CN117512072A - 一种核酸分子的免扩增检测方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核酸分子的免扩增检测方法、试剂盒及其应用，涉及核酸检测技术领域。本发明使用探针为引物，在DNA聚合酶的作用下，完成了模板双链的解旋和引物与模板链的结合，且在反应体系中不添加dNTP，此时引物的延伸过程将受到阻碍，从而实现了探针与目标单链的高效结合。高效结合后的DNA杂交链可以借助现有的检测设备对带有可被检测的标记物的探针进行检测，通过反应产物中标记物的水平，从而判定是否含有目的基因。该方法具有杂交效率高、检测效率高、检测应用范围广、快速、准确的技术优势。

Description

一种核酸分子的免扩增检测方法、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体而言，涉及一种核酸分子的免扩增检测方法、试剂盒及其应用。

背景技术

DNA在生物体内以双螺旋形式稳定存在，其互补链与探针争夺与目标单链结合的机会，因此如何有效地获取目标DNA的单链并使其与互补探针高效结合是一项具有挑战性的任务。

目前，已经报道了多种关于非扩增的DNA杂交检测方法，现有技术大多采用高温变性和低温复性的方式来实现靶标单链与探针的杂交。然而，这种方法的杂交效率并不高，因为部分模板链不可避免地会与互补单链发生杂交，导致信号干扰和低效的检测。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种核酸分子的免扩增检测方法、试剂盒及其应用以提高杂交效率和检测效率。受到DNA扩增原理的启发，本发明创新性地开发了一种新的方法，旨在提高DNA杂交效率和检测效率。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种核酸分子的免扩增检测方法，检测方法不以疾病的诊断为目的，其包括如下步骤：将第一探针、第二探针、DNA聚合酶与待测核酸分子混合反应，反应体系不含dNTP，其中，第一探针和第二探针中的至少一个探针带有可被检测的标记物，检测反应产物中标记物的水平；第一探针和第二探针能分别与待测核酸分子的同一模板链的不同区域进行特异性结合形成DNA杂交链。

本发明的创新性地引入了新的DNA杂交方法，命名为“LAMP-Like Hybridization(HybLAMP-Like)”，该方法有效提高了非扩增的DNA的检测效率，尤其是线粒体DNA的检测效率，克服了现有技术的对于杂交效率、检测效率限制。

本发明使用探针为引物，在DNA聚合酶的作用下，完成了模板双链的解旋和引物与模板链的结合，且在反应体系中不添加dNTP，此时引物的延伸过程将受到阻碍，从而实现了探针与目标单链的高效结合。高效结合后的DNA杂交链可以借助现有的检测设备对带有可被检测的标记物的探针进行检测，通过反应产物中标记物的水平，从而判定是否含有目的基因。

本发明中，待测核酸分子可以是来自环境样本、生物样本的任何DNA序列。包括不限于：土壤、海洋、石油、农药污染土、植物、动物、微生物等样本。

本发明提供的方法无需扩增，仅仅通过DNA聚合酶反应，使得第一探针和第二探针结合到单链DNA上获得DNA杂交链，然后通过后续的检测即可实现定性或定量检测。

在本发明应用较佳的实施方式中，DNA聚合酶为Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶或Klenow片段。

在一种可选的实施方式中，DNA聚合酶选自等温扩增酶。

在本发明应用较佳的实施方式中，DNA聚合酶为具有解螺旋功能和促进探针与模板链结合功能的DNA聚合酶。

在一种可选的实施方式中，等温扩增酶选自Bst DNA聚合酶。

在一种可选的实施方式中，由于Phi29 DNA聚合酶只具有DNA聚合功能，不具备解旋功能，须在杂交反应体系中另外添加重组酶和单链DNA结合蛋白来实现核酸的变性(RPA反应原理)。

在本发明应用较佳的实施方式中，可被检测的标记物选自生物素、荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体中的至少一种。

在一种可选的实施方式中，荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。

在可选的实施方式中，催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

在可选的实施方式中，放射性同位素包括但不限于²¹²Bi、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、²¹¹At、¹²⁵I、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹³Bi、³²P、⁹⁴mTc、⁹⁹mTc、²⁰³Pb、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴³Sc、⁴⁷Sc、¹¹⁰mIn、⁹⁷Ru、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁸Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、¹²¹Sn、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁰⁵Rh、¹⁷⁷Lu、¹⁷²Lu和¹⁸F。

在一种可选的实施方式中，化学发光试剂选自吖啶酯、鲁米诺、光泽精、甲壳动物荧光素、联吡啶钌、二氧环乙烷、洛粉碱、异鲁米诺和过氧草酸盐中的至少一种。

胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。

在可选的实施方式中，胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。

在一种可选的实施方式中，第一探针和第二探针二者中的任意一个为报告探针，另一个为捕获探针。报告探针用于报告目标基因的含量，捕获探针用于将核酸分子与固相结合，从而方便后续针对固相表面结合的核酸分子进行分离、检测。

当所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶时，第一探针、第二探针、DNA聚合酶与待测核酸分子混合反应条件为62-65℃反应20-30min，95℃反应5-10min。在其他实施方式中，DNA聚合酶的浓度和反应温度可以根据特定的检测要求进行调整。

如Phi29 DNA聚合酶的最适温度为37-42℃，Taq酶最适温度为55-65℃，并需预先设置95℃反应5min从而使得DNA双链变性。

第二方面，本发明提供了一种免扩增的DNA杂交检测的试剂盒，其包括：第一探针、第二探针、DNA聚合酶、无dNTP的反应缓冲液和固相，其中，第一探针和第二探针中的至少一个探针带有可被检测的标记物；第一探针和第二探针能分别与待测核酸分子的同一模板链的不同区域进行特异性结合形成DNA杂交链；固相选自试纸条、纳米颗粒、磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球、乳胶微球、试管、EP管、多孔板微量反应板凹孔、NC膜、PDMS膜或芯片；固相上具有能与DNA杂交链上的标记物结合的偶联物或物理连接物，或能与DNA杂交链上的探针序列互补的核苷酸序列。

无dNTP的反应缓冲液例如选自dNTP-free LAMP mix。本领域的技术人员可以根据需要进行调整。

缓冲液的选择与杂交反应体系中DNA酶类型相关，缓冲液是为了提供DNA聚合酶充分发挥其活性的环境。如杂交体系中的酶为Taq聚合酶，则缓冲液为dNTP-free PCR mix；如杂交体系中的酶为Phi29DNA聚合酶，则缓冲液为dNTP-free RPA mix。

磁珠也称磁性微球，磁性微球是指通过适当的方法使有机高分子和无机磁性纳米粒子结合起来形成特殊结构的具有一定磁性复合微球。磁珠包括不限于纳米磁珠和微米磁性微球。在一种可选的实施方式中，磁珠包括不限于：羧基磁珠、氨基磁珠、油胺修饰磁珠、硅羟基磁珠、磺酸基磁性微球、巯基磁性微球、PEG修饰磁珠、无修饰四氧化三铁磁珠、单分散硅包磁、环氧基磁珠、单分散介孔硅包磁、金包磁性纳米颗粒、链霉亲和素修饰磁珠、多聚赖氨酸修饰磁珠、镍磁珠、磁性聚苯乙烯微球、磁性聚丙烯酰胺微球、二氧化硅磁性微球。

乳胶微球是由无定形聚合物(通常是聚苯乙烯)形成的胶体尺寸范围内的球形聚合物颗粒，例如直径小于100nm的颗粒，或者粒径为0.3-0.5μm的颗粒，或者粒径超过1μm的颗粒。

乳胶微球包括不限于表面修饰有羟基、羧基或Toysal中至少一种功能基团的乳胶微球。

纳米颗粒选自有机纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。

物理连接包括不限于静电吸附等。

在本发明应用较佳的实施方式中，第一探针和第二探针二者中的任意一个为报告探针，另一个为捕获探针。

在本发明应用较佳的实施方式中，当固相为试纸条时，捕获探针上带有第二标记物，报告探针上带有第一标记物和/或具有化学修饰物；且试纸条包括依次设置的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维膜上设置有质控线和检测线，质控线上包被有能与第一标记物结合的偶联物和/或与捕获探针互补的质控序列；检测线上包被有能与第二标记物结合的偶联物或物理连接物。

试纸条的检测原理如下：针对靶标单链的特异性区间设计两段探针，分别作为RP(报告探针)和CP(捕获探针)。在DNA聚合酶的作用下完成模板DNA双链的解旋和探针与模板链互补区域的结合，这个过程类似于PCR反应中的变性和退火阶段。随后通常需要dNTP来支持引物的延伸，但是在反应体系中不添加dNTP，由此一来，引物的延伸过程受到阻碍，扩增反应终止，但RP和CP已被结合到模板链的互补区域。其中，RP修饰了巯基(在其他实施方式中也可修饰其他基团)和/或第一标记物，并与胶体金偶联形成AuNPs-RP，在试纸条的检测线(T线)处包被有能与第二标记物结合的偶联物或物理连接物(如抗体)。CP修饰了可被检测的第二标记物，可被试纸条的质控线处的与第二标记物结合的偶联物(如抗体)捕获；和/或，在试纸条的质控线处设置能与捕获探针的互补的质控序列，也命名为质控捕获探针(CCP)。

当反应体系中存在靶标DNA时，胶体金标-报告探针(AuNPs-RP)和CP可以与靶标DNA结合，形成ssDNA-(AuNPs-RP)-CP复合体，携带AuNPs流经试纸条，被T线处固定的抗捕获探针的抗体(即抗第二标记物的偶联物)捕获，显示红色条带。

反之，如果反应体系中没有靶标DNA，则无法形成ssDNA-(AuNPs-RP)-CP复合体，T线虽然能够与CP结合，但由于未结合上AuNPs-RP，从而不会变红。而无论如何，过量的AuNPs-RP都会被C线处的CCP捕获并显示红色，作为试纸条的有效对照。

在一种可选的实施方式中，质控线上包被的偶联物与第一标记物选自如下至少一种的组合：多克隆抗体与单克隆抗体、生物素与链霉亲和素和抗蛋白质标签的抗体与蛋白质标签。

在一种可选的实施方式中，质控线上包被有：链霉亲和素-生物素-质控序列的复合物。

在一种可选的实施方式中，蛋白质标签选自谷胱甘肽转移酶、多聚组氨酸、V5标签、MBP标签、mCherry标签、Flag多肽以及免疫球蛋白的Fc段。

在一种可选的实施方式中，第二标记物选自生物素、荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体；

在一种可选的实施方式中，检测线上包被的偶联物与第二标记物选自如下任意一种的组合：抗生物素的抗体与生物素、抗荧光染料的抗体与荧光染料、底物与催化底物显色的酶；

在一种可选的实施方式中，荧光染料选自荧光素类染料及其衍生物、罗丹明类染料及其衍生物、Cy系列染料及其衍生物、Alexa系列染料及其衍生物和蛋白类染料及其衍生物；

在一种可选的实施方式中，荧光素类染料选自异硫氰酸荧光素、羟基荧光素、四氯光素或其类似物；

化学修饰物选自氨基、地高辛、巯基、叠氮、醛基、甲基、乙酰化和磷酸基，从而与胶体、有机纳米颗粒、量子点纳米颗粒及稀土络合物纳米颗粒等偶联。

叠氮标记可以与炔基修饰的官能团反应，通过叠氮化炔环加成反应生成稳定的键，这种反应通常称为点击反应，该反应中二者会形成1,2,3-三唑环，并且该反应具有高度的化学选择性和反应速率，因此可以实现生物分子的特异性捕获、标记或交联等目的。

炔基官能团可以与偶氮化物(例如叠氮化物)在存在铜催化剂的条件下进行点击化学反应，形成C-N键。这种反应在生物标记、药物研究和基因组学研究中有着广泛的应用。

巯基可以将引物连接到很多固相载体表面上，含有巯基修饰的引物容易被氧化生成二硫键，使用前需要用二硫苏糖醇(DTT)或三-(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)进行化学还原。

氨基可用于将多种化学物质(例如荧光、淬灭基团、蛋白、抗体等)连接至寡核苷酸或用于将寡核苷酸连接至固体表面。

在一种可选的实施方式中，报告探针具有巯基修饰。

在本发明应用较佳的实施方式中，当固相为磁珠时，磁珠表面修饰有与标记物结合的偶联物或物理连接物；

在一种可选的实施方式中，磁珠表面的偶联物或物理连接物与标记物选自如下至少一种的组合：生物素与链霉亲和素和抗蛋白质标签的抗体与蛋白质标签；

在一种可选的实施方式中，蛋白质标签选自谷胱甘肽转移酶、多聚组氨酸、V5标签、MBP标签、mCherry标签、Flag多肽以及免疫球蛋白的Fc段。

在其他实施方式中，上述试剂盒还包括适用于上述方法的其他必要试剂和缓冲液。包括不限于磁珠洗涤缓冲液、ddH₂O。

第三方面，本发明还提供了一种核酸免扩增检测系统，其包括：

杂交反应装置和检测装置，杂交反应装置用于：维持第一探针、第二探针、DNA聚合酶与待测核酸分子混合反应的温度；

检测装置用于：检测上述的DNA杂交链。

在本发明应用较佳的实施方式中，检测装置为光学检测设备、荧光读数仪、化学发光免疫分析仪、放射性免疫分析仪或时间分辨荧光免疫分析仪。

在一种可选的实施方式中，该系统可用于实时监测DNA杂交反应并提供实时检测结果。

第四方面，本发明还提供了试剂盒以及上述的核酸免扩增检测系统在病原微生物检出、外源基因检测中的应用，应用不以疾病的诊断为目的。

本发明具有以下有益效果：

本发明的创新性地引入了新的DNA杂交方法，命名为“LAMP-Like Hybridization(HybLAMP-Like)”，该方法有效提高了非扩增的DNA的检测效率，尤其是线粒体DNA的检测效率，克服了现有技术的对于杂交效率、检测效率限制。

本发明使用探针为引物，在DNA聚合酶的作用下，完成了模板双链的解旋和引物与模板链的结合，且在反应体系中不添加dNTP，此时引物的延伸过程将受到阻碍，从而实现了探针与目标单链的高效结合。高效结合后的DNA杂交链可以借助现有的检测设备对带有可被检测的标记物的探针进行检测，通过反应产物中标记物的水平，从而判定是否含有目的基因。

本发明提供的方法无需扩增，仅仅通过DNA聚合酶反应，使得第一探针和第二探针结合到单链DNA上获得DNA杂交链，然后通过后续的检测即可实现定性或定量检测。

本发明提供的检测方法和检测试剂盒可以满足任意的待测核酸分子的检测，样本可以是来自环境样本、生物样本的任何DNA序列。包括不限于：土壤、海洋、石油、农药污染土、植物、动物、微生物等样本。具有检测应用范围广，快速，准确的技术优势。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为生物素-链霉亲和素免疫测定法对不同反应条件下的DNA杂交产物检测结果(Ⅰ：dNTP-free LAMP mix，65℃20分钟，95℃5分钟，4℃保存；Ⅱ：杂交缓冲液，95℃10分钟，4℃保存；Ⅲ：dNTP-free LAMP mix，65℃30分钟，4℃保存；Ⅳ：空白对照，仅有链霉亲和素磁珠和洗涤缓冲液)；

图2为基于侧流层析试纸条的HybLAMP-Like检测示意图；

图3为基于侧流层析试纸条的HybLAMP-Like可视化检测结果(P：阳性对照；N：空白对照)；

图4为基于侧流层析试纸条的HybLAMP-Like信号强度检测结果(P：阳性对照；N：空白对照)。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

为验证本发明提供的核酸分子的免扩增检测方法、核酸分子的免扩增检测系统(HybLAMP-Like反应系统)的可行性，本实施例采用生物素-链霉亲和素免疫分析法进行了测试。以下是该实验的详细步骤：

1.准备反应体系

准备含有水牛奶DNA。

准备修饰有生物素的RP(报告探针，report probe)和修饰有FITC的CP(捕获探针，capture probe)。

RP：GTCAGGTGTGTTGATGGTTGTA；

CP:CATTCGGAGTAGTAGGGTCATA。

2.进行杂交反应

将目标DNA样本与修饰有生物素的PR和修饰有FITC的CP按照上述描述的HybLAMP-Like反应体系进行杂交反应。杂交反应体系总体积50μL，包括：dNTP-free LAMP mix 20μL，DNA模板20μL，RP(10μM)2.5μL，CP(10μM)2.5μL，ddH₂O补足。杂交反应条件是：65℃反应20min，95℃反应5min，4℃保存。

3.加入链霉亲和素磁珠

反应结束后，加入10μL链霉亲和素磁珠到反应体系中。

4.震荡孵育

在室温下震荡孵育反应混合物，使链霉亲和素磁珠与反应产物结合，孵育时间为30分钟。

5.收集磁珠

将反应混合物置于磁场下，以收集链霉亲和素磁珠。

6.清洗磁珠

使用洗涤缓冲液(含有10mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA，1M NaCl，0.05％Tween-20)清洗链霉亲和素磁珠。此步骤需要重复5次，以确保彻底清洗磁珠。

7.荧光测定

加入100μL洗涤缓冲液，随同链霉亲和素磁珠一起加入到384-well板中。

实施例2

本实施例提供了一种试纸条和试剂盒，试纸条的制备过程如下：

1.胶体金制备

在一个装有回流冷凝装置的圆底烧瓶中，加热50mL的HAuCl₄水溶液(1mM)至沸腾状态。向烧瓶中加入0.6mL柠檬酸三钠溶液(194mM)。在强磁力搅拌下继续加热回流，直到溶液的颜色由无色逐渐变成深红色。继续加热5分钟后，将溶液冷却至室温。使用0.22μM尼龙膜过滤去除大颗粒，然后将其储存在4℃的冰箱中备用。

2.纳米金-DNA探针的制备

首先将胶体金进行5倍浓缩。将500μL的巯基修饰的报告探针(10μM，1OD)加入500μL浓缩后的胶体金溶液中，室温下反应16h。分三次加入2M NaCl，使其终浓度为0.3M，室温下继续反应12小时。将反应混合物在4℃条件下离心，离心速度为16,100×g，离心40min，然后弃掉上清以去除未修饰的DNA探针。红色沉淀用1mL的重悬缓冲液(0.3M NaCl，10mM PB缓冲液，pH 7.4)重悬，此过程重复三次。最后用500μL的重悬缓冲液重悬，然后在4℃条件下保存备用。

3.试纸条的组装

采用PVC底板组装胶体金核酸试纸条，按层析方向从左到右分别为样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。所有部分重叠2mm，以确保在检测过程中样品层析的顺利进行。200μL生物素化的控制捕获探针(50μM)与等体积的链酶亲和素(1mg/mL)混合均匀，室温下反应2h。反应完成后，将连接有DNA的生物素与链酶亲和素形成的复合物用划膜喷金仪划到NC膜上，形成质控线。同样，将2mg/mL的抗FITC抗体直接喷在NC膜上作为检测线，两条线之间的距离为5mm。在37℃条件下干燥2h，然后使用KM-3100型数字切割机将LFS切成3mm的宽度，将制备好的试纸条在4℃条件下干燥保存。

4.反应条件和检测

总反应体系为50μL，包括25μL dNTP-free LAMP mix，2.5μL AuNPs-RP(纳米金报告探针)，2.5μL CP(10μM捕获探针)，和20μL水牛奶DNA。反应可在PCR热循环仪中进行，设置反应程序为65℃ 30分钟，95℃ 5分钟。反应结束后，将杂交产物与50μL上样缓冲液(10mMTris-HCl，1×SSC，3％PEG20000，pH 8.0)混合均匀。插入试纸条，反应30分钟，确保所有的反应液都经由试纸条完成反应。观察试纸条的显色情况，并使用ESEQuant LR3 FL Premium(Qiagen,German)对试纸条NC膜上C和T线处的信号强度进行测定，通过峰面积获取值，并计算T/C比值。

dNTP-free LAMP mix包括：1X Isothermal Amplification Buffer(NEB,M0538)，6mM MgSO₄，320U/ml Bst 2.0DNA Polymerase(NEB,M0538)。

检测原理如下：本实施例针对靶标单链的特异性区间设计两段引物，分别作为RP和CP。在bst酶的作用下完成模板DNA双链的解旋和探针与模板链互补区域的结合，这个过程类似于PCR反应中的变性和退火阶段。随后通常需要dNTP来支持引物的延伸，但是在反应体系中不添加dNTP，由此一来，引物的延伸过程受到阻碍，扩增反应终止，但RP和CP已被结合到模板链的互补区域。其中RP修饰了巯基和生物素，并与胶体金偶联形成AuNPs-RP。在试纸条的质控线(C线)处包被有能抗生物素的抗体。CP修饰了FITC，可被试纸条的T线处的抗FITC抗体捕获。试纸条的C线处固定有RP的互补链，命名为控制捕获探针(CCP)或质控捕获探针。当反应体系中存在靶标DNA时，AuNPs-RP和CP可以与目标物结合，形成ssDNA-(AuNPs-RP)-CP复合体，携带AuNPs流经试纸条，被T线处固定的抗FITC抗体捕获，显示红色条带。反之，如果反应体系中没有靶标DNA，则无法形成ssDNA-(AuNPs-RP)-CP复合体，T线不会变红。而无论如何，过量的AuNPs-RP都会被C线处的CCP捕获并显示红色，作为试纸条的有效对照(图2)。

试纸条结果显示，阳性对照的T线有红色条带生成，而空白对照仅质控线有红色条带；同样的，阳性反应的T/C值明显高于空白对照，初步证实了该方法能够实现探针与靶标ssDNA间的杂交(图3，图4)。

这里需要说明的是，在杂交反应中，bst酶扮演着关键的催化角色。该酶的活性使反应在恒定的65℃温度下迅速进行。然而，需要注意的是，酶与模板链的结合可能会对后续的杂交双链与试纸条的反应产生干扰。因此，在反应完成后，采用了高温处理的策略，将温度升至95℃，以实现bst酶的热失活。这一步骤的目的是引发酶构象的改变，从而使酶从模板链中解离。在其他实施方式中，也可采用酶失活剂(如EDTA(乙二酸))；化学失活剂(如蛋白酶K)；pH变化(如NaOH)等实现bst酶的失活。

在其他实施方式中，也可对核酸进行梯度稀释，通过T/C比值与核酸浓度的关系建立定量标准曲线，即可实现定量检测。

对比例1

为了评估HybLAMP-Lik方法的杂交效率，本实施例与传统的“高温解旋，低温退火”的DNA杂交方法进行了比较。

图1中的Ⅱ是传统的杂交方法，即通过高温解旋，低温退火的方法实现探针与靶标链的杂交。

传统杂交方式所选用的缓冲液的具体体系为：10mM PB，1M NaCl，20mM MgCl₂，pH7.4。

与实施例1相比，区别仅在于杂交反应温度不同，其他步骤相同，采用传统的高温解旋，低温退火的DNA杂交方法。采用杂交缓冲液，95℃10分钟，4℃保存。

对比例2

鉴于实施例1在HybLAMP-Lik中引入了95℃的酶热失活步骤，这可能会影响DNA杂交双链的稳定性，因此还设置了不包括95℃酶失活步骤的对比例。

实验例1

使用TECAN safire plate reader(TECAN,Brno,Czech Republic)，设置激发波长λex＝488nm，发射波长λem＝525nm处测定实施例1和对比例1-2各孔的荧光强度。

为了验证HybLAMP-Lik检测系统的准确性，采用生物素-链霉亲和素免疫分析法对杂交产物进行了表征。

结果参照图1所示，与空白对照组相比,各阳性组的荧光值明显增加，说明杂交反应成功进行。

特别地，在图1-Ⅰ和图1-Ⅲ中观察到的荧光值明显高于图1-Ⅱ，这表明了本发明HybLAMP-Lik方法的杂交效率明显优于其他方法。此外，注意到图1-Ⅰ和图1-Ⅲ之间的荧光值差异并不显著(P<0.05)，这表明在该反应体系下，95℃的酶热失活步骤对DNA杂交双链稳定性的影响相对较小。

综上，基于生物素-链霉亲和素免疫分析法的检测结果与试纸条一致，进一步证实了HybLAMP-Lik方法可以成功用于DNA杂交反应。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种核酸分子的免扩增检测方法，其特征在于，所述检测方法不以疾病的诊断为目的，其包括如下步骤：将第一探针、第二探针、DNA聚合酶与待测核酸分子混合反应，反应体系不含dNTP，其中，所述第一探针和第二探针中的至少一个探针带有可被检测的标记物，检测反应产物中标记物的水平；所述第一探针和第二探针能分别与待测核酸分子的同一模板链的不同区域进行特异性结合形成DNA杂交链。

2.根据权利要求1所述的核酸分子的免扩增检测方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶或Klenow片段；

优选地，所述DNA聚合酶选自等温扩增酶；

优选地，所述DNA聚合酶为具有解螺旋功能和促进探针与模板链结合功能的DNA聚合酶；

优选地，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

3.根据权利要求1所述的核酸分子的免扩增检测方法，其特征在于，所述可被检测的标记物选自生物素、荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体中的至少一种；

优选地，所述荧光染料选自荧光素类染料及其衍生物、罗丹明类染料及其衍生物、Cy系列染料及其衍生物、Alexa系列染料及其衍生物和蛋白类染料及其衍生物；

优选地，所述荧光素类染料选自异硫氰酸荧光素、羟基荧光素、四氯光素或其类似物；

优选地，所述第一探针和第二探针二者中的任意一个为报告探针，另一个为捕获探针；

优选地，当所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶时，所述第一探针、第二探针、DNA聚合酶与待测核酸分子混合反应条件为62-65℃反应20-30min，95℃反应5-10min。

4.一种免扩增的DNA杂交检测的试剂盒，其特征在于，其包括：第一探针、第二探针、DNA聚合酶、无dNTP的反应缓冲液和固相，其中，所述第一探针和第二探针中的至少一个探针带有可被检测的标记物；所述第一探针和第二探针能分别与待测核酸分子的同一模板链的不同区域进行特异性结合形成DNA杂交链；所述固相选自试纸条、纳米颗粒、磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球、乳胶微球、试管、EP管、多孔板微量反应板凹孔、NC膜、PDMS膜或芯片；所述固相上具有能与所述DNA杂交链上的标记物结合的偶联物或物理连接物，或能与所述DNA杂交链上的探针序列互补的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述第一探针和第二探针二者中的任意一个为报告探针，另一个为捕获探针。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，当所述固相为试纸条时，所述捕获探针上带有第二标记物，所述报告探针上带有第一标记物和/或具有化学修饰物；且所述试纸条包括依次设置的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维膜上设置有质控线和检测线，所述质控线上包被有能与所述第一标记物结合的偶联物和/或与所述捕获探针互补的质控序列；所述检测线上包被有能与所述第二标记物结合的偶联物或物理连接物；

优选地，所述质控线上包被的偶联物与所述第一标记物选自如下至少一种的组合：多克隆抗体与单克隆抗体、生物素与链霉亲和素和抗蛋白质标签的抗体与蛋白质标签；

优选地，所述质控线上包被有：链霉亲和素-生物素-质控序列的复合物；

优选地，所述蛋白质标签选自谷胱甘肽转移酶、多聚组氨酸、V5标签、MBP标签、mCherry标签、Flag多肽以及免疫球蛋白的Fc段；

优选地，所述第二标记物选自生物素、荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体；

所述化学修饰物选自氨基、地高辛、巯基、叠氮、醛基、甲基、乙酰化和磷酸基；

优选地，所述检测线上包被的偶联物与所述第二标记物选自如下任意一种的组合：抗生物素的抗体与生物素、抗荧光染料的抗体与荧光染料、底物与催化底物显色的酶；

优选地，所述荧光染料选自荧光素类染料及其衍生物、罗丹明类染料及其衍生物、Cy系列染料及其衍生物、Alexa系列染料及其衍生物和蛋白类染料及其衍生物；

优选地，所述荧光素类染料选自异硫氰酸荧光素、羟基荧光素、四氯光素或其类似物；

优选地，所述报告探针具有巯基修饰。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，当所述固相为磁珠时，所述磁珠表面修饰有与所述标记物结合的偶联物或物理连接物；

优选地，所述磁珠表面的偶联物或物理连接物与所述标记物选自如下至少一种的组合：生物素与链霉亲和素和抗蛋白质标签的抗体与蛋白质标签；

优选地，所述蛋白质标签选自谷胱甘肽转移酶、多聚组氨酸、V5标签、MBP标签、mCherry标签、Flag多肽以及免疫球蛋白的Fc段。

8.一种核酸免扩增检测系统，其特征在于，其包括：

杂交反应装置和检测装置，所述杂交反应装置用于：维持第一探针、第二探针、DNA聚合酶与待测核酸分子混合反应的温度；

所述检测装置用于：检测权利要求1中所述的DNA杂交链。

9.根据权利要求8所述的核酸免扩增检测系统，其特征在于，所述检测装置为光学检测设备、荧光读数仪、化学发光免疫分析仪、放射性免疫分析仪或时间分辨荧光免疫分析仪。

10.如权利要求4-7任一项所述的试剂盒以及权利要求8-9任一项所述的核酸免扩增检测系统在病原微生物检出、外源基因检测中的应用，所述应用不以疾病的诊断为目的。