CN117327620A - 一株具有溶藻能力的假交替单胞菌及其溶藻应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株具有溶藻能力的假交替单胞菌及其溶藻应用，属于有害赤潮处理的微生物学领域，该菌株为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.J75)，并已于2023年3月9日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：CGMCC No.26780；经过实验证实本发明公开的假交替单胞菌J75的发酵液对温度(‑20℃～80℃)有较高适应性，在pH5～9具有稳定的溶藻活性，说明菌株J75所分泌的除藻活性物质在自然环境中具有较好的适应性，此外，本发明获得的假交替单胞菌J75对中肋骨条藻的溶藻效果很好，24小时内可达到90％以上，对于常见的其它赤潮藻株也具有较好的表现，这些结果表明其具有较高的实际应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及环境微生物领域，尤其涉及一株具有溶藻能力的假交替单胞菌及其溶藻应用。
背景技术
赤潮泛指一定环境条件下一些海洋浮游生物、细菌或原生动物异常繁殖或者聚集的现象，大都会引起海水变色。有害赤潮爆发之后，可以通过多种渠道给海洋生态系统、海水养殖以及人类健康带来威胁，例如产生毒素、造成物理损伤、改变水体条件等。近年来由于水体富营养化加剧导致赤潮灾害愈演愈烈，赤潮灾害问题每况愈下，所以寻找行之有效的方法治理赤潮迫在眉睫。
近年来，人们主要采用各种物理、化学和生物方法来治理赤潮。然而，处理方法高昂的处理成本、有限的可持续性以及负面环境影响对其实施造成了重大挑战。相对于物理和化学方法，生物处理方法因其显著的优点而受到越来越多的关注。水生植物和动物是解决水华的有效工具，但它们在水生生态系统中的功效受到环境条件的限制，利用微生物来减轻藻华危害是一种更具成本效益和环境友好的解决方案。
那些对藻类生长有明显不利影响的细菌被认为是溶藻细菌，它们可以通过直接接触或分泌抑藻物质以及竞争氮磷等营养物质的方式抑制赤潮微藻生长。以溶藻细菌作为一种除藻手段给人们提供了新的除藻思路，具有重要的理论意义和广阔的应用前景，因此溶藻细菌作为控制赤潮的可行性受到广泛关注。因此，技术人员致力于筛选获得高效溶藻细菌或溶藻活性物质，进而开发高效稳定的微生物杀藻剂作为赤潮防控的有效手段。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足而提供的一株具有溶藻能力的假交替单胞菌及其应用，并验证其溶藻细菌或研制的溶藻菌剂在赤潮藻防治中的应用。
本发明提供了一株具有溶藻能力的假交替单胞菌，其为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.J75)，该菌株已于2023年3月9日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：CGMCC No.26780。
一种包含权利要求1所述假交替单胞菌J75在制备溶藻菌剂中的应用。
一种包含权利要求1所述假交替单胞菌J75在制备的溶藻剂中的应用。
一种包括权利要求2或权利要求3假交替单胞菌J75的溶藻细菌或溶藻菌剂在赤潮藻防治中的应用。
本发明还经过验证，该假交替单胞菌J75在赤潮藻防治中，尤其是中肋骨条藻(Skeletonema costatum GY-H11)、米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi GY-H36)、微小原甲藻(Proorocentrum minimum GY-H38)和球形棕囊藻(Phaeocystis globosa GY-H37)，针对这四种藻上具有良好效果。
本发明技术方案的优点：
1、获得的假交替单胞菌J75对中肋骨条藻的溶藻效果很好，24小时内可达到90％以上。
2、假交替单胞菌J75的发酵液对温度(-20℃～80℃)有较高适应性，在pH5～9具有稳定的溶藻活性，说明菌株J75所分泌的除藻活性物质在自然环境中具有较好的适应性，表明其具有较高的实际应用潜力。
3、交替单胞菌J75来源于海洋环境，对环境友好，有很好的应用前景。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1假交替单胞菌J75菌落形态。
图2扫描电子显微镜观察菌株J75形态。
图3假交替单胞菌J75不同组分对中肋骨条藻的溶藻效果。
图4不同浓度发酵滤液对中肋骨条藻的溶藻效果。
图5菌株J75处理中肋骨条藻的扫描电镜图。
图6温度对假交替单胞菌J75发酵滤液溶藻率的影响。
图7pH对假交替单胞菌J75发酵滤液溶藻率的影响。
图8发酵滤液对三种赤潮藻处理72h的溶藻率。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，需要说明的是，在相互不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合具体实施示例对本发明做进一步详细说明。
实施例1假交替单胞菌J75菌株的形态与生理生化特征
见图1-2，本实施例采用分离在浙江省温州市东海海域采集的表层海水，梯度稀释后取200μL稀释液涂布于2216E培养基，经过28℃静置培养，取单菌落划线至新的2216E固体培养基进行培养，重复3次后获得纯化菌株。获得的高效溶藻细菌，命名为假交替单胞菌J75菌株，该菌株已于2023年3月9日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：CGMCC No.26780。。
对菌株J75进行形态观察，结果显示菌株J75有如下生物学特征：菌株J75的菌落呈圆形，淡黄色，表面光滑湿润，菌体呈杆状，无鞭毛。革兰氏染色、甲基红试验结果呈阴性。V-P测定、接触酶测定、氧化酶测定、淀粉水解测定为阳性。葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇利用反应为阳性。
表1假交替单胞菌J75生理生化试验结果
实施例2假交替单胞菌J75溶藻方式研究
将假交替单胞菌J75接种到2216E液体培养基中，在180rpm，28℃条件下培养24小时，所得菌液8000rpm离心3分钟，用0.22μm微滤膜过滤，所得滤液为J75分泌物溶液；
将培养的菌液8000rpm离心3分钟后，去除上清液，用等体积的F/2培养基重悬，得到J75菌体。
向处于指数生长期的中肋骨条藻(Skeletonema costatum GY-H11)中添加等体积的菌株J75菌液的不同组分(菌液、上清液、菌体)，接种体积为5％，以直接加入等体积2216E液体培养基的样品作为对照。
分别在12、24、36、48h对其Chl-a含量进行测定。
结果如图3所示，菌株J75菌液和上清液具有明显的杀藻效果，溶藻率均在80％以上，而J75菌体溶藻率均低于20％，证明菌株J75通过分泌溶藻活性物质杀灭藻细胞。
实施例3不同浓度假交替单胞菌J75发酵滤液对中肋骨条藻的溶藻效果
将在180rpm，28℃条件下活化培养24小时的J75菌液按1％(v/v)转接到新鲜液体2216E培养基，再次发酵培养24小时，所得菌液8000rpm离心3分钟，用0.22μm微滤膜过滤，发酵滤液分别按1％，3％，5％，7％(v/v)添加至处于指数生长期的中肋骨条藻液中进行共培养。
对照组分别添加1％，3％，5％，7％体积的无菌2216E培养基。
实验组与对照组均设置3个重复。
分别在12h、24h、36h取样，每次取2mL培养液，进行Chl-a含量测量，并进一步计算溶藻率。
如图4所示，不同浓度组溶藻率的变化表明菌株J75发酵滤液的溶藻活性存在剂量效应，滤液添加浓度为1％时，藻细胞的生长速度受到阻碍或者停滞，高浓度(3％，5％，7％)溶藻作用十分明显，36h溶藻率均超过90％。
实施例4扫描电子显微镜下假交替单胞菌J75发酵滤液对中肋骨条藻的溶藻过程观察
按5％(v/v)向中肋骨条藻藻液中添加假交替单胞菌J75发酵滤液共同培养18h，使用扫描电子显微镜观察中肋骨条藻的形态变化。
如图5结果表明，中肋骨条藻正常细胞为圆柱形，细胞两端着生长刺，并与下一个细胞相连，细胞直径10μm左右。加入假交替单胞菌J75发酵滤液作用18h后，藻细胞形态发生明显变化，在显微镜视野中基本找不到完整的藻细胞，藻细胞连接刺断裂，硅质壳破碎，细胞内容物流出，视野中只剩下藻细胞碎片。
实施例5温度对假交替单胞菌J75菌株发酵滤液溶藻效果的影响
将在180rpm，28℃条件下活化培养24小时的菌液按1％(v/v)转接到新鲜液体2216E培养基，再次发酵培养24小时，所得菌液8000rpm离心3分钟，用0.22μm微滤膜过滤得到滤液，将滤液分为7份，分别在-20、0、20、40、60、80和100℃下处理2h，然后置于室温(25℃)使滤液温度恢复至室温。
将发酵滤液以5％(v/v)的浓度添加至中肋骨条藻藻液中进行溶藻实验，添加相同体积的2216E培养基作为对照。
24小时后测定对照组和处理组的Chl-a含量，计算溶藻率。
经-20、0、20、40、60、80℃处理的发酵滤液对中肋骨条藻的溶藻率稳定在80％左右，100℃处理组的溶藻效果显著降低，对溶藻效果造成较大影响。
可见假交替单胞菌J75的发酵过滤液在-20℃～80℃具有稳定活性，见图6。实施例6不同pH对假交替单胞菌J75菌株溶藻效果的影响
将在180rpm，28℃条件下活化培养24小时的菌液按1％(v/v)转接到新鲜液体2216E培养基，再次发酵培养24小时，所得菌液8000rpm离心3分钟，用0.22μm微滤膜过滤得到滤液，将滤液分为7份，分别加入HCl或NaOH溶液调节滤液pH至1、3、5、7、9、11和13，静置2h，然后调回到初始pH7。
将处理过的发酵滤液以5％(v/v)的浓度添加至中肋骨条藻藻液中进行溶藻实验，添加相同体积的2216E培养基作为对照。
24小时后测定对照组和处理组的Chl-a含量，见图7，计算溶藻率。
pH5、7、9处理组的菌株J75发酵滤液对中肋骨条藻的溶藻率稳定在70％左右，pH3、11、13处理组的溶藻率低于60％，对溶藻效果造成影响，pH1处理组的溶藻率低于30％，可见假交替单胞菌J75的发酵过滤液对中肋骨条藻的溶藻效果受环境酸碱度的影响，在pH5～9范围内溶藻效果稳定。
实施例7假交替单胞菌J75发酵滤液对三种常见赤潮藻的杀灭作用
将在180rpm，28℃条件下活化培养24小时的菌液按1％(v/v)转接到新鲜液体2216E培养基，再次发酵培养24小时，所得菌液8000rpm离心3分钟，用0.22μm微滤膜过滤得到发酵滤液，按5％(v/v)分别添加至装有供试藻类培养物中，实验藻种包括米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi GY-H36)、微小原甲藻(Proorocentrum minimum GY-H38)和球形棕囊藻(Phaeocystis globosa GY-H37)，向供试藻类培养物中加入相同体积的2216E作为对照。
对72h后的溶藻率进行计算。
结果如图8显示，假交替单胞菌J75发酵滤液72h对米氏凯伦藻和球形棕囊藻溶藻效率在70％以上，对微小原甲藻的溶藻效率在50％以上。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (5)
1.一株具有溶藻能力的假交替单胞菌，为假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.J75)，该菌株已于2023年3月9日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：CGMCC No.26780。
2.一种包含权利要求1所述假交替单胞菌J75在制备溶藻菌剂中的应用。
3.一种包含权利要求1所述假交替单胞菌J75在制备的溶藻剂中的应用。
4.一种包括权利要求1-3任一假交替单胞菌J75的溶藻细菌、溶藻剂或溶藻菌剂在赤潮藻防治中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述赤潮藻包括中肋骨条藻(Skeletonemacostatum GY-H11)、米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi GY-H36)、微小原甲藻(Proorocentrum minimum GY-H38)和球形棕囊藻(Phaeocystis globosa GY-H37)。
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