CN117321205A - 反义寡聚物 - Google Patents

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Abstract

本发明的问题在于提供一种可以在不通过直接修复突变基因的情况下治疗沃纳综合征的反义寡聚物或其药学上允许的盐。本发明提供一种反义寡聚物或其药学上允许的盐，其由与下述碱基序列(i)或碱基序列(ii)互补的碱基序列构成，并且可以使人类WRN基因的第27个外显子跳跃，(i)SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列，(ii)在SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列中，缺失、置换或插入了1个或多个碱基的碱基序列。

Description

反义寡聚物
技术领域
本发明涉及一种反义寡聚物或其药学上允许的盐、病毒载体和药物组合物。
背景技术
沃纳(Werner)综合征表现为进入青春期后迅速衰老、早老性毛发变化(白发、秃头等)、白内障(两侧)、皮肤的萎缩和固化(鸡眼、胼胝等)、形成难治性溃疡、软部组织的钙化(跟腱等)、糖代谢异常、脂质代谢异常、在早期出现的动脉硬化(缺血性心肌病、心肌梗塞等)等症状，是早衰症的一种。随着近年的研究在改善平均寿命的同时，许多患者因为难治性皮肤溃疡所伴随的下肢切断、恶性肿瘤、糖尿病，所以苦于严重的并发症。
在全世界报告的沃纳综合征的患者中，大约80％的是日本人。
沃纳综合征是常染色体隐性(劣性)的遗传性罕见病，该病的原因认为是编码DNA解旋酶的人类WRN基因的异常。(例如参照非专利文献1和2)
近年，对于杜氏肌营养不良症、脊髓性肌萎缩症等一部分遗传性疾病，提倡利用外显子跳跃的治疗药物。例如专利文献1中，作为治疗肌营养不良的手段，公开了用于在包含特定反义化合物的抗肌萎缩蛋白的预处理后的mRNA的处理中产生外显子44的跳跃的组合物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2010/048586号
非专利文献
非专利文献1：Yokote K et al.,Hum Mutat.2017January；38(1):7-15.
非专利文献2：Kato H,et al.,Stem Cell Research.Vol.53,May 2021,102360
发明内容
发明所解决的技术问题
就沃纳综合征而言，是一种除了修复患者中的WRN基因的突变以外没有可以根治的治疗方法的疑难杂症。近年对基因编辑技术等修复基因突变的技术开发寄予期望。然而，就修复全身或病变部位中WRN基因的突变而言，以目前的技术来说临床应用很困难。
在沃纳综合征以外的疾病中，提倡不通过直接修复突变基因的、利用了使用反义寡聚物的外显子跳跃的治疗药物。然而，在沃纳综合征中没有这样的报告。
本发明的目的在于提供一种可以在不通过直接修复突变基因的情况下治疗沃纳综合征的手段。
解决问题的技术手段
本发明人发现通过由特定的碱基序列构成的反义寡聚物，可以使人类WRN基因的第27个外显子跳跃，可以在不通过直接修复突变基因的情况下治疗沃纳综合征。
本发明包含以下的方式。
1、一种反义寡聚物或其药学上允许的盐，其由与下述碱基序列(i)或碱基序列(ii)互补的碱基序列构成，并且可以使人类WRN基因的第27个外显子跳跃，
(i)SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列，
(ii)在SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列中，缺失、置换或插入了1个或多个碱基的碱基序列。
2、根据所述1所述的反义寡聚物或其药学上允许的盐，其中，
在所述碱基序列(i)或碱基序列(ii)中，所述连续的碱基序列的碱基长度为20个碱基以上且40个碱基以下。
3、根据所述1或2所述的反义寡聚物或其药学上允许的盐，其中，
在所述碱基序列(i)或碱基序列(ii)中，所述连续的碱基序列包含SEQ ID NO.2表示的碱基序列和SEQ ID NO.3表示的碱基序列中的至少一者。
4、根据所述3所述的反义寡聚物或其药学上允许的盐，其中，
在所述碱基序列(i)或碱基序列(ii)中，连续的碱基序列包含SEQ ID NO.4表示的碱基序列和SEQ ID NO.5表示的碱基序列中的至少一者。
5、根据所述1～4中任一项所述的反义寡聚物或其药学上允许的盐，其中，
在所述碱基序列(i)或碱基序列(ii)中，所述连续的碱基序列由SEQ ID NO.6～15中的任一者表示的碱基序列构成。
6、根据所述1～5中任一项所述的反义寡聚物或其药学上允许的盐，其中，
所述反义寡聚物为寡核苷酸、吗啉代寡聚物、肽核酸(PNA)寡聚物或二醇核酸(GNA)寡聚物。
7、根据所述1～5中任一项所述的反义寡聚物或其药学上允许的盐，其中，
所述反义寡聚物为吗啉代寡聚物。
8、根据所述7所述的反义寡聚物或其药学上允许的盐，其中，
所述吗啉代寡聚物为磷酰二胺吗啉代寡聚物。
9、根据所述6所述的反义寡聚物或其药学上允许的盐，其中，
所述寡核苷酸为包含选自桥联核酸(BNA)核苷酸中的1种以上的寡核苷酸。
10、根据所述1～9中任一项所述的反义寡聚物或其药学上允许的盐，其中，
5’末端和3’末端的至少一者经过了修饰。
11、一种使RNA表达的病毒载体，其由与下述碱基序列(i)或碱基序列(ii)互补的碱基序列构成，并且可以使人类WRN基因的第27个外显子跳跃，
(i)SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列，
(ii)在SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列中，缺失、置换或插入了1个或多个碱基的碱基序列。
12、根据所述11所述的病毒载体，其中，
在所述碱基序列(i)或碱基序列(ii)中，连续的碱基序列包含SEQ ID NO.16表示的碱基序列。
13、一种用于治疗沃纳综合征的药物组合物，其中，
以所述1～10中任一项所述的反义寡聚物或其药学上允许的盐、或者所述11或12所述的病毒载体为有效成分。
14、根据所述13所述的用于治疗沃纳综合征的药物组合物，其中，
以2种以上的反义寡聚物或其药学上允许的盐为有效成分。
15、一种为了诱导人类WRN基因的第27个外显子跳跃的药物组合物，其中，
以所述1～10中任一项所述的反义寡聚物或其药学上允许的盐、或者所述11或12所述的病毒载体为有效成分。
发明的效果
通过本发明，提供可以使人类WRN基因的第27个外显子跳跃，可以在不通过直接修复突变基因的情况下治疗沃纳综合征的反义寡聚物或其药学上允许的盐。
附图说明
[图1]图1表示RT-PCR解析的结果。
[图2]图2表示外显子跳跃效率的定量结果。
[图3]图3表示蛋白质印迹法解析的结果。
[图4]图4表示细胞增殖曲线解析的结果。
[图5]图5表示PDL解析的结果。
[图6]图6表示细胞形态观察的结果。
[图7]图7表示SA-β-Gal染色解析的结果。
[图8]图8表示SA-β-Gal染色的定量解析结果。
[图9]图9表示端粒长度解析的结果。
[图10]图10表示基因表达量解析的结果。
[图11]图11表示RT-PCR解析的结果。
[图12]图12表示外显子跳跃效率的定量结果。
具体实施方式
[反义寡聚物]
本发明的反义寡聚物或其药学上允许的盐是由与下述碱基序列(i)或碱基序列(ii)互补的碱基序列构成，并且可以使人类WRN基因的第27个外显子跳跃的反义寡聚物或其药学上允许的盐。
(i)SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列
(ii)SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列中,缺失、置换或插入了1个或多个碱基的碱基序列。
本发明的反义寡聚物或其药学上允许的盐可以使人类WRN基因的第27个外显子(在下文中也称为“外显子27”)跳跃。
在下文中有将“反义寡聚物或其药学上允许的盐”只写作“反义寡聚物”的情况。
<人类WRN基因>
人类WRN基因为编码DNA解旋酶的基因，认为该基因的突变引起的基因功能的异常为沃纳综合征的原因。
人类WRN基因区域的基因组碱基序列、cDNA的碱基序列和编码的蛋白质的氨基酸序列是众所周知的。就通过人类基因组计划得到的成为基准的人类WRN基因的碱基序列而言，在美国国家生物技术信息中心(NCBI；National Center for BiotechnologyInformation)提供的GenBank中，以下述的登录号进行了登录(登录了多个版本(revision)的情况下，理解为指示最新的版本)。
人类WRN基因：NM_000553
<第27个外显子跳跃>
人类WRN基因的主要的成熟转录产物(成熟mRNA)由35个外显子构成。
在日本国内报告的沃纳综合征患者的70.7％，具有人类WRN基因中的c.3139-1G>C突变，即从cDNA碱基序列中的翻译起始密码子开始数，第3139位的碱基往前1个碱基的内含子中的从鸟嘌呤(G)碱基向胞嘧啶(C)的突变。该突变为WRN基因的第26个外显子(下述也称为“外显子26”)的剪接受体序列的突变，诱发外显子26的跳跃，通过外显子27中的移码产生翻译终止密码子。因此，造成包含了存在于C末端的核内转运信号的主要的WRN蛋白质的功能结构域缺失，较大地损害WRN基因的功能，认为是沃纳综合征的原因。
本发明的反义寡聚物也能够以人类WRN基因的成熟mRNA作为靶标，实现外显子27的跳跃，其结果，因c.3139-1G>C突变引起外显子26跳跃的情况下，产生连接了第25个外显子和第28个外显子的成熟mRNA。
在本发明中，就通过外显子26和外显子27的跳跃进行了去除的成熟mRNA而言，通过去除外显子27来进一步产生移码，编码可以进行到野生型的翻译终止密码子为止的蛋白质翻译的突变型WRN蛋白质。所述突变型WRN蛋白质编码由包含了存在于C末端的核内转运信号的1375个氨基酸残基构成的蛋白质，相对于由1432个氨基酸残基构成的野生型WRN蛋白质而言缺失了3.9％(57个氨基酸残基)。然而，令人惊讶的是，突变型WRN蛋白质如所述的实施例表示的那样，显示因c.3139-1G>C突变产生的基因功能异常的至少一部分的功能恢复。
就产生人类WRN基因的外显子27跳跃而言，例如如后述的实施例表示的那样，在人类WRN基因的mRNA中，使用在发生了跳跃的外显子27区域的上游和下游设定的引物对，将包含外显子27的前后的区域进行RT-PCR扩增，可以对该扩增产物通过进行PCR扩增或序列解析来确认。
<碱基序列>
本发明的反义寡聚物由与下述碱基序列(i)或碱基序列(ii)互补的碱基序列构成。
(i)SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列
(ii)SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列中,缺失、置换或插入了1个或多个碱基的碱基序列。
(碱基长度)
本发明的反义寡聚物的碱基序列为15个碱基以上，从外显子跳跃的效率的观点出发，优选为20个碱基以上，更优选为23个碱基以上，进一步优选为25个碱基以上，并且，为与SEQ ID NO.1表示的碱基序列相同的116个碱基或者低于116个碱基，优选为80个碱基以下，更优选为60个碱基以下，进一步优选为40个碱基以下。特别是从外显子跳跃的效率和经济性的平衡的观点出发，优选为20个碱基以上且40个碱基以下，更优选为23个碱基以上且38个碱基以下，进一步优选为25个碱基以上且35个碱基以下。
(碱基)
构成反义寡聚物的碱基序列的碱基(也称为核酸碱基)包含腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)和次黄嘌呤(I)的天然型的碱基和它们的非天然型的修饰型碱基。反义寡聚物中包含的修饰型碱基的比例和数量没有特别的限制。
作为修饰型碱基，可举出：1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、2-甲基硫-N6-异戊烯基腺嘌呤等修饰型腺嘌呤，2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤等修饰型鸟嘌呤，5-甲基胞嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、2-硫胞嘧啶等修饰型胞嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、3-甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、6-甲基尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5’-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶等修饰型尿嘧啶，1-甲基次黄嘌呤等修饰型次黄嘌呤，其它的6-氮杂嘧啶、嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、吲哚、咪唑、黄嘌呤等。
(互补的碱基序列)
所谓“互补的碱基序列”，意思是与成为对象的碱基序列形成选自腺嘌呤-胸腺嘧啶、腺嘌呤-尿嘧啶和鸟嘌呤-胞嘧啶中的沃森-克里克(Watson-Crick)型碱基对以及与它相当的碱基对的碱基序列。沃森-克里克型碱基对中，成对的碱基之间形成氢键。此处所谓“与它相当的碱基对”意思是通过使用以例如所述的修饰型碱基代替腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤或胞嘧啶而形成的、与腺嘌呤-胸腺嘧啶、腺嘌呤-尿嘧啶或鸟嘌呤-胞嘧啶相当的碱基对、即鸟嘌呤-尿嘧啶、肌苷-腺嘌呤、肌苷-胞嘧啶等摆动配对(Wobble basepair)。
(SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列)
在所述碱基序列(i)中，反义寡聚物的靶标序列为SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列。SEQ ID NO.1表示的碱基序列由人类WRN基因的内含子26的3’端的20个碱基序列、外显子27的全碱基序列和内含子27的5’端的20个碱基序列构成。
SEQ ID NO.1:ttaattttattattttttagTTCGAAAACTGTATCTTCGGGCACCAAAGAGCATTGTTATAATCAAGTACCAGTTGAATTAAGTACAGAGAAGAAGgtttgttttaaagaaattgt
反义寡聚物的靶标序列优选包含内含子26和外显子27的边界区域的碱基序列以及外显子27和内含子27的边界区域的碱基序列中的至少一者。
更具体而言，优选包含SEQ ID NO.2表示的碱基序列和SEQ ID NO.3表示的碱基序列中的至少一者。SEQ ID NO.2由内含子26的3’端1个碱基以及外显子27的5’端8个碱基构成，并且为内含子26和外显子27的边界区域的碱基序列。此外，SEQ ID NO.3由外显子27的3’端8个碱基以及内含子27的5’端1个碱基构成，并且为外显子27和内含子27的边界区域的碱基序列。
SEQ ID NO.2:gTTCGAAAA
SEQ ID NO.3:AGAAGAAGg
反义寡聚物的靶标序列更优选包含SEQ ID NO.4表示的碱基序列和SEQ ID NO.5表示的碱基序列中的至少一者。SEQ ID NO.4由内含子26的3’端4个碱基和外显子27的5’端17个碱基构成，并且为内含子26和外显子27的边界区域的碱基序列。此外，SEQ ID NO.5由外显子27的3’端17个碱基和内含子27的5’端4个碱基构成，并且为外显子27和内含子27的边界区域的碱基序列。
SEQ ID NO.4:ttagTTCGAAAACTGTATCTT
SEQ ID NO.5:TAAGTACAGAGAAGAAGgttt
作为SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列的另一优选的方式，可举出下述(a)～(c)的碱基序列。
(a)在SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列，其以SEQID NO.1表示的碱基序列中的第1位、第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位、第9位、第10位、第11位、第12位、第13位、第14位、第15位、第16位、第17位、第18位、第19位或第20位中的任一个碱基作为5’端的起点，并且以第21位、第22位、第23位、第24位、第25位、第26位、第27位、第28位、第29位、第30位、第31位、第32位、第33位、第34位、第35位、第36位、第37位、第38位、第39位、第40位、第41位、第42位、第43位、第44位、第45位、第46位、第47位、第48位、第49位、第50位、第51位、第52位、第53位、第54位、第55位、第56位、第57位、第58位、第59位或第60位中的任一个碱基作为3’端的终点；
(b)在SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列，其以SEQID NO.1表示的碱基序列中的第57位、第58位、第59位、第60位、第61位、第62位、第63位、第64位、第65位、第66位、第67位、第68位、第69位、第70位、第71位、第72位、第73位、第74位、第75位、第76位、第77位、第78位、第79位、第80位、第81位、第82位、第83位、第84位、第85位、第86位、第87位、第88位、第89位、第90位、第91位、第92位、第93位、第94位、第95位或第96位中的任一个碱基作为5’端的起点，并且以第97位、第98位、第99位、第100位、第101位、第102位、第103位、第104位、第105位、第106位、第107位、第108位、第109位、第110位、第111位、第112位、第113位、第114位、第115位或第116位中的任一个碱基作为3’端的终点；以及
(c)在SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列，其以SEQID NO.1表示的碱基序列中的第1位、第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位、第9位、第10位、第11位、第12位、第13位、第14位、第15位、第16位、第17位、第18位、第19位或第20位中的任一个碱基作为5’端的起点，并且以第97位、第98位、第99位、第100位、第101位、第102位、第103位、第104位、第105位、第106位、第107位、第108位、第109位、第110位、第111位、第112位、第113位、第114位、第115位或第116位中的任一个碱基作为3’端的终点。
所述碱基序列(a)包含内含子26和外显子27的边界区域。所述碱基序列(b)包含外显子27和内含子27的边界区域。所述碱基序列(c)包含内含子26和外显子27的边界区域、外显子27的全区域、以及外显子27和内含子27的边界区域。
作为反义寡聚物的靶标序列，从经济性的观点出发，优选为所述碱基序列(a)或所述碱基序列(b)。
作为反义寡聚物的靶标序列的具体例，可举出以下的碱基序列。需要说明的是，SEQ ID NO.6～10是以内含子26和外显子27的边界区域作为靶标的碱基序列，SEQ IDNO.11～15是以外显子27和内含子27的边界区域作为靶标的碱基序列。
SEQ ID NO.6:TTTTTTAGTTCGAAAACTGTATCTTCGGGC
SEQ ID NO.7:TTTTTAGTTCGAAAACTGTATCTTCGGGCA
SEQ ID NO.8:TTTTAGTTCGAAAACTGTATCTTCGGGCAC
SEQ ID NO.9:TTTAGTTCGAAAACTGTATCTTCGGGCACC
SEQ ID NO.10:TTAGTTCGAAAACTGTATCTTCGGGCACCA
SEQ ID NO.11:TGAATTAAGTACAGAGAAGAAGGTTTGTTT
SEQ ID NO.12:TTGAATTAAGTACAGAGAAGAAGGTTTGTT
SEQ ID NO.13:GTTGAATTAAGTACAGAGAAGAAGGTTTGT
SEQ ID NO.14:AGTTGAATTAAGTACAGAGAAGAAGGTTTG
SEQ ID NO.15:CAGTTGAATTAAGTACAGAGAAGAAGGTTT
SEQ ID NO.41:TGAATTAAGTACAGAGAAGAAGGTTTGT
(缺失、置换或插入)
在所述碱基序列(ii)中，在SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列中缺失、置换或插入了1个或多个碱基。
就缺失、置换或插入的碱基的数量而言，在不损害本发明的效果的范围内没有限定。例如为1个以上，并且优选为5个以下，更优选为3个以下，进一步优选为2个以下。即缺失、置换或插入的碱基的数量优选为1、2、3、4或5，更优选为1、2或3，更进一步优选为1。
在某些碱基序列中，就缺失、置换或插入了1个或多个碱基的碱基序列而言，在该碱基序列中存在任意数量(例如1个以上且5个以下)的碱基的缺失、置换或插入，并且在严格的条件下，包含该碱基序列的互补序列以及能够充分地特异性地并且高效率地杂交的序列。但是不限于此。所谓“严格的条件”为仅产生特异性的杂交而不产生非特异性的杂交的条件，根据作为对象的碱基的长度，可以任意地选择在该技术领域中通常使用的条件。在缺失、置换或插入之中，从外显子跳跃的效率的观点出发，优选为置换。
就作为治疗对象的沃纳综合征患者而言，对于成为基准的碱基序列而言具有碱基多态性的情况。所述(ii)中的缺失、置换或插入的优选实例中的一个是为了使沃纳综合征患者所具有的多态性与反义寡聚物的序列一致的缺失、置换或插入。作为治疗对象的沃纳综合征患者所具有的碱基多态性通过解析该患者的基因组序列可以得到。此外，外显子27中的碱基多态性可以参照公开了的数据库(例如URL:https://ensembl.org)来确定。
(反义寡聚物)
就本发明的反义寡聚物而言，若具有所述特定的碱基序列，并且可以使人类WRN基因的外显子27跳跃，则没有限定。例如为寡核苷酸、吗啉代寡聚物、肽核酸(PNA)寡聚物或二醇核酸(GNA)寡聚物中的任一种。
(寡核苷酸)
寡核苷酸是具有碱基部分、糖部分和磷酸部分作为基本骨架的核苷酸通过磷酸键连接而成的寡聚物。核苷酸可以为天然型核苷酸和非天然型核苷酸中的任一种。
作为天然型核苷酸，可举出糖部分为脱氧核糖的脱氧核糖核苷酸和糖部分为核糖的核糖核苷酸，并且各个寡聚物为天然型的DNA和RNA。在DNA和RNA中，核苷酸之间的磷酸键是磷酸二酯键。
在非天然型核苷酸中，碱基部分、糖部分和磷酸部分中的一个以上的部分具有非天然型的修饰。因此，本发明的反义寡聚物可以包含至少一个碱基修饰、和/或至少一个糖修饰、和/或至少一个磷酸部分(骨架)修饰。
非天然型的修饰碱基如上述的那样。
作为非天然型的糖部分，可举出桥联核酸(Bridged Nucleic Acid,BNA)(例如Linked Nucleic Acid(LNA)、酰胺桥联核酸(AmNA)、胍桥联核酸(GuNA)、螺环丙烯桥联核酸(scpBNA)等)、环己烯核酸(CeNA)、1,5-脱水己糖醇核酸(HNA)、2’-O,4’-C-乙烯桥联核酸(ENA)、constrained ethyl桥联核酸(cEtBNA)、苏糖核酸(TNA)、氟-β-阿拉伯核酸、三环DNA(tcDNA)、2’-F修饰核糖核酸(2’-F-RNA)、2’-O-甲基修饰核糖核酸(2’-O-Me-RNA)、2’-O-甲氧基乙基修饰核糖核酸(2’-O-MEO-RNA)、4’-硫修饰核糖核酸(4’-S-RNA或4’-S-DNA)等。
作为具有非天然型的磷酸键的寡核苷酸，可举出天然型的磷酸二酯键的一部分或全部置换为选自硫代磷酸酯键(S化)、二硫代磷酸酯键、烷基膦酸酯键、磷酰胺键、磷酰二胺键以及磷酸硼键的非天然型的磷酸键。
(吗啉代寡聚物)
吗啉代寡聚物优选为连接有下述式(I)表示的基团的寡聚物(磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO))。
[化学式1]
[式中，R2和R3相同或不同，表示氢原子、直链状或支链状的碳原子数1个以上且6个以下的烷基、碳原子数5个以上且12个以下的环烷基、或碳原子数6个以上且10个以下的芳基。]
作为烷基，优选为直链状或支链状的碳原子数1个以上且6个以下的烷基。具体而言，可举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、正己基、异己基。烷基任选具有1个以上且3个以下的取代基。
作为环烷基，优选为碳原子数5个以上且12个以下的环烷基。具体而言，可举出例如环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环癸基、环十二烷基等。
作为芳基，优选为碳原子数6个以上且10个以下的芳基。具体而言，可举出例如苯基、α-萘基、β-萘基。尤其优选为苯基。芳基任选具有1个以上且3个以下的取代基。
作为所述取代基，可举出卤素原子、烷氧基、氰基、硝基等。
作为卤素原子，可举出氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。
作为烷氧基，可举出直链状或支链状的碳原子数1个以上且6个以下的烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、正己氧基、异己氧基等。其中，优选为碳原子数1个以上且3个以下的烷氧基。
吗啉代寡聚物可以根据例如国际公开第1991/009033号或国际公开第2009/064471号进行制造。特别地，PMO可以根据国际公开第2009/064471号所述的方法进行制造或根据国际公开第2013/100190号所述的方法进行制造。
(5’末端和3’末端的修饰)
就本发明的寡聚物而言，可以是5’末端和3’末端中的至少一者经过了修饰。在一种方式中，可以是5’末端和3’末端这两者经过了修饰。
作为5’末端和/或3’末端的修饰基团，可举出α-生育酚基、聚乙二醇(PEG)基、N-乙酰基葡萄糖胺(O-GlcNAc)基、甲氧(O-Me)基、胆固醇基、氨基、肽基(例如后述的细胞穿透肽)和它们的衍生物等。就修饰基团而言，在寡聚物的5’末端或3’末端上，可以直接或通过连接部来成键。
作为连接部，若期望的修饰基团和寡核苷酸的5’末端或3’末端可以以共价键连接则没有特别的限定，可以使用-O-、-CO-、-NH-、-CONH-、-NHCO-等该技术领域中使用的连接基团。
作为本发明的寡核苷酸的5’末端的方式的一种，可举出例如下述的(1)或(2)的基团。
[化学式2]
[式中，波浪线表示对寡核苷酸的5’末端的键合。]
在另一方式中，在5’末端上的修饰为下述(6)的结构的基团。
[化学式3]
[式中，
波浪线表示对寡核苷酸的5’末端的键合；
W为S或O，优选为O；
X为NRA1RA2(RA1和RA2分别独立并且为氢原子或低级烷基，例如甲基。)或ORA3(RA3为氢原子或低级烷基，例如甲基。)；
Y为O或NRA4(RA4为氢原子或低级烷基，例如甲基。)；
Ra为任意的修饰基团(例如PEG基、胆固醇基、氨基、肽基或它们的衍生物)。]
具有所述(6)的结构的基团优选为具有下述(6-1)的结构的基团。
[化学式4]
(6-1)
Ra为例如下述的(3)、(4)、(5)或(7)中表示的基团。
[化学式5]
/>
*-L1-肽基 (7)
[式中，*表示对所述(6)或(6’)的结构的键合，L1表示单键或接头(Linker)。]
就L1表示的接头而言，若通过所述接头可以连接所述(6)或(6’)的结构的基团和肽则没有特别的限定，例如可举出下述(8-1)～(8-3)中的任一种表示的基团。
[化学式6]
[式中，*如上所述，**表示对肽的键合，n表示2～6的整数，m表示2～6的整数。]
作为所述肽基的肽部分，可举出细胞穿透肽(Cell-Penetrating Peptides；CPP)。作为CPP的具体例，可举出TAT、R8、DPV3、DPV6、Penetratin、R9-TAT等阳离子性CPP；pVEC、ARF(19-31)、MPG、MAP、Transportan等两亲性(Amphipatic)CPP；Bip4、C105Y、Melittin、gH625等疏水性(Hydrophobic)CPP。CPP可以基于文献由本领域技术人员进行适宜设计(XieJ,et al.，Front Pharmacol.2020 May 20；11:697等)。
作为3’末端的方式的一种，可举出例如下述(2’)、(4’)或下述(9)的基团。
[化学式7]
#-L2-肽基 (9)
[式中，#表示对寡核苷酸的3’末端的键合，L2表示单键或接头。]
就L2表示的接头而言，若通过所述接头可以连接寡核苷酸的3’末端的糖和肽则没有特别的限定，例如可举出下述(10-1)～(10-3)的基团。
[化学式8]
[式中，#如上所述，##表示对肽基的键合，n表示2～6的整数，m表示2～6的整数。]
可举出如上所述的基团。
所述肽基的肽部分可以使用与在所述5’末端上的修饰相同的修饰。
作为本发明的寡聚物的方式的一种，可以使用经过修饰的吗啉代寡聚物即Vivo-Morpholinos(Gene Tools,LLC公司制)。在Vivo-Morpholinos中，5’末端具有所述(1)的修饰基团，3’末端具有所述(4)的修饰基团(octa-guanidine dendrimer)。
(各种反义寡聚物的制造方法)
就所述的各种反义寡聚物而言，基于碱基序列信息，可以通过公知的方法或将其应用后的新型方法来制造。反义寡聚物也可以委托第三方机构来制造。
<药学上允许的盐>
在本发明中，反义寡聚物也可以是药学上允许的盐。
作为盐，可举出酸加成盐、碱加成盐。
作为酸加成盐，可以为无机酸盐、有机酸盐中的任一种。作为无机酸盐，可举出例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、磷酸盐。作为有机酸盐，可举出例如柠檬酸盐、草酸盐、乙酸盐、甲酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲基苯磺酸盐。
作为碱加成盐，可以为无机碱盐、有机碱盐中的任一种。作为无机碱盐，可举出例如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐。作为有机碱盐，可举出例如三乙基铵盐、三乙醇铵盐、吡啶鎓盐、二异丙基铵盐。
本发明的化合物可以为水合物等溶剂合物。就溶剂而言，若为药学上允许的溶剂则没有特别限定。
[病毒载体]
本发明的病毒载体由与下述碱基序列(i)或碱基序列(ii)互补的碱基序列构成，并且是使可以使人类WRN基因的外显子27跳跃的RNA表达的病毒载体：
(i)SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列，
(ii)在SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列中，缺失、置换或插入了1个或多个碱基后的碱基序列。
就碱基序列而言，与所述反义寡聚物同样。
但是，病毒载体表达的RNA的碱基长度为15个碱基以上，从外显子跳跃的效率的观点出发，优选为20个碱基以上，更优选为40个碱基以上，进一步优选为60个碱基以上，并且，为与SEQ ID NO.1表示的碱基序列相同的碱基数或其以下。
病毒载体的靶标序列优选包含内含子26和外显子27的边界区域的碱基序列、外显子27的全长以及外显子27和内含子27的边界区域的碱基序列。
更具体而言，病毒载体的靶标序列优选包含SEQ ID NO.16表示的碱基序列。SEQID NO.16是由内含子26的3’端1个碱基、外显子27的全长以及外显子27的5’端8个碱基构成的碱基序列。
SEQ ID NO.16：gTTCGAAAACTGTATCTTCGGGCACCAAAGAGCATTGTTATAATCAAGTACCAGTTGAATTAAGTACAGAGAAGAAGg
作为病毒载体的靶标序列，从外显子跳跃的效率的观点出发，优选为包含内含子26和外显子27的边界区域、外显子27的全区域以及外显子27和内含子27的边界区域的所述碱基序列(c)。
病毒载体可以表达1种或2种以上的RNA。在表达1种RNA的情况下，所述RNA优选包含内含子26和外显子27的边界区域的碱基序列、外显子27的全区域以及外显子27和内含子27的边界区域的碱基序列。在表达2种以上的RNA的情况下，优选表达1种以上的内含子26和外显子27的边界区域的碱基序列的RNA以及1种以上的外显子27和内含子27的边界区域的碱基序列的RNA。在表达2种以上的RNA的情况下，优选组合并使用分别含有使反义寡聚物分别表达的盒式的2种以上的病毒载体。
病毒载体的种类没有限定。可举出例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒。作为腺相关病毒的血清型(serotype)，可举出AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB、AAV-DJ、AAV-DJ/8等。
就搭载期望的序列的病毒载体的制造而言，可以适宜参照在相关技术领域中的公知的方法来进行。
[药物组合物]
本发明提供将以所述反义寡聚物或所述病毒载体为有效成分的药物组合物。
药物组合物在优选的方式的一种中，是用于治疗沃纳综合征的药物组合物。在药物组合物的另一优选的方式中，是为了诱导人类WRN基因的外显子27跳跃的药物组合物。
<有效成分>
药物组合物中，作为有效成分，包含所述反义寡聚物或所述病毒载体。
作为有效成分，可以包含所述反义寡聚物或所述病毒载体中的1种或2种以上。
<载体>
就药物组合物而言，根据需要，作为包含1种或2种以上的药学上允许的载体的药物组合物来提供。
作为载体，可举出脂质纳米粒子(LNP)。作为构成脂质纳米粒子的脂质，可举出阳离子性脂质、带正电或负电的磷脂质、固醇、饱和的或不饱和的脂肪酸等以及它们的组合。在载体为脂质纳米粒子的情况下，作为有效成分的反义寡聚物或病毒载体优选地内包在脂质纳米粒子中。
作为载体，进一步可举出水性缓冲液、酸和碱等pH调节剂、抗坏血酸、对氨基苯甲酸等稳定化剂、D-甘露醇等赋形剂、等渗化剂以及保存剂等。
<剂型>
作为剂型，没有特别的限定。可举出例如各种注射剂、口服剂、点滴剂、吸入剂、软膏剂、洗剂、喷涂剂等。
此外，药物组合物可以提供水溶液的形态、冷冻溶液的形态和冷冻干燥品中的任一种。
<有效成分的含量>
有效成分在药物组合物中的含量没有特别的限定。可以根据有效成分的种类、用途、剂型、载体的种类来适宜设定。有效成分在药物组合物中的含量例如为0.0001质量％以上，优选为0.001质量％以上，更优选为0.01质量％以上，并且为100质量％以下，优选为90质量％以下，更优选为50质量％以下。
<给药对象>
药物组合物以沃纳综合征的患者和携带者作为给药对象。具体而言，以沃纳综合征的患者和携带者作为给药对象，所述沃纳综合征的患者在人类WRN基因中以纯合子或杂合子具有c.3139-1G>C突变。
给药对象的人种、性别、年龄没有特别的限定。
需要说明的是，在世界上报告了的沃纳综合征的患者中大约60％的是日本人。此外，在日本国内报告了的沃纳综合征患者的70.7％中具有在人类WRN基因中的c.3139-1G>C突变。
沃纳综合征的患者呈现例如早老性毛发变化(白发、秃头等)、白内障(两侧)、皮肤的萎缩和固化(鸡眼、胼胝等)、形成难治性溃疡、软部组织的钙化(跟腱等)、糖代谢异常、脂质代谢异常、在早期出现的动脉硬化(缺血性心肌病、心肌梗塞等)等症状。给药对象可以为呈现这样的症状的患者，也可以为还未显现症状的患者或携带者。
<给药路径>
作为药物组合物的给药路径，可举出例如经皮给药、皮下给药、肌肉内给药、静脉内给药、动脉内给药等非口服给药、口服给药。就给药路径而言，根据症状，例如可以使适合于显现了老化迹象的位置的作为给药路径。
例如，在具有形成溃疡的症状的患者中，可以作为通过软膏剂、洗剂、喷雾剂等进行的经皮给药。
<给药量>
就给药量而言，本领域技术人员可以适宜设定。
在有效成分为反义寡聚物情况下，反义寡聚物的给药量优选为0.1mg/kg以上，更优选为1mg/kg以上，进一步优选为10mg/kg以上，并且，优选为1000mg/kg以下，更优选为500mg/kg以下，进一步优选为100mg/kg以下。在局部给药的情况下，优选为0.01μg以上，更优选为1μg以上，并且，优选为1000μg以下，更优选为100μg以下。此外，在全身给药的情况下，优选为0.1mg/kg以上，更优选为1mg/kg以上，并且，优选为500mg/kg以下，更优选为100mg/kg以下。
此外，在有效成分为反义寡聚物情况下，可以为1天1次到数次的给药，或者使给药间隔为1天或数天进行给药。
有效成分为病毒载体情况下，病毒载体的给药量优选为1×1012vg/kg以上，更优选为1×1013vg/kg以上，进一步优选为2×1013vg/kg以上，并且，优选为1×1016vg/kg以下，更优选为1×1015vg/kg以下，进一步优选为5×1014vg/kg以下。
此外，在有效成分为病毒载体情况下，可以为1次给药或多次给药。
[治疗方法]
本发明也提供沃纳综合征的治疗法，其包含向沃纳综合征的患者以及携带者给药有效量的所述反义寡聚物或所述病毒载体的步骤。
对于具体的有效成分、给药对象、给药量等，如上所述。
实施例
以下，通过实施例具体性地说明本发明。
就实施例中的细胞培养而言，在37℃、5％二氧化碳的湿润环境下进行。
制造例1：吗啉代反义寡聚物的制备(1)
合成了所述表1表示的序列的吗啉代反义寡聚物。就合成而言，向Gene Tools,LLC公司提供的委托合成服务进行了委托。
[表1]
表1:反义寡聚物序列(1)
制造例2：WS-iPS细胞株的制备和培养方法
从在人类WRN基因的内含子25中具有c.3139-1G>C纯合突变的沃纳患者中采集外周血单核细胞并以非专利文献2的记载为基准，建立iPS细胞株，得到了WS-iPS细胞株。在iPS细胞株的培养中，使用了用于iPS/ES细胞增殖的培养基“StemFit AK02N”(AJINOMOTOHEALTHY SUPPLY株式会社制)、用于培养的底物“iMatrix-511”(株式会社NIPPI制)以及ROCK抑制剂Y-27632(富士和光纯药株式会社制)。
制造例3：WS-WRN基因修正后的(gene corrected)iPS细胞株的制备
在通过制造例2得到的WS-iPS细胞株中，以非专利文献2的记载为基准，使用CRISPR/Cas9 Homology Directed Repair(HDR)基因组编辑技术，建立使人类WRN基因的内含子25的c.3139-1G>C突变修正为野生型后的细胞株，得到了WS-WRN基因修正后的iPS细胞株。
制造例4：WS-iMSC细胞株的制备
在通过制造例2得到的WS-iPS细胞株中，形成了胚叶体后，在用IV型胶原蛋白涂敷了的60mm培养皿(Corning公司制)上使用间充质干细胞分化培养基进行了5天培养。然后在用胶原蛋白I(新田明胶株式会社制)涂敷了的100mm培养皿上使用培养培养基进行连续培养，得到了iPS细胞来源的间充质干细胞WS-iMSC细胞株。
所使用的间充质干细胞分化培养基以及培养培养基的组成如下所述。
[间充质干细胞分化培养基]
α-MEM(Thermo Fisher公司制)
10％ FBS(胎牛血清，Thermo Fisher公司制)
100nM地塞米松(Merck公司制)
50μM L-抗坏血酸2-磷酸盐倍半镁盐水合物(L-ascorbic acid 2-phosphat esesquimagnesium salt hydrate)(Merck公司制)
[培养培养基]
α-MEM
10％FBS(胎牛血清，Thermo Fisher公司制)
0.1mM非必需氨基酸(Non-Essential Amino Acid)(Thermo Fisher公司制)
制造例5：表达反义寡核苷酸(Antisense Oligo)的慢病毒载体质粒的制备
合成下述表2表示的序列的寡聚DNA，将得到的寡聚DNA的当量混合液在99℃下加热了15分钟后，花2小时冷却至室温，将寡聚DNA进行退火，得到了双链DNA。将得到的双链DNA使用T4 Polynucleotide Kinase(NEB公司制)进行末端的磷酸化，与用限制性内切酶AgeI和EcoRI进行了消化的慢病毒载体pLKO.1puro进行连接。慢病毒载体pLKO.1puro从非营利性的质粒储存库即Addgene获得。向大肠杆菌株DH5α进行转化后，从得到的大肠杆菌株中使用NucleoBond Midi(TAKARABIO株式会社制)纯化质粒，得到了表达反义寡核苷酸的慢病毒载体质粒(pLenti-anti-WRN-Ex27)。
[表2]
表2:用于慢病毒的寡聚DNA序列
制造例6：表达反义寡核苷酸的慢病毒载体的制备
将HEK293细胞使用10％FBS、DMEM培养基进行培养，使用Lipofectamine 2000试剂(Thermo Fisher Scientific公司制)并将pCMV-VSV-G、psPAX2和通过制造例5得到的pLenti-anti-WRN-Ex27中的三种质粒进行了基因导入。24小时后，进行培养基交换，在基因导入后48小时回收了培养上清。将得到的病毒溶液转移到Amicon Ultra centrifugalFilters(Millipore sigma公司制)中，通过以5000rpm 30分钟进行离心来得到浓缩病毒溶液。使用得到的浓缩病毒溶液并使表达反义寡核苷酸的慢病毒载体感染HEK293，进行浓缩病毒溶液的感染能力的确认以及滴度的计算，确认了制造后的病毒载体具备充分的感染能力。
制造例7：吗啉代反义寡聚物的制备(2)
合成了下述表3表示的序列的吗啉代反义寡聚物。就合成而言，向Gene Tools,LLC公司提供的委托合成服务进行了委托。
ASO15和ASO16为Vivo-Morpholinos。
[表3]
表3:反义寡聚物序列(2)
实施例1：iPS细胞中的外显子跳跃(1)(吗啉代反义寡聚物)
将通过制造例2得到的WS-iPS细胞和通过制造例3得到的WS-基因修正后的iPS细胞在24孔板中进行接种，24小时后，对于这些细胞使用Endo-Porter试剂(GeneTools,LLC公司制)，将通过制造例1得到的ASO1、ASO2、ASO3和ASO4分别以10μM的浓度进行了添加。
然后，进行了24小时培养。
试验例1-1：RT-PCR解析
回收细胞，使用“PureLink RNA Mini试剂盒”(Thermo Fisher公司制)纯化了总RNA(Total RNA)。以总RNA作为模版，使用SuperScriptIII试剂(Thermo Fisher公司制)并进行逆转录反应，合成了cDNA。进一步地，以得到的cDNA作为模版，使用下述表4表示的引物对，进行了Polymerase chain reaction(PCR)。引物1为针对外显子25的引物，引物2为针对外显子28的引物。
[表4]
表4:用于RT-PCR的引物序列
将得到的PCR扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行了解析，结果如图1所示。
如图1所示，在对照组(Control)即添加了ASO4的WS-iPS细胞中，观察到外显子26缺失了的258bp的突变体的条带。
另一方面，在添加了ASO1、ASO2或ASO3的WS-iPS细胞中，观察到通过外显子跳跃使人类WRN基因的外显子26和外显子27缺失而缩短后的182bp的条带。
以上的结果表示了通过分别添加ASO1和ASO2，可以诱发人类WRN基因的外显子27的外显子跳跃。
需要说明的是，在WS-WRN基因修正后的iPS细胞中，在添加了ASO1或ASO2的情况下和对照组即添加了ASO4的情况下，没有观察到条带的变化。
将得到的PCR扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳结果用Image J图像解析软件(美国国立卫生研究所(NIH)制)进行解析，进行了外显子跳跃的效率的定量。结果如图2所示。
基于条带亮度进行了定量的ASO1、ASO2和ASO3的外显子跳跃的效率分别为27.9±0.7％、43.0±2.1％和49.7±0.8％。以上的结果表示了通过分别添加ASO1、ASO2或ASO3，在人类WS患者的WRN基因的剪接中，诱发了外显子27的外显子跳跃，作为其结果，在外显子27中产生的终止密码子变得不能行使功能，可以诱导到正常的WRN基因的终止密码子为止的mRNA的基因表达。此外，在使用反义寡聚物使外显子27跳跃了的情况下，就到WRN基因的终止密码子为止的变短了的mRNA的表达水平而言，确认了以与未发病的沃纳综合征的杂合突变的情况(与正常相比为一半的表达量)大致同等的水平进行表达。
试验例1-2：蛋白质印迹法解析
回收细胞，通过蛋白质印迹法确认人类WRN蛋白质的表达。结果如图3所示。在检测中分别使用了抗WRN抗体(Abcam公司制，ab66606)、抗GAPDH抗体(Cell SignalingTechnology公司制，#5174)、二次抗体(GE Healthcare公司制，#NA931、#NA934)。
如图3所示，在添加了ASO2的WS-iPS细胞中，观察到比野生型WRN蛋白质小的分子量的蛋白质的显著的表达。此外，在添加了ASO1的WS-iPS细胞中，观察到相同程度的分子量的蛋白质的少量的表达。
以上的结果表示了通过分别添加ASO1和ASO2，人类WRN基因的外显子27的外显子跳跃不同程度地分别被诱发，并诱导对应的突变型蛋白质的表达。
实施例2：iMSC细胞中的外显子跳跃(1)(吗啉代反义寡聚物)
将通过制造例4得到的WS-iMSC细胞在24孔板中进行了接种。在从此刻后的每72小时，对于这些细胞使用Endo-Porter试剂(GeneTools,LLC公司制)，将通过制造例1得到的ASO3和ASO4分别以10μM的浓度进行了添加。
试验例2-1：PDL细胞增殖曲线解析
对于分别添加了ASO3和ASO4的WS-iMSC细胞，进行了PDL细胞增殖曲线解析。结果如图4和图5所示。
如图4所示，在对照组即添加了ASO4的WS-iMSC细胞中，在培养1个月后的时间点观察到细胞增殖停止。另一方面，在添加了ASO3的WS-iMSC细胞中，观察到细胞增殖为非偶然地持续进行。
如图5所示，就在传代30天后中的1周内的细胞增殖能力即群体倍增水平(PDL,Population Doubling Level)的变化值而言在添加ASO4的样品中为0.67±0.20(n＝4)。与之相对地，在添加ASO3的样品中PDL的变化值为2.8±0.26(n＝4，p值<0.006)，观察到显著的细胞增殖能力的恢复
试验例2-2：细胞形态的观察
对于分别添加了ASO3和ASO4的WS-iMSC细胞，进行了在光学显微镜下的细胞形态观察。结果如图6所示。
如图6所示，在添加了ASO4的WS-iMSC细胞中，观察到显示细胞老化的典型性的表型即细胞的扁平肥大化、核的结构的变化等的细胞的增加。另一方面，在添加了ASO3的WS-iMSC细胞中，没有观察到显示细胞老化的表型的细胞的增加。
试验例2-3：SA-β-Gal染色
对于分别添加了ASO3和ASO4的WS-iMSC细胞，进行SA-β-Gal染色。结果如图7和图8所示。需要说明的是，就SA-β-Gal而言，被承认在老化细胞中过量表达，为细胞老化的指标。
在图7表示的SA-β-Gal染色照片中，在添加了ASO4的WS-iMSC细胞中，观察到显著的SA-β-Gal阳性细胞的增加，显示早期细胞老化。另一方面，在添加了ASO3的WS-iMSC细胞中，没有观察到SA-β-Gal阳性细胞的增加。
在图8表示的SA-β-Gal染色阳性细胞的定量解析的结果中，在添加了ASO4的WS-iMSC细胞中，确认了显著的SA-β-Gal阳性细胞，表示早期细胞老化。另一方面，在添加了ASO3的WS-iMSC细胞中，观察到SA-β-Gal阳性细胞数为非偶然地得到抑制。
沃纳综合征患者在全身都显示早期老化的症候。就沃纳综合征患者来源的体细胞而言，即使在体外(in vitro)培养条件下，也显示早期老化的表型。另一方面，在使细胞分化初始化后的细胞中，没有显示老化的表型。
以上的结果表示了沃纳综合征患者来源的体细胞显示的细胞老化进行的表型，通过添加ASO3而得到抑制。
试验例2-4：端粒长度解析
对于分别添加了ASO3和ASO4的WS-iMSC细胞，通过定量PCR法(qPCR)解析了端粒长度。
就沃纳综合征患者来源的体细胞而言，已知细胞老化的进行所伴随的端粒长度的缩短与健康正常者相比更亢进。认为这是因为WRN基因编码的蛋白质为端粒结合蛋白质。因此，端粒长度成为WRN基因的功能活性的指标。
具体而言，从群体倍增水平(PDL)20的细胞团块(pellet)中使用DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN公司制)提取了基因组DNA。
将作为模板的基因组DNA 20ng、0.1mM的每个的下述表5表示的teloF和teloR的引物对或36B4F和36B4R的引物对、以及2×SYBR Green PCR Master Mix(Thermo Fisher公司制)在96孔板中进行了添加。使用CFX Connect Real-Time System(Bio-Rad Laboratories公司制)，通过以下循环进行了PCR扩增反应：以95℃、10分钟进行启动后，以95℃、15秒和60℃、1分钟进行40个循环。
[表5]
表5:用于端粒长度解析的引物序列
将36B4F和36B4R的引物对的PCR扩增产物作为内部对照，通过ΔΔCt法通过相对值算出了端粒长度(图中为相对端粒长度)。结果如图9所示。
如图9所示，在添加了ASO3的WS-iMSC细胞中，与对照组的添加了ASO4的WS-iMSC细胞相比，端粒长度为非偶然地更长了。
以上的结果表示了在添加了ASO3的WS-iMSC细胞中诱导的突变型蛋白质保持着功能活性。
试验例2-4：基因表达解析
对于分别添加了ASO3和ASO4的WS-iMSC细胞，通过RNA测序法进行了基因表达解析。
对于PDL8的细胞团块，使用“PureLink RNA Mini试剂盒”(Thermo Fisher公司制)，纯化了总RNA。将总RNA作为模板，使用NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit(NewEngland BioLabs公司制，目录编号：E7370S)合成了cDNA文库。使用HiSeq1500(Illumina公司制)，用60bp单端测序进行了序列决定。
将针对RNA-seq读长的参照基因组UCSC/hg19的映射，使用TopHat进行了实施。就数据注释而言，通过iGenomes(Illumina公司制)取得。基因表达量的定量中使用了iDEP(参照Ge SX,et al,BMC Bioinformatics.2018；19:534)。False discovery rate<0.05，将表达量2倍作为截断(cut-off)进行DEG(Differentially Expressed Genes，差异表达基因)解析，在添加了ASO3的WS-iMSC细胞和添加了ASO4的WS-iMSC细胞之间将表达量上有显著性差异的某些基因进行了提取。
作为在表达量上有显著性差异的某些基因，将老化相关炎症性基因即IL1B、IL6、CXCL8等进行了提取。图10表示表达量的比较。
已知在沃纳综合征患者来源的体细胞中，老化相关炎症性基因的表达量为亢进。另一方面，如图10所示，在添加了ASO3的WS-iMSC细胞中，与对照组的添加了ASO4的WS-iMSC细胞相比，作为老化相关炎症性基因的IL1B、IL6和CXCL8的表达量为非偶然地更少了。
以上的结果表示了沃纳综合征患者来源的体细胞显示的细胞老化进行的表型通过ASO3的添加得到抑制。
实施例3：iPS细胞中的外显子跳跃(2)(表达反义寡聚物的慢病毒)
使用通过制造例6得到的浓缩病毒溶液而使表达反义寡核苷酸的慢病毒感染通过制造例2得到的WS-iPS细胞和通过制造例3得到的WS基因修正后的iPS细胞，通过以下表示的实验，可以确认与使用了吗啉代反义寡聚物的情况同样地，在使用了表达反义寡核苷酸的慢病毒的情况下，也可以确认能够达成外显子27的外显子跳跃。
与所述试验例1-1同样地进行RT-PCR解析，确认了通过使表达反义寡核苷酸的慢病毒感染，可以诱发人类WRN基因的外显子27的外显子跳跃。
此外，与所述试验例1-2同样地进行蛋白质印迹法解析，确认了通过使表达反义寡核苷酸的慢病毒感染，可以诱发人类WRN基因的外显子27的外显子跳跃，诱导对应的突变型蛋白质的表达。
实施例4：iMSC细胞中的外显子跳跃(2)(表达反义寡聚物的慢病毒)
使用通过制造例6得到的浓缩病毒溶液来使表达反义寡核苷酸的慢病毒感染通过制造例4得到的WS-iMSC细胞，通过进行以下的实验，与在使用了吗啉代反义寡聚物的情况同样地，在使用了表达反义寡核苷酸的慢病毒的情况下，也可以确认外显子27的外显子跳跃的效果。
与试验例2-1～试验例2-3同样地，进行PDL细胞增殖曲线解析、细胞形态的观察以及SA-β-Gal染色。
实施例5：iPS细胞中的外显子跳跃(3)(吗啉代反义寡聚物)
将通过制造例2得到的WS-iPS细胞在24孔板中进行接种，24小时后，对于这些细胞使用Endo-Porter试剂(GeneTools,LLC公司制)将通过制造例1得到的ASO4、以及通过制造例1得到的ASO5、ASO6、ASO7、ASO8、ASO9、ASO10、ASO11、ASO12、ASO13、ASO14、ASO15和ASO16分别以10μM的浓度进行了添加(图中为“Endo-Porter(+)”)。
此外，除了没有使用Endo-Porter试剂以外，都同样地，将ASO15和ASO16分别以10μM的浓度进行了添加(图中为“Endo-Porter(-)”)。
然后，进行了24小时的培养。
试验例5-1：RT-PCR解析
与所述试验例1-1同样地，进行了RT-PCR解析。结果如图11所示。
如图11所示，观察到在对照组即添加了ASO4以及添加了ASO15的WS-iPS细胞中，外显子26缺失后的258bp的突变体的条带。
另一方面，观察到在添加了ASO5、ASO6、ASO7、ASO8、ASO9、ASO10、ASO11、ASO3、ASO12、ASO13、ASO14或ASO16的WS-iPS细胞中，通过外显子跳跃使人类WRN基因的外显子26和外显子27缺失而短缩后的182bp的条带。
并且，在添加了肽结合吗啉代即ASO16的WS-iPS细胞中，即使在没有使用Endo-Porter试剂的情况下也观察到所述182bp的条带。
以上的结果表示了通过分别添加ASO5、ASO6、ASO7、ASO8、ASO9、ASO10、ASO11、ASO3、ASO12、ASO13、ASO14和ASO16，可以诱发人类WRN基因的外显子27的外显子跳跃。
进一步地，与所述试验例1-2同样地，进行了外显子跳跃的效率的定量。结果如图12和表6所示。
[表6]
表6:外显子跳跃效率
以上的结果表示了通过分别添加ASO5、ASO6、ASO7、ASO8、ASO9、ASO10、ASO11、ASO3、ASO12、ASO13、ASO14或ASO16，在人类WS患者的WRN基因的剪接中，诱发了外显子27的外显子跳跃，作为其结果，在外显子27中产生的终止密码子变得不能行使功能，可以诱导表达到正常的WRN基因的终止密码子为止的mRNA的基因表达。
此外，确认了在添加了肽结合吗啉代即ASO16而不使用导入试剂的情况下，显示几乎100％的外显子跳跃效率。
工业实用性
通过实施例的结果确认了，就本发明的反义寡聚物而言，可以使人类WRN基因的第27个外显子跳跃，并且诱导蛋白质的功能至少部分性地恢复的突变型蛋白质的表达。即本发明的反义寡聚物可以作为能够抑制在沃纳综合征中的早期老化症状的药物的有效成分来使用。
序列表
<110> 国立大学法人千叶大学
<120> 反义寡聚物
<130> 22FCU002-WO0
<150> JP 2021-081389
<151> 2021-05-13
<160> 41
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人类
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Claims (15)

1.一种反义寡聚物或其药学上允许的盐，其由与下述碱基序列(i)或碱基序列(ii)互补的碱基序列构成，并且可以使人类WRN基因的第27个外显子跳跃，
(i)SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列，
(ii)在SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列中，缺失、置换或插入了1个或多个碱基的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的反义寡聚物或其药学上允许的盐，其中，
在所述碱基序列(i)或碱基序列(ii)中，所述连续的碱基序列的碱基长度为20个碱基以上且40个碱基以下。
3.根据权利要求1所述的反义寡聚物或其药学上允许的盐，其中，
在所述碱基序列(i)或碱基序列(ii)中，所述连续的碱基序列包含SEQ ID NO.2表示的碱基序列和SEQ ID NO.3表示的碱基序列中的至少一者。
4.根据权利要求3所述的反义寡聚物或其药学上允许的盐，其中，
在所述碱基序列(i)或碱基序列(ii)中，连续的碱基序列包含SEQ ID NO.4表示的碱基序列和SEQ ID NO.5表示的碱基序列中的至少一者。
5.根据权利要求1所述的反义寡聚物或其药学上允许的盐，其中，
在所述碱基序列(i)或碱基序列(ii)中，所述连续的碱基序列由SEQ ID NO.6～15中的任一者表示的碱基序列构成。
6.根据权利要求1所述的反义寡聚物或其药学上允许的盐，其中，
所述反义寡聚物为寡核苷酸、吗啉代寡聚物、肽核酸(PNA)寡聚物或二醇核酸(GNA)寡聚物。
7.根据权利要求1所述的反义寡聚物或其药学上允许的盐，其中，
所述反义寡聚物为吗啉代寡聚物。
8.根据权利要求7所述的反义寡聚物或其药学上允许的盐，其中，
所述吗啉代寡聚物为磷酰二胺吗啉代寡聚物。
9.根据权利要求6所述的反义寡聚物或其药学上允许的盐，其中，
所述寡核苷酸为包含选自桥联核酸(BNA)核苷酸中的1种以上的寡核苷酸。
10.根据权利要求1所述的反义寡聚物或其药学上允许的盐，其中，
5’末端和3’末端的至少一者经过了修饰。
11.一种使RNA表达的病毒载体，其由与下述碱基序列(i)或碱基序列(ii)互补的碱基序列构成，并且可以使人类WRN基因的第27个外显子跳跃，
(i)SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列，
(ii)在SEQ ID NO.1表示的碱基序列中15个碱基以上的连续的碱基序列中，缺失、置换或插入了1个或多个碱基的碱基序列。
12.根据权利要求11所述的病毒载体，其中，
在所述碱基序列(i)或碱基序列(ii)中，连续的碱基序列包含SEQ ID NO.16表示的碱基序列。
13.一种用于治疗沃纳综合征的药物组合物，其以权利要求1～10中任一项所述的反义寡聚物或其药学上允许的盐、或者权利要求11或12所述的病毒载体为有效成分。
14.根据权利要求13所述的用于治疗沃纳综合征的药物组合物，其以2种以上的反义寡聚物或其药学上允许的盐为有效成分。
15.一种为了诱导人类WRN基因的第27个外显子跳跃的药物组合物，其以权利要求1～10中任一项所述的反义寡聚物或其药学上允许的盐、或者权利要求11或12所述的病毒载体为有效成分。
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