为50μL，包括15μL dNTP-free LAMP mix，4.5μL AuNPs-RP(10μM)，1μL CP(10μM，带有FITC修饰的第二探针)，20μL靶标DNA，剩余体积用ddH2O补足。反应可在PCR热循环仪中进行，设置反应程序为65℃30min,95℃5min。
反应结束后，将杂交产物上样至步骤4的试纸条的样品垫上，反应30分钟，通过肉眼观察试纸条的显色情况。使用ESEQuant LR3 FL Premium(读卡仪)记录试纸条上C线(质控线)和T线(检测线)处的峰面积，计算T/C比值。
具体的检测原理如下：
本发明基于DNA扩增原理的启发，研发了一种高效率的DNA杂交方法，用于在免扩增的条件下实现对乳品中牛源性成分的定量检测(图1)。针对靶标单链的特异性区间设计两段引物，分别作为RP和CP。在bst酶的作用下完成模板DNA双链的解旋和探针与模板链互补区域的结合，这个过程类似于PCR反应中的变性和退火阶段。随后通常需要dNTP来支持引物的延伸，但是在本发明的反应体系中不添加dNTP，由此一来，引物的延伸过程受到阻碍，扩增反应终止，但RP和CP已被结合到模板链的互补区域。其中RP修饰了巯基，并与胶体金偶联形成AuNPs-RP。CP修饰了FITC，可被试纸条T线处的抗FITC抗体捕获。试纸条C线处固定有RP的互补链，命名为控制捕获探针(CCP)。当反应体系中存在靶标DNA时，AuNPs-RP和CP可以与目标物结合，形成ssDNA-(AuNPs-RP)-CP复合体，携带AuNPs流经试纸条，被T线处固定的抗FITC抗体捕获，显示红色条带。反之，如果反应体系中没有靶标DNA，则无法形成ssDNA-(AuNPs-RP)-CP复合体，T线不会变红。而无论如何，过量的AuNPs-RP都会被C线处的CCP捕获并显示红色。
实施例2
本实施例进行牛奶掺假检测的特异性和灵敏度检测。
(1)特异性测试：
为验证实施例1方法的特异性，使用市面上其他常见的易被掺入牛奶的7种高值乳，牦牛奶，水牛奶，山羊奶，绵羊奶，马奶，驴奶和骆驼奶作为阴性对照，按照实施例1中步骤5的方法进行杂交反应，并通过T线的有无判断特异性。
比色结果如图2A所示，只有当体系中含有目标DNA(牛奶)时，才会发生杂交反应，杂交产物在LFS上出现两条明显的红色条带。其他物种均只有C线有红色条带。图2B的读卡仪测试结果与图2A是相互对应的，T线处的特异性信号仅在牛奶反应体系被检测到，其他干扰物种在各T线上的信号强度较低，与空白对照一致。这表明本发明提供的检测方法(LFS-based HybLAMP-Like assay)对目标物种具有高度的特异性。
(2)灵敏度测试：
为了评估灵敏度，本实施例使用实施例1从牛奶中提取的目标DNA，并分别制备为每50μL含200ng、100ng、50ng、25ng、12.5ng、6.25ng、3.125ng、1.5625ng DNA的标准品，按照实施例1步骤5的方法进行检测，获得T/C值，建立T/C值与DNA浓度的标准曲线。
图3A的试纸条结果图和图3B的胶体金峰面积图，从两个不同角度展示了HybLAMP-Like的灵敏度。随着反应体系中牛DNA含量的降低，T线的颜色逐渐变浅。当DNA含量将至12.5ng时，能够观察到明显区分于空白组的红色条带，表明通过可视化LFS检测方法，HybLAMP-Like的灵敏度为12.5ng(图3A)。
以DNA含量为横坐标，以峰面积值和T/C值为双纵坐标，构建用于定量分析的标准曲线，结果如图3B所示，该方法在DNA含量为3.125ng-200ng的范围内具有良好的线性关系(R2＝0.9871)。
同时，实验发现，即使在DNA含量为3.125ng时，在T线处仍有信号检出，这提示，以T/C值进行LFS定量检测可以提高检测灵敏度，并可在一定程度消除外界环境和人为因素对LFS的干扰。
综上，基于LFS-based HybLAMP-Like assay的牛奶DNA检测限为12.5ng(试纸条可视化)，采用读卡仪检测牛奶DNA检测限为3.125ng。
实施例3
本实施例进行乳品中牛奶的掺假检测和定量分析。
以水牛奶为例，将水牛奶与牛奶按不同比例(100％牛奶(纯牛奶)、80％牛奶、60％牛奶、40％牛奶、20％牛奶、10％牛奶、5％牛奶、1％牛奶、0％牛奶(纯水牛奶))混合，制备一系列不同含量的标准样品。
对每个标准样品进行杂交反应和试纸条检测。通过试纸条的颜色变化和T/C比值，确定HybLAMP-Lik方法的检测限，并建立牛奶含量与T/C比值之间的标准曲线，以实现乳品中牛奶的定量分析。
在最佳实验条件下，采用LFS-based HybLAMP-Like assay检测具有不同牛奶含量的水牛奶模拟掺假样品，检测结果以直接肉眼观察和峰面积信号测量两种方式进行表征(图4)。
LFS可视化结果显示，随着牛奶含量的降低，T线处的条带颜色逐渐减弱，最后1％的牛奶显示微弱的红色条带，而纯水牛奶和空白对照只在C线有红色反应，说明LFS-basedHybLAMP-Like assay能够检测到低至1％的牛奶混合样品(图4A)。结合胶体金读卡仪的读数，还可以实现对牛奶含量的定量检测。依据检测体系中牛奶含量与T/C值在一定条件下呈线性关系的原理，以牛奶含量为横坐标，以T/C值为纵坐标作图，建立标准曲线。到牛奶含量在1％-100％之间时，T/C值与牛奶含量百分比呈现良好的线性关系，R2＝0.9727，标准曲线方程为Y＝0.3319x+0.0964。相关系数＞0.90，显示了该方法有较好的准确度，也表明了从掺假乳品中定量检测出牛源性掺假范围为1％-100％，满足对常见掺假事件的定量检测需求(图4B)。
本发明在操作上更加简单，耗时更短，为乳品中牛源性成分的快速定量检测提供了广阔的应用前景。
DNA不易受到食品加工方式的影响，稳定性更高，能够满足对各类加工乳制品的检测需求。目前已报道的DNA定量检测方法，如实时荧光PCR和数字PCR，以及最近发展的数字LAMP等温扩增方法，他们都涉及到DNA的扩增。这会引入一些潜在的偏差，因为不同DNA片段的扩增效率可能不同，导致定量不准确。另外，这些方法需要标准曲线来将荧光信号与DNA浓度关联起来，这意味着需要准备已知浓度的标准物质，这可能是昂贵且耗时的。最后，DNA的高扩增效率也会带来气溶胶污染的风险，导致样品间或实验室间的交叉污染，对实验结果的准确性和重现性造成负面影响。
与此相比，本发明提供的LFS-based HybLAMP-Like assay跳过了核酸扩增步骤，直接检测样品中牛奶DNA含量，有效地减少了扩增引入的潜在偏差，使得定量结果更加准确。牛奶DNA浓度与牛奶含量呈现直接正比关系。这种线性关系使得DNA含量成为一种可靠的指标，可直接反映样品中的牛奶含量。由此消除了对标准曲线的需求，减少了实验的复杂性和不确定性，并节省了时间和资源。
实施例4
本实施例进行实际乳制品的检测。
为验证该方法在实际乳制品检测中的实用性，购买不同品牌的乳制品样品，包括牦牛奶、水牛奶、山羊奶、马奶、驴奶和骆驼奶。从样品中提取DNA后，使用该方法进行定性和定量检测，确保检测结果的准确性。同样，还使用实时荧光PCR方法验证检测结果的可靠性。
杂交产物的试纸条可视化结果显示，有5个样品(1,2,4,5,6)在T线处产生了不同深浅程度的红色条带，说明这些样乳品中含有牛奶(图5A)。结合LFS reader，获得各检测样品T和C线的峰面积。将得到的T/C值采用已建立的标准曲线(Y＝0.3319x+0.0964)进行计算，获得牛乳含量百分比(图5B，表2)。同时，采用金标准实时PCR进行交叉验证，结果也显示了一致性(图5C，表2)。
通过LFS-based HybLAMP-Like assay获得的牛乳含量与基于实时PCR得到的Ct值大小趋势一致，说明本发明建立的方法是准确和可靠的，能够用来评估牛奶掺假的程度。LFS-based HybLAMP-Like assay与实时PCR一致的结果证明本发明的检测方法是一种有效的工具，用于在乳品中精确测定牛奶成分的含量。
表2.基于试纸条的HybLAMP-Like和实时PCR检测法检测市售乳品中牛源性成分结果
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种乳制品免扩增的DNA检测试剂盒，其特征在于，其包括：第一探针、第二探针、DNA聚合酶、无dNTP的反应缓冲液和试纸条，其中，所述第一探针带有可被检测的第一标记物和/或具有化学修饰物，所述第二探针带有可被检测的第二标记物；且所述第一探针和所述第二探针至少一个探针上具有标记物；所述第一标记物与所述第二标记物不同；且所述第一探针和第二探针能分别与待测乳制品核酸分子的同一模板链的不同区域进行特异性结合形成DNA杂交链；
所述试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维膜上设置有质控线和检测线，所述质控线上包被有能与所述标记物结合的偶联物，和/或，能与所述第一探针或第二探针反向互补的质控序列；
所述检测线上包被有能与所述标记物结合的偶联物，和/或，能与所述第一探针或第二探针反向互补的质控序列；且所述质控线和所述检测线上不同时为质控序列。
2.根据权利要求1所述的DNA检测试剂盒，其特征在于，所述第一探针的3’端修饰有化学修饰物；所述第二探针的3’端修饰有第二标记物；
所述试纸条的质控线上包被有能与所述第一探针反向互补的质控序列；所述检测线上包被有能与所述第二标记物结合的偶联物；
优选地，所述质控序列上偶联有第三标记物复合物；
优选地，所述第三标记物复合物选自如下至少一种的组合：多克隆抗体与单克隆抗体、生物素与链霉亲和素和抗蛋白质标签的抗体与蛋白质标签；
优选地，所述第一标记物和所述第二标记物选自生物素、荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体中的至少一种；
优选地，所述荧光染料选自荧光素类染料及其衍生物、罗丹明类染料及其衍生物、Cy系列染料及其衍生物、Alexa系列染料及其衍生物和蛋白类染料及其衍生物；
优选地，所述荧光素类染料选自异硫氰酸荧光素或其类似物、羟基荧光素或其类似物，和四氯光素或其类似物；
优选地，所述胶体选自胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶；
优选地，所述胶体金属选自胶体金、胶体银和胶体硒；
优选地，所述第一探针和第二探针能分别与待测乳制品的线粒体DNA中的特异性基因进行特异性结合；
优选地，所述特异性基因选自12S RNA编码序列、D-loop基因、Bos-Cytb基因、coxI基因、编码ATP8的基因、编码ATP6的atp8基因和编码ATP6的atp6基因；
优选地，所述第一探针和第二探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-2所示；
优选地，所述DNA聚合酶为Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶或Klenow片段；
优选地，所述DNA聚合酶选自等温扩增酶；
优选地，所述DNA聚合酶为具有解螺旋功能和促进探针与模板链结合功能的DNA聚合酶；
优选地，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；
优选地，所述化学修饰物选自氨基、地高辛、巯基、叠氮、醛基、甲基、乙酰化和磷酸基。
3.如权利要求1-2任一项所述的DNA检测试剂盒在乳制品中掺假定性检测或掺假定量检测中应用。
4.一种乳制品免扩增的DNA检测方法，其特征在于，其包括采用权利要求1-2任一项所述的DNA检测试剂盒进行DNA检测，其如下步骤：
(i)将待测乳制品的核酸分子、第一探针、第二探针和DNA聚合酶混合反应；所述混合反应的反应体系不含dNTP，其中，所述第一探针带有可被检测的第一标记物和/或具有化学修饰物，所述第二探针带有可被检测的第二标记物；且所述第一探针和所述第二探针至少一个探针上具有标记物；所述第一标记物与所述第二标记物不同；且所述第一探针和第二探针能分别与待测乳制品核酸分子的同一模板链的不同区域进行特异性结合形成DNA杂交链；
(ii)将反应产物上样至试纸条上，获得所述试纸条的显色结果，和/或，检测所述标记物的水平；
所述试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维膜上设置有质控线和检测线，所述质控线上包被有能与所述标记物结合的偶联物，和/或，能与所述第一探针反向互补的质控序列；
所述检测线上包被有能与所述标记物结合的偶联物，和/或，能与所述第二探针反向互补的质控序列；且所述质控线和所述检测线上不同时为质控序列。
5.根据权利要求4所述的乳制品免扩增的DNA检测方法，其特征在于，所述待测乳制品选自非人哺乳动物的奶制品；
优选地，所述非人哺乳动物选自牛、羊、马、鼠、骆驼、驴、狗、兔、猴和鹿中的至少一种；
优选地，所述非人哺乳动物的奶制品选自牛奶、水牛奶、牦牛奶、山羊奶、绵羊奶、马奶、驴奶和骆驼奶中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的乳制品免扩增的DNA检测方法，其特征在于，所述第一探针的3’端修饰有巯基；所述第二探针的3’端修饰有第二标记物；
所述试纸条的质控线上包被有能与所述第一探针反向互补的质控序列；所述检测线上包被有能与所述第二标记物结合的偶联物；
优选地，所述质控序列上偶联有第三标记物复合物；
优选地，所述第三标记物复合物选自如下至少一种的组合：多克隆抗体与单克隆抗体、生物素与链霉亲和素和抗蛋白质标签的抗体与蛋白质标签；
优选地，所述第一标记物和所述第二标记物选自生物素、荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体中的至少一种；
优选地，所述荧光染料选自荧光素类染料及其衍生物、罗丹明类染料及其衍生物、Cy系列染料及其衍生物、Alexa系列染料及其衍生物和蛋白类染料及其衍生物；
优选地，所述荧光素类染料选自异硫氰酸荧光素或其类似物、羟基荧光素或其类似物，和四氯光素或其类似物；
优选地，所述胶体选自胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶；
优选地，所述胶体金属选自胶体金、胶体银和胶体硒。
7.根据权利要求5所述的乳制品免扩增的DNA检测方法，其特征在于，所述第一探针和第二探针能分别与待测乳制品的线粒体DNA中的特异性基因进行特异性结合；
优选地，所述特异性基因选自12S RNA编码序列、D-loop基因、Bos-Cytb基因、coxI基因、编码ATP8的基因、编码ATP6的atp8基因和编码ATP6的atp6基因；
优选地，所述第一探针和第二探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-2所示。
8.根据权利要求4所述的乳制品免扩增的DNA检测方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶或Klenow片段；
优选地，所述DNA聚合酶选自等温扩增酶；
优选地，所述DNA聚合酶为具有解螺旋功能和促进探针与模板链结合功能的DNA聚合酶；
优选地，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；
优选地，当所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶时，将待测乳制品的核酸分子、第一探针、第二探针和DNA聚合酶混合反应的条件包括：62-65℃反应20-30min，95℃反应5-10min。
9.根据权利要求4所述的乳制品免扩增的DNA检测方法，其特征在于，所述步骤(ii)中，将反应产物上样至试纸条上，20-40min，获得所述试纸条的显色结果，和/或，检测所述标记物的水平；
优选地，采用检测装置检测所述标记物的水平；
优选地，所述检测装置为光学检测设备、荧光读数仪、化学发光免疫分析仪、放射性免疫分析仪或时间分辨荧光免疫分析仪；
优选地，记录所述试纸条上检测线和质控线处的峰面积，计算检测线与质控线比值：T/C；建立含待测乳制品中的目标物质的标准品的浓度与T/C值的标准曲线，根据标准曲线获得待测样本中目标物质的含量；
优选地，所述目标物质为牛奶。
10.根据权利要求4所述的乳制品免扩增的DNA检测方法，其特征在于，每50ul的所述步骤(i)中的反应体系包括：15μL的dNTP-free LAMP mix，4.5μL的10μM带有第一标记物的第一探针或带有第二标记物的第二探针，1μL 10μM带有第二标记物的第二探针或带有第一标记物的第一探针，80ng待测乳制品的核酸分子，其余为水。
CN202311714499.8A 2023-12-13 2023-12-13 一种乳制品免扩增的检测试剂盒、检测方法及应用 Pending CN117568451A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311714499.8A CN117568451A (zh) 2023-12-13 2023-12-13 一种乳制品免扩增的检测试剂盒、检测方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311714499.8A CN117568451A (zh) 2023-12-13 2023-12-13 一种乳制品免扩增的检测试剂盒、检测方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117568451A true CN117568451A (zh) 2024-02-20

Family

ID=89884412

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311714499.8A Pending CN117568451A (zh) 2023-12-13 2023-12-13 一种乳制品免扩增的检测试剂盒、检测方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117568451A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tanabe et al. A real-time quantitative PCR detection method for pork, chicken, beef, mutton, and horseflesh in foods
CA2568238C (en) Methods and compositions for assaying analytes
EP2044219B1 (en) Detectable nucleic acid tag
EP0664339A1 (en) Method of discriminating nucleic acid and testing set for discriminating nucleic acid
WO2011062933A2 (en) Array-based proximity ligation association assays
CN111505275B (zh) 一种基于Cas9核酸等温扩增的免疫层析多重基因检测方法
US20080305486A1 (en) Signal amplification using circular hairpin probes
US20230323424A1 (en) Controls for proximity detection assays
CN108728554A (zh) 荧光法试纸条及使用该荧光法试纸条的快速鉴别羊肉掺假方法
EP1890146A1 (en) Method for detecting of nucleic acid
CN116042777A (zh) 多交叉扩增结合生物传感检测结核分枝杆菌复合群的引物组合和检测方法
CN110055340A (zh) 一种食品中牛源成分快速检测方法及试剂盒
US8080375B2 (en) Methods and kits for detecting an enzyme capable of modifying a nucleic acid
CN108841828B (zh) 一种特异性识别妥布霉素的单链dna适配体及其应用
CN117568451A (zh) 一种乳制品免扩增的检测试剂盒、检测方法及应用
JP3289907B2 (ja) ｄｓＤＮＡ抗体の化学発光アッセイ法
US20080286793A1 (en) Method of analysis of primary structural change of nucleic acid
CN115605610A (zh) 用于检测不同丰度的分析物的方法
CN109321677B (zh) 一种rpa结合免疫荧光层析特异性检测h1甲流亚型的方法
Kurbanov et al. Immune-enzyme methods of food safety analysis
KR101919365B1 (ko) 핵산효소를 이용한 눈물 내 나트륨 이온을 검출하기 위한 조성물 및 이를 이용한 나트륨 이온 검출 방법
CN111257559A (zh) 一种微生物快速定性定量的试剂盒以及快速定性定量的方法
JPH09168400A (ja) 核酸の定量方法
CN117512072A (zh) 一种核酸分子的免扩增检测方法、试剂盒及其应用
Wang et al. Amplification-free quantitative detection of genomic DNA using lateral flow strips for milk authentication

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination