CN117338770A - 吲哚-3-甲醇在制备多黏菌素抗菌增效剂中的应用及抗革兰阴性菌药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物医药技术领域，具体公开了吲哚‑3‑甲醇在制备多黏菌素抗菌增效剂中的应用及抗革兰阴性菌药物组合物，所述吲哚‑3‑甲醇在制备多黏菌素抗菌增效剂中的应用，多黏菌素和吲哚‑3‑甲醇的浓度为0.01‑2(μg/mL):0.01‑10mM；所述抗革兰阴性菌药物组合物，包括多黏菌素和吲哚‑3‑甲醇，还包括药学上可接受的辅料和/或载体；所述组合物可制成注射剂、软膏剂或气雾剂，可用于治疗肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌或铜绿假单胞菌等；本申请公开了吲哚‑3‑甲醇能够协同多黏菌素，显著提高多黏菌素对革兰阴性菌的杀菌活性，降低多黏菌素的使用剂量，提高抗菌药效，延长抗菌时效，延缓耐药性产生。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域，更具体地说，它涉及吲哚-3-甲醇在制备多黏菌素抗菌增效剂中的应用及抗革兰阴性菌药物组合物。
背景技术
多黏菌素是从多黏芽孢杆菌培养液中获得的多肽类抗生素，于20世纪50年代上市并应用于临床，因其存在肾毒性等毒副作用，逐渐被其它药物所取。近年来，随着抗菌药物不合理使用的逐渐增加，多重耐药及泛耐药革兰阴性杆菌导致的感染也不断增加，成为威胁人类健康的主要原因之一。因此，多黏菌素类抗菌药物作为多重耐药及泛耐药革兰阴性杆菌感染治疗的有效药物，重新在临床抗革兰阴性菌感染治疗中发挥重要作用。
但由于多黏菌素的毒副作用，利用多黏菌素单药进行治疗时，其临床允许的最大剂量较难达到药物代谢动力学目标值，且易发生细菌异质性耐药，增加患者治疗失败风险。因此，寻找多黏菌素抗菌增效剂，实现多黏菌素与其他抗菌药物联合治疗成为研究热点基于上述陈述，本申请提供了吲哚-3-甲醇在制备多黏菌素抗菌增效剂中的应用及抗革兰阴性菌药物组合物。
发明内容
为了解决多黏菌素单药治疗时，其临床允许的最大剂量较难达到药物代谢动力学目标值，且易发生细菌异质性耐药，增加患者治疗失败风险等缺陷，本申请提供了吲哚-3-甲醇在制备多黏菌素抗菌增效剂中的应用及抗革兰阴性菌药物组合物。
第一方面，本申请提供了吲哚-3-甲醇在制备多黏菌素抗菌增效剂中的应用，采用如下的技术方案：
吲哚-3-甲醇在制备多黏菌素抗菌增效剂中的应用。
优选的，所述多黏菌素和吲哚-3-甲醇的浓度为0.01-2(μg/mL):0.01-10mM。
优选的，所述多黏菌素和吲哚-3-甲醇的浓度为0.125(μg/mL):1mM。
优选的，所述多黏菌素为多黏菌素B、多黏菌素E、多黏菌素B药学上可接受的盐、多黏菌素E药学上可接受的盐中的至少一种。
优选的，所述多黏菌素为多黏菌素B、多黏菌素E、多黏菌素B药学上可接受的盐、多黏菌素E药学上可接受的盐中的至少一种。
第二方面，本申请提供了一种抗革兰阴性菌药物组合物，采用如下的技术方案：
一种抗革兰阴性菌药物组合物，包括上述浓度比的多黏菌素和吲哚-3-甲醇。
优选的，所述抗革兰阴性菌药物组合物，还包括药学上可接受的辅料和/或载体。
优选的，所述组合物剂型包括但不限于注射剂、软膏剂或气雾剂。
优选的，所述革兰阴性菌包括但不限于肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌或铜绿假单胞菌。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
本申请提供了吲哚-3-甲醇在制备多黏菌素抗菌增效剂中的新用途，公开了吲哚-3-甲醇能够协同多黏菌素，显著提高多黏菌素对革兰氏阴性菌的杀菌活性，降低多黏菌素的使用剂量，提高抗菌药效，延长抗菌时效，延缓耐药性产生。
本申请试验所用细菌主要包括肺炎克雷伯菌ATCC43816、鲍曼不动杆菌ATCC17978、大肠埃希菌BW25113、铜绿假单胞菌PA14等革兰阴性条件致病菌；通过最低抑菌浓度(MIC)测定、时间-杀菌动力学实验、棋盘微量稀释法、结晶紫检测生物膜抑制实验等研究，发现了吲哚-3-甲醇能够显著提高了革兰阴性菌对多黏菌素的敏感度，能够协同多黏菌素抗菌增效。
附图说明
图1为本申请实施例2时间-杀菌动力学实验中多黏菌素B和吲哚-3-甲醇联合使用对革兰阴性菌的杀菌曲线图。
图2为本申请实施例3微量棋盘稀释测定法中多黏菌素B和吲哚-3-甲醇在革兰阴性菌中协同作用的代表性热图。
图3为本申请实施例4结晶紫检测生物膜抑制实验中多黏菌素B和吲哚-3-甲醇对生物膜形成的抑制作用图。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
1.菌株来源
本研究选取了四株标准菌株(肺炎克雷伯菌ATCC 43816、鲍曼不动杆菌ATCC17978、大肠埃希菌BW25113、铜绿假单胞菌PA14)。均由安徽省细菌耐药性监测中心实验室保存。以上临床菌株的使用经安徽医科大学第一附属医院伦理委员会批准。
2.试剂
3.仪器
实施例1最低抑菌浓度(MIC)的测定
分别测定多黏菌素B和吲哚-3-甲醇对革兰阴性菌-肺炎克雷伯菌ATCC 43816、鲍曼不动杆菌ATCC 17978、大肠埃希菌BW25113、铜绿假单胞菌PA14的最低抑菌浓度。
活化菌株
穿戴好口罩帽子手套和白大褂，全程在生物安全柜的无菌环境中操作，取灭菌后的50mL离心管，加入5mL的MHB培养基，取出保存于-80℃冰箱中的相应菌株，使用无菌接种环挑取菌液接种于MHB培养基中，放置于220rpm、37℃恒温摇床中，过夜培养，活化菌株。
最低抑菌浓度(MIC)的测定
将上述活化后的过夜菌株用已灭菌的MHB培养基稀释100倍，并置于220rpm、37℃恒温摇床中培养至OD600在0.25-0.3之间(本申请实施例中OD600为2.7)，使细菌处于对数生长期，然后用MHB培养基将菌液稀释至5×105CFU/mL，备用。
将2mL上述稀释菌液加入10mL无菌试管中，分别加入终浓度的多黏菌素B或吲哚-3-甲醇，通过倍比稀释法进行稀释，放置于相同条件(220rpm、37℃)的恒温摇床中培养，12h后观测每管菌液浑浊度，以液体清澈的试管所对应的药品浓度作为最低抑菌浓度(MIC)。所有实验均重复三次。结果见下表1：
表1多黏菌素B和吲哚-3-甲醇对四种革兰阴性菌的最低抑菌浓度表(MIC)
注：PMNB表示多黏菌素B；I3C表示吲哚-3-甲醇
实施例2时间-杀菌动力学实验
用已灭菌的MHB培养基将过夜菌株稀释100倍，置于220rpm、37℃恒温摇床中培养至OD600在0.25-0.3之间(本申请实施例中OD600为2.7)，使细菌处于对数生长期，然后用MHB培养基将菌液稀释至1×108CFU/mL，备用。
在8支无菌试管中分别加入5mL稀释后的菌液，分为多黏菌素B(1/4×MIC)、不同浓度(0.25mM、0.5mM、1mM)的吲哚-3-甲醇、两者联合处理组以及未处理的菌液(对照组)；将试管置于恒温摇床(37℃，220rpm)中培养，分别于不同时间点(2h、4h、8h、12h和24h)，从每支试管中取50μL菌液，加入装有450μL生理盐水的无菌EP管中，接着从上一EP管中取出50μL加入第二个装有450μL生理盐水的无菌EP管中，以此类推，连续稀释至少五个梯度，菌液被稀释10(1)、102(2)、103(3)、……、10n(n)倍。在不同时间点(2h、4h、8h、12h、24h)，分别三次从每个梯度的EP管中，取10μL相应稀释浓度的菌液，点滴于已做好标记的MHA肉汤琼脂平板的固定区域内，待液体吸收，将平板倒置于37℃恒温培养箱，过夜培养。
对每个时间点进行菌落计数，三个点取平均值，得到多黏菌素B和吲哚-3-甲醇联合使用对革兰阴性菌的杀菌曲线，如图1所示。
菌液浓度计算公式：菌液浓度＝第n个梯度下的平均菌落个数×10nCFU/mL。
图1中，PMNB表示多黏菌素B；I3C表示吲哚-3-甲醇。数据来自至少三个独立重复的实验；误差条表示平均值的标准误差。
(A)肺炎克雷伯菌ATCC 43816，(B)鲍曼不动杆菌ATCC 17978，(C)大肠埃希菌BW25113，(D)铜绿假单胞菌PA14，经PMNB(1/4×MIC)，I3C(0.25mM、0.5mM、1mM)单独或联合处理，在不同时间观察其生长情况。
由图1显示可知：多黏菌素B的浓度为1/4×MIC，当使用1mM I3C时，在肺炎克雷伯菌ATCC 43816中，24小时内有效杀灭细菌，杀灭率可达5log10 CFU/mL；在鲍曼不动杆菌ATCC 17978中，24小时细菌杀灭率也达到5log10 CFU/mL；在大肠埃希菌BW25113中，在24小时内两药联合使用介导的致死率显著增强，细菌计数下降了4log10 CFU/mL；在铜绿假单胞菌PA14中，在1/4MIC的多黏菌素B中添加I3C，24小时细菌计数下降了3.7log10 CFU/mL。
实施例3棋盘微量稀释法
用已灭菌的MHB培养基将过夜菌株稀释100倍，置于220rpm、37℃恒温摇床中培养至OD600在0.25-0.3之间(本申请实施例中OD600为2.7)，使细菌处于对数生长期，然后用MHB培养基将菌液稀释至5×105CFU/mL，备用。
将上述稀释后的200μL菌液分别加入96孔微量培养板中，并按照图2所示，将不同浓度的药物多黏菌素B(PMNB)和不同浓度的吲哚-3-甲醇(I3C)两两组合加入菌液，使终浓度梯度以MIC浓度开始，沿着垂直或平行的方向，往下倍比稀释至少5个梯度，且保持在每个垂直和平行的孔内药物浓度保持一致。静置于37℃恒温培养箱中孵育12h。以培养板中未变浑浊的最低浓度为两种药物联合时的有效最低抑菌浓度。
通过公式FIC指数＝MICA药联合/MICA药单药+MICB药联合/MICB药单药，计算出分级抑菌浓度(FIC)指数，结果如图2所示。
FIC指数被定义为：协同作用≤0.5；相加作用0.5-1.0；无关作用1.0-2.0；拮抗作用>2.0。
图2中，PMNB表示多黏菌素B；I3C表示吲哚-3-甲醇；FIC表示部分抑菌浓度指数(也作FICI)；所有结果均重复三次。
PMNB和I3C联合使用对(A)肺炎克雷伯菌ATCC 43816，(B)鲍曼不动杆菌ATCC17978，(C)大肠埃希菌BW25113，(D)铜绿假单胞菌PA14的影响。(E)PMNB和I3C联合使用在不同革兰阴性菌中的等效线图。黑色线条代表等效线，等效线与坐标轴相交区域内的点代表具有协同作用。
由图2显示可知：采用微量棋盘稀释法研究PMNB与I3C联合使用时的协同作用，在对肺炎克雷伯菌ATCC 43816中，两种药物联合使用时，I3C(1mM)存在下，PMNB的MIC降低了8倍(图2A)，FICI约为0.188(FICI<0.5，图2E)。在鲍曼不动杆菌ATCC 17978、大肠埃希菌BW25113、铜绿假单胞菌PA14中的FICI分别为0.258、0.313、0.281(图2E)；当I3C存在时，上述三株菌中PMNB的MIC均降低了4倍(图2B、C、D)。
实施例4结晶紫检测生物膜抑制实验
用已灭菌的MHB培养基将过夜菌株稀释100倍，置于220rpm、37℃恒温摇床中培养至OD600在0.25-0.3之间(本申请实施例中OD600为2.7)，使细菌处于对数生长期，然后用MHB培养基将菌液稀释至5×105CFU/mL，备用。
将上述稀释后的200μL菌液分别移入96孔板中，分为五组进行处理，记作空白对照组、1/4×MIC多黏菌素B组、1/2×MIC多黏菌素B组、1mM吲哚-3-甲醇+1/4×MIC多黏菌素B组、1mM吲哚-3-甲醇+1/2×MIC多黏菌素B组。
在37℃条件下孵育24h后，使用移液枪弃去培养基，使用1×磷酸盐缓冲液洗3次，最后一次将液体尽量吸尽，接着用100μL 95％福尔马林固定细菌生物膜15min，吸去95％福尔马林后置于室温待晾干后，加入0.1％结晶紫溶液100μL染色20min，使用1×磷酸盐缓冲液洗涤2次去除多余的染色，最后37℃干燥1h后用30％乙酸溶液(30mL乙酸与70mL去离子水混合)溶解。使用酶标仪(Tecan,Mannedorf,Switzerland)测量波长为590nm时剩余结晶紫的吸光度，结果如图3所示。
图3中，PMNB表示多黏菌素B；I3C表示吲哚-3-甲醇；数据来自至少三个独立重复的实验；误差条表示平均值的标准误差。
由图3显示可知：在肺炎克雷伯菌ATCC 43816中，与未处理组相比，1/2×MIC的多黏菌素B处理时生物膜清除率为25.8％，在联合I3C处理后生物膜清除率为86.4％。在鲍曼不动杆菌ATCC 17978中，与未处理组相比，1/4×MIC的多黏菌素B处理时生物膜清除率为16.7％，在联合I3C处理后生物膜清除率为30.6％，1/2×MIC的多黏菌素B处理时生物膜清除率为49.8％，在联合I3C处理后生物膜清除率为83.2％。在大肠埃希菌BW25113中，与未处理组相比，1/2×MIC的多黏菌素B处理时生物膜清除率为49.8％，在联合I3C处理后生物膜清除率为83.2％。在铜绿假单胞菌PA14中，与未处理组相比，1/4×MIC的多黏菌素B处理时生物膜清除率为14.1％，在联合I3C处理后生物膜清除率为58.9％，1/2×MIC的多黏菌素B处理时生物膜清除率为25.3％，在联合I3C处理后生物膜清除率为63.7％。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (8)
1.吲哚-3-甲醇在制备多黏菌素抗菌增效剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的吲哚-3-甲醇在制备多黏菌素抗菌增效剂中的应用，其特征在于，所述多黏菌素和吲哚-3-甲醇的浓度为0.01-2(μg/mL):0.01-10mM。
3.根据权利要求1所述的吲哚-3-甲醇在制备多黏菌素抗菌增效剂中的应用，其特征在于，所述多黏菌素和吲哚-3-甲醇的浓度为0.125(μg/mL):1mM。
4.根据权利要求1所述的吲哚-3-甲醇在制备多黏菌素抗菌增效剂中的应用，其特征在于，所述多黏菌素为多黏菌素B、多黏菌素E、多黏菌素B药学上可接受的盐、多黏菌素E药学上可接受的盐中的至少一种。
5.一种抗革兰阴性菌药物组合物，其特征在于，包括权利要求1-4任一项中的多黏菌素和吲哚-3-甲醇。
6.根据权利要求5所述的抗革兰阴性菌药物组合物，其特征在于，还包括药学上可接受的辅料和/或载体。
7.根据权利要求5所述的抗革兰阴性菌药物组合物，其特征在于，所述组合物剂型包括但不限于注射剂、软膏剂或气雾剂。
8.根据权利要求5所述的抗革兰阴性菌药物组合物，其特征在于，所述革兰阴性菌包括但不限于肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌或铜绿假单胞菌。
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