CN117343160A - 一种低温酸法提取海蜇中胶原蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，且公开了一种低温酸法提取海蜇胶原蛋白的方法。以海蜇为原料，脱盐后进行匀浆处理，利用柠檬酸溶液低温浸提48h，破坏分子间盐键和希夫碱键，离心收集上清液，上清液经盐析、透析后，冷冻干燥，得到酸溶性胶原蛋白。本发明采用低温酸法提取，最大程度地保持了胶原蛋白的三螺旋完整结构，所得酸溶性胶原蛋白为白色固体，相对分子质量在300kDa以上，适用于医用生物材料及原料。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种低温酸法提取海蜇中胶原蛋白的方法。以盐渍海蜇为原料，脱盐后进行匀浆处理，利用柠檬酸溶液低温浸提48h，离心收集上清液，经盐析、透析后，冷冻干燥，得到酸溶性胶原蛋白。本发明采用低温酸法提取，最大程度地保持了胶原蛋白的三螺旋完整结构。所得产品分子量为300kDa以上，在医用生物材料领域占有绝对的优势。
背景技术
海蜇是水母的一种，是世界上最古老而神秘的生物之一，大约在6.5亿年前就已经存在于地球上。海蜇属腔肠动物门、钵水母纲、根口水母目、海蜇属，包括海蜇、黄斑海蜇、棒状海蜇和疣状海蜇共4种。为暖水沿岸种、数量巨大，广泛分布于我国4个海区沿海近岸，尤以辽宁、浙江、福建和广东沿海居多。海蜇个体大，由伞部、口腕部和附属器等结构组成，成体伞径达250-600mm，外伞表面光滑，中胶层厚而硬。经加工后，伞部俗称“海蜇皮”，口腕部俗称“海蜇头”，具有很好的营养价值和药用价值。
胶原蛋白是发现最早、含量最丰富的一类细胞外基质蛋白，广泛地存在于人与动物皮肤、肌肉、骨骼及内脏中，对维护细胞、组织和器官的正常生理功能和修复损伤有重要作用。目前已市场化的胶原蛋白产品主要以动物源为主，然而，近年来由于各种人畜共患病的传播，人们对来自陆生动物的胶原及胶原基的产品产生担忧，对于从更原始物种提取和纯化胶原的兴趣日益增加。
1900年人们使用稀释的有机酸首次成功从鼠尾肌腱中提取出胶原，经过不断的研究，胶原蛋白提取工艺日趋成熟，主要有化学(酸、碱、盐)提取法、物理(热水、高压、超声)提取法、生物(酶)提取法。基本原理都是根据胶原蛋白的特性改变蛋白质所在外界环境，从而把胶原蛋白从其他蛋白中分离出来。近年来，随着基因工程技术的发展，采用重组DNA技术，制备重组胶原蛋白也取得了一些进展。但由于缺乏胶原蛋白翻译后修饰中发挥重要作用的酶，使分泌后胶原分子的后修饰加工过程困难化，产品生物学功效不理想。常用的胶原蛋白提取方法主要是围绕酸法和酶法开展的，酸法提取率虽然不及酶法高，但酸法可以最大程度地保持胶原蛋白三螺旋完整结构，在医用生物材料领域占有绝对的优势。
申请号为201510769412.6，发明名称为一种非变性海蜇胶原蛋白的制备方法。提供了一种以腌制海蜇加工下脚料为原料，酶法提取得到非变性胶原蛋白的提取工艺。酶法提取胶原蛋白，溶出率高且胶原具有低抗原性，单α1链分子量为124kDa，可以被很好地溶解和吸收。但是在医用材料方面，对于胶原蛋白的液体吸收性、抗拉性能、撕裂力、断裂伸长率等方面均有严格的要求。胶原蛋白的分子量越大，上述各性能指标越优越。低温酸法提取的胶原蛋白在该领域优势更突出，可以弥补现有的不足。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种低温酸法提取海蜇中胶原蛋白的方法，产品保持了完整的三螺旋结构，分子量在300kDa以上，具有很好的机械性能，适用于医用材料领域。
(二)技术方案
为实现上述低温酸法提取海蜇中的胶原蛋白，本发明提供如下技术方案：
(1)取一定质量的盐渍海蜇，按照W:V＝1:500流水冲洗2h～3h。取一定体积浸泡液，滴加硝酸银至无白色浑浊，脱盐完成。
(2)取脱盐后的样品进行匀浆处理，至样品无明显结块。
(3)取匀浆后的样品(质量以初始样品计)，按照W:V＝1:5比例加入0.5mol/L的柠檬酸溶液，4℃条件下，浸泡48h。
(4)将上述(3)得到的溶液，在4℃下用高速冷冻离心机12000r离心60min，收集滤液。
(5)上清液中缓慢加入氯化钠至浓度1mol/L～5mol/L，4℃下静置24h。将上述液体，在4℃下用高速冷冻离心机10000r离心60min，取沉淀。
(6)将沉淀复溶于0.1mol/L冰乙酸中，将其置于0.05mol/L冰乙酸溶液中透析24h，再置于去离子水中透析48h。
(7)将透析后的样品进行冷冻干燥。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种低温酸法提取海蜇中胶原蛋白的方法，具备以下有益效果：
本发明采用全程低温柠檬酸溶液对海蜇进行酸法提取，提取得到的胶原蛋白最大程度地保持了其三螺旋完整结构。得到的胶原蛋白粗液经膜透析处理，实现了纯化。经SDS-PAGE电泳测定，分子量在300kDa以上，具有很好的机械性能，适用于医用材料领域。
附图说明
图1为本发明酸法提取海蜇中胶原蛋白的工序流程图；
图2为本发明酸法提取海蜇胶原蛋白的SDS-PAGE图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1盐渍海蜇样品预处理
(1)脱盐：取一定质量的盐渍海蜇，按照W:V＝1:500流水冲洗2h～3h。取一定体积浸泡液，滴加硝酸银至无白色浑浊，脱盐完成。
(2)匀浆：取脱盐后的样品进行匀浆处理，至样品无明显结块。
实施例2酸法提取海蜇胶原蛋白
(1)酸浸泡：取匀浆后的样品(质量以初始样品计)，按照W:V＝1:5比例加入0.5mol/L的柠檬酸溶液，4℃条件下，浸泡48h。
(2)离心：将上述溶液，在4℃下用高速冷冻离心机10000r离心60min。
收集上清液
实施例3海蜇胶原蛋白粗液的分离与纯化
(1)蛋白析出：上清液中缓慢加入氯化钠至浓度1mol/L～5mol/L，4℃下静置24h。将上述液体，在4℃下用高速冷冻离心机10000r离心60min，取沉淀。
(2)透析：将沉淀复溶于0.1mol/L冰乙酸中，将其置于0.05mol/L冰乙酸溶液中透析24h，再置于去离子水中透析48h。
(3)冷冻干燥：将透析后的样品进行冷冻干燥。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (3)
1.一种低温酸法提取海蜇中胶原蛋白的方法，其特征在于：
(1)取一定质量的盐渍海蜇，按照W:V＝1:500流水冲洗2h～3h，取一定体积浸泡液，滴加硝酸银至无白色浑浊，脱盐完成；
(2)取脱盐后的样品进行匀浆处理，至样品无明显结块；
(3)取匀浆后的样品(质量以初始样品计)，按照W:V＝1:5比例加入0.5mol/L的柠檬酸溶液，4℃条件下，浸泡48h；
(4)将上述(3)得到的溶液，在4℃下用高速冷冻离心机12000r离心60min，收集滤液；
(5)上清液中缓慢加入氯化钠至浓度1mol/L～5mol/L，4℃下静置24h，将上述液体，在4℃下用高速冷冻离心机10000r离心60min，取沉淀；
(6)将沉淀复溶于0.1mol/L冰乙酸中，将其置于0.05mol/L冰乙酸溶液中透析24h，再置于去离子水中透析48h；
(7)将透析后的样品进行冷冻干燥。
2.一种低温酸法提取海蜇中胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤(3)具体步骤为：取匀浆后的样品(质量以初始样品计)，按照W:V＝1:5比例加入0.5mol/L的柠檬酸溶液，4℃条件下，浸泡48h。
3.一种低温酸法提取海蜇中胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤(6)具体步骤为：将沉淀复溶于0.1mol/L冰乙酸中，将其置于0.05mol/L冰乙酸溶液中透析24h，再置于去离子水中透析48h。
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