CN117304313A - 一种特异性结合鼠疫耶尔森菌v抗原的全人源单克隆抗体 - Google Patents

一种特异性结合鼠疫耶尔森菌v抗原的全人源单克隆抗体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异性结合鼠疫耶尔森菌V抗原的全人源单克隆抗体，所述全人源单克隆抗体的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示，其能够与鼠疫耶尔森菌V抗原发生特异性的结合，具有良好的特异性和结合活性，对鼠疫耶尔森菌的检测具有重要意义。

Description

一种特异性结合鼠疫耶尔森菌V抗原的全人源单克隆抗体
技术领域
本发明属于鼠疫诊断技术领域，涉及一种特异性结合鼠疫耶尔森菌V抗原的全人源单克隆抗体，具体涉及一种特异性结合鼠疫耶尔森菌V抗原的全人源单克隆抗体RV-D1及其相关产品和应用。
背景技术
鼠疫(plague)是指由鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)引起的自然疫源性疾病。通过鼠蚤媒介，经人的皮肤传入引起腺鼠疫，经呼吸道传入发生肺鼠疫。临床表现为发热、淋巴结肿大、肺炎、出血倾向。可发展为败血症，传染性强，死亡率高，是危害人类最严重的烈性传染病之一。鼠疫属国际检疫传染病和我国法定的甲类管理传染病。鼠疫的发生和流行直接关系到人群健康。因此，无论是预防还是治疗，都需要开发一种快速、灵敏和特异的方法来检测鼠疫耶尔森菌。经典的鼠疫耶尔森菌检测方法包括分离培养、PCR技术、全基因组和宏基因组测序等等，这些方法虽然在检测鼠疫耶尔森氏菌方面起着重要作用，但同时具有费时费力、时间周期长且效率低、需要专业人员及昂贵仪器、假阳性率高、不适于临场快速检测等问题。目前，本领域仍需要开发一种简单、快速和有效的鼠疫耶尔森菌检测方法。
鼠疫耶尔森菌V抗原，又称低钙反应蛋白V抗原(low-calcium response Vantigen，LcrV)，是由鼠疫耶尔森菌合成并分泌的一种多功能的重要毒力因子，同时也是鼠疫耶尔森菌主要的保护性抗原，研究发现V抗原可以保护多种实验动物抵抗鼠疫耶尔森菌攻击，V抗原产生的免疫保护被特异性抗体所介导，抗V抗原的多抗血清或其单克隆抗体可以被动保护实验动物抵抗鼠疫耶尔森菌攻击。V抗原构成了Ⅲ型分泌系统注射体的针尖，调控Ⅲ型分泌系统的分泌，直接产生抗炎症作用，因而在鼠疫菌的感染与免疫中发挥着重要作用。V抗原由326个氨基酸组成，分子量为37kDa，晶体结构包括12个α螺旋和6个β折叠，形成哑铃状结构。研究对鼠疫耶尔森菌V抗原具有较好亲和力和特异性的单克隆抗体将会进一步促进鼠疫耶尔森菌感染疾病相关的快速诊断试剂的开发。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于：为本领域提供一种能够特异性结合鼠疫耶尔森菌V抗原的全人源单克隆抗体，所述单克隆抗体为RV-D1，所述RV-D1的重链可变区中的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示，轻链可变区中的LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4-6所示，其能够特异性识别鼠疫耶尔森菌V抗原，并且具有非常高的特异性和亲和力，在鼠疫耶尔森菌相关检测产品的开发和应用这一技术领域具有重要的应用前景，基于此，发明人提出了本发明。本发明所要解决的以上技术问题采用以下技术方案来实现：
在一方面，本发明提供了一种特异性结合鼠疫耶尔森菌V抗原的抗体或其抗原结合片段。
进一步，所述抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的重链可变区中的HCDR1-3、氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区中的LCDR1-3。
进一步，所述HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示，所述LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4-6所示；
优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
进一步，与本发明提供的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3对应的氨基酸序列具有70％以上同源性的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3对应的抗体同样包含在本发明的保护范围内。
在本发明中，对所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的具体序列并无特别限制，只要是基于如SEQ ID NO:7所示的重链可变区、如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区结合任何CDR编号方案(现有的CDR编号方案或将来产生的新的CDR编号方案)进行定义得到的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3对应的抗体的氨基酸序列或核苷酸序列均在本发明的保护范围内。
在一些实施方案中，所述CDR编号方案包括但不限于：IMGT编号方案、Chothia编号方案、Kabat编号方案、Martin(增强型Chothia)编号方案、AbM编号方案、Aho编号方案、Contact编号方案中的任意一种定义或任意多种(两种或两种以上)组合，采用上述定义方式对如SEQ ID NO:7所示的重链可变区、如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区进行定义得到的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3对应的抗体均落入本发明的保护范围。
此外，本发明还提供了一种双特异性抗体或其抗原结合片段。
进一步，所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含本发明第一方面所述的特异性结合鼠疫耶尔森菌V抗原的抗体或其抗原结合片段，以及与所述抗体或其抗原结合片段功能性连接的具有另一种抗原结合特性的抗体或其抗原结合片段。
在本发明中，对所述功能性连接的方式并无特别限制，所述功能性连接的方式包括但不限于：通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其它方式连接。
在另一方面，本发明提供了一种核酸分子。
进一步，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区或本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区；
优选地，编码本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
优选地，编码本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在一些实施方案中，可以使用标准分子生物学技术来获得本发明所述的核酸分子。一旦获得编码VH区段的DNA片段，进一步通过标准重组DNA技术操作这些DNA片段，以例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、或抗原结合片段DNA片段。在这些操作中，将编码VH的DNA片段可操作的连接至编码另一蛋白质，诸如抗体恒定区或柔性接头的另一DNA片段。
在一些实施方案中，本发明所述的核酸分子优选为分离的核酸分子，其中，分离的是指已经从其产生环境(例如，天然的或重组的)的组分中识别、分离和/或回收的核酸分子。其产生环境的污染组分通常是干扰其研究、诊断或治疗用途的物质，可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。分离的核酸分子通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
在另一方面，本发明提供了一种表达载体。
进一步，所述表达载体包含本发明第二方面所述的核酸分子；
优选地，所述表达载体中的核酸分子与启动子可操作性地连接；
更优选地，所述启动子包括tac启动子、SV40启动子、CMV启动子、lac启动子、pLλ启动子、rac5启动子、SP6启动子、amp启动子、recA启动子、trp启动子、T7启动子、MMTV启动子；
更优选地，所述载体包括质粒载体、粘粒载体、病毒载体；
最优选地，所述病毒载体包括噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体。
在本发明中，所述表达载体是指用于表达例如编码所需多肽(例如抗体)的多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括，例如包含(i)对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；(ii)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及(iii)适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。本发明所述的表达载体可以任何合适的方式构建，并可以使用任何载体，包括但不限于：质粒、病毒、噬菌体和转座子。
在一些实施方案中，用于本发明的可能的载体包括但不限于：染色体、非染色体和合成DNA序列，例如病毒质粒、细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒以及从质粒和噬菌体DNA的组合中衍生的载体，来自如慢病毒、逆转录病毒、牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、SV40和伪狂犬病等病毒的DNA。
在另一方面，本发明提供了一种基因改造的宿主细胞。
进一步，所述基因改造的宿主细胞包含本发明第三方面所述的表达载体或其基因组中整合有本发明第二方面所述的核酸分子；
优选地，所述宿主细胞包括真核细胞、原核细胞；
更优选地，所述宿主细胞为真核细胞；
最优选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、植物细胞、真菌细胞、真核藻类细胞、昆虫细胞、原生动物细胞、鱼类细胞。
在本发明中，对宿主细胞的类型并无特别限制，适用于本发明的宿主细胞包括但不限于：大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。在本发明中的一些实施方案中，所述宿主细胞优选为真核细胞，更优选为哺乳动物细胞。
在另一方面，本发明提供了一种用于检测鼠疫耶尔森菌的检测试剂。
进一步，所述检测试剂包含本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。
在另一方面，本发明提供了一种用于检测鼠疫耶尔森菌的检测产品。
进一步，所述检测产品包含本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段或本发明第五方面所述的检测试剂；
优选地，所述检测产品包括试剂盒；
更优选地，所述试剂盒包括酶联免疫试剂盒、胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、荧光免疫试剂盒、放射免疫试剂盒。
在一些实施方案中，所述试剂盒中还包括固相载体，本发明提供的抗体或其抗原结合片段被固定于固相载体(例如多孔板、盖玻片、微珠)或游离存在。所述试剂盒中还包括：能与所述抗体或其抗原结合片段连接的可检测部分，可检测部分可分离地存在于试剂盒中；和/或与可检测部分相对应的底物；和/或酶联免疫反应试剂，所述反应试剂包括但不限于：包被(缓冲)液，洗涤(缓冲)液，封闭液，固定液，终止液，显色液；和/或说明检测鼠疫耶尔森菌V蛋白方法的使用说明书。
在另一方面，本发明提供了一种药物组合物。
进一步，所述药物组合物包含本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。
在另一方面，本发明提供了如下任一种方法：
(1)一种如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段的制备方法，所述制备方法包括：培养本发明第四方面所述的基因改造的宿主细胞，得到宿主细胞培养物，从培养物中分离得到本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段；
(2)一种体外非诊断性地检测鼠疫耶尔森菌V蛋白的方法，所述方法包括：采用本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第五方面所述的检测试剂对待测样本进行检测，从而获得待测样本中V蛋白的定性或定量检测结果；
(3)一种体外特异性抑制鼠疫耶尔森菌V蛋白活性的方法，所述方法包括：将本发明第二方面所述的核酸分子引入到生物体细胞中，通过表达本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段抑制V蛋白活性。
此外，本发明还提供了一种诊断和/或辅助诊断鼠疫耶尔森菌感染性疾病的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：采用本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第五方面所述的检测试剂和/或本发明第六方面所述的检测产品对受试者来源的待测样品进行检测，检测待测样品中鼠疫耶尔森菌LcrV蛋白的存在情况。
此外，本发明还提供了一种治疗鼠疫耶尔森菌感染性疾病的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：给有需要的受试者施用治疗有效量的本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段或本发明第七方面所述的药物组合物。
在另一方面，本发明提供了如下任一方面应用：
(1)本发明第四方面所述的基因改造的宿主细胞在制备本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段中的应用；
(2)本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的基因改造的宿主细胞、本发明第五方面所述的检测试剂和/或本发明第六方面所述的检测产品在非诊断性地检测鼠疫耶尔森菌V蛋白中的应用；
(3)本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的基因改造的宿主细胞、本发明第五方面所述的检测试剂和/或本发明第六方面所述的检测产品在制备用于诊断和/或辅助诊断鼠疫耶尔森菌感染性疾病的诊断产品中的应用；
(4)本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体和/或本发明第四方面所述的基因改造的宿主细胞在制备用于检测鼠疫耶尔森菌V蛋白的检测试剂中的应用；
(5)本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的基因改造的宿主细胞和/或本发明第五方面所述的检测试剂在制备用于检测鼠疫耶尔森菌V蛋白的检测产品中的应用；
(6)本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体和/或本发明第四方面所述的基因改造的宿主细胞在制备用于治疗鼠疫耶尔森菌感染性疾病的药物组合物中的应用。
附图说明
图1为噬菌体ELISA筛选文库中的目的抗体；
图2为3株人源单克隆抗体与rV重组蛋白结合特异性鉴定结果，其中，A图：3株人源单抗与rV蛋白间接ELISA结果图；B图：3株抗体与rV蛋白的Western Blot结果图，其中，M为相对分子质量标准，1，2，3分别为RV-B4，RV-D1和RV-E8抗体；
图3为3株人源单克隆抗体与rV抗原结合的动力学分析结果图。
具体实施方式
本发明的发明人通过广泛而深入地研究，经过大量筛选，首次发现一种针对鼠疫V抗原的全人源单克隆抗体RV-D1，经实验验证发现，所述单克隆抗体RV-D1能够特异性结合鼠疫V抗原，具有非常高的特异性，并且与鼠疫V抗原具有较高的结合活性，能够用于鼠疫耶尔森菌相关检测试剂或检测产品的开发中，应用前景广阔。在此基础上，完成了本发明。为了促进相关技术人员对本发明的理解，此处对本发明中涉及到的如下术语进行解释：
如本文中使用，术语“单克隆抗体”同“抗体”或“单抗”，是指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于：杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法。
单克隆抗体包括四个多肽链、通过二硫键(即，全抗体分子)互连的两个重链(HC)和两个轻链(LC)及其多聚体(例如，IgM)。每个重链包括重链可变区(“VH”或“HCVR”)和重链恒定区(包含结构域CH1、CH2和CH3)。每个轻链包含轻链可变区(“VL”或“LCVR”)和轻链恒定区(CL)。VH区和VL区可以被进一步细分成被称作互补决定区(CDR)的高变区，其间散布着更保守的被称作构架区/框架区(FR)的区。每个VH和VL包括从氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链CDR也可以被称作HCDR或CDRH，并且如上文所描述的进行编号(例如，HCDR1、HCDR2和HCDR3或CDRH1、CDRH2和CDRH3)。同样，轻链CDR可以被称作LCDR或CDRL，并编号LCDR1、LCDR2和LCDR3或CDRL1、CDRL2和CDRL3。
通常，抗体重链和轻链两者的可变结构域包括三个高变区(也称为互补决定区(CDR))，其位于相对保守的构架区/框架区(FR)内。通常，从N端到C端，轻链可变结构域和重链可变结构域两者包括FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在本发明的实施例中，将氨基酸分配给每个结构域是根据以下文献中的定义进行的：《免疫学目的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,Kabat等人；国立卫生研究院(National Institutes of Health),贝塞斯达,马里兰州；第5版；NIH出版第91-3242号(1991)；Kabat(1978)《先进蛋白质化学(Adv.Prot.Chem.)》,32:1-75；Kabat等人,(1977),《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》,252:6609-6616；Chothia等人,《分子生物学杂志(JMol.Biol.)》(1987),196:901-917或Chothia等人,(1989),《自然》,342:878-883。
如本文中使用，术语“同源性”，是指与需要比对的氨基酸序列或核苷酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明提供的氨基酸序列具有70％或更高，或75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。所述70％或70％以上同源性，可为70％、75％、80％、85％、90％或95％以上的同源性。
如本文中使用，术语“相似性”，是指在比对的序列的任何特定位置上，序列之间的氨基酸残基为相似类型。例如，亮氨酸可被置换成异亮氨酸或缬氨酸。可通常彼此置换的其它氨基酸包括但不限于：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳族侧链的氨基酸)，赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)，天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)，天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)，以及半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。通常，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
如本文中使用，术语“待测样品”，是指来源于有需要的受试者的任何具有包含表达目标抗原(例如鼠疫耶尔森菌重组V蛋白)可能性的样品，在本发明中，对所述待测样品没有特别限制，包括但不限于：组织、血液、血浆、血清、胰液、尿液、粪便、组织液或培养液等等。
如本文中使用，术语“受试者”，是指任何动物，优选为哺乳动物，包括但不限于：人、高等灵长类、家养和农场动物，以及动物园动物、竞技动物或宠物，诸如马、猪、牛、狗、猫和雪貂等。在本发明的具体实施方案中，所述受试者优选为人。
如本文中使用，术语“施用”，是指将一定剂量的化合物(例如本发明所述的抗体或编码本发明所述抗体的核酸)或组合物(例如本发明所述的药物组合物)给予有需要的受试者的方法，施用的方式包括但不限于：肌肉内、静脉内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、直肠内、表面、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、局部、通过吸入、通过注射、通过输注，通过连续输注、通过导管、通过灌洗、以霜剂、或以脂质组合物来施用。施用的具体方法的选择可以根据多种因素(例如所施用的化合物或组合物和所治疗的疾患、疾病、或病症的严重性)而变化。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，具体实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例针对鼠疫V抗原的全人源单克隆抗体的筛选及效果验证
1、材料与方法
1.1抗原、全血标本、菌株、实验动物
鼠疫耶尔森菌重组V抗原(recombinant low-calcium response V，rV)由兰州生物制品研究所有限责任公司保存并提供；5份全血标本来自于兰州生物制品研究所有限责任公司的鼠疫重组疫苗II期临床项目(临床试验批件号：2012L01329)；鼠疫菌强毒株141株由青海地方病预防控制所鼠疫专业实验室分离鉴定并保存；BALB/c小鼠购自江苏华创信诺生物公司。克隆菌株DH5α，建库菌株XL1-Blue均由本室保存。
1.2载体、细胞、试剂耗材
建库载体pComb3XSS，抗体IgG表达载体pGI由本室构建及保存；HEK293F购自ACTTT；人单核细胞系THP-1由本室保存；反转录试剂盒，PCR试剂购自TaKaRa公司；SfiI内切酶，T4链接酶购自NEB公司；TNFαCBA试剂盒购自BD公司；其他化学试剂均为分析纯。
1.3文库构建
经知情同意及伦理审查，从鼠疫疫苗II期临床项目中采集完成三次免疫后的志愿者全血标本共5份，每份采集10mL抗凝血。使用Ficoll密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC)，使用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit提取总RNA，然后采用Roche公司的第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis for RT-PCR进行反转录。根据文献报道方法扩增抗体的轻链及重链可变区基因，并且经过融合PCR链接成ScFv片段(参考文献：KüGLER J,TOMSZAK F,FRENZEL A,et al.Construction of Human Immune andNaive scFv Libraries[J].Methods Mol Biol,2018,1701:3-24.)。ScFv片段经SfiI酶切后与同样经SfiI酶切的pComb3XSS载体链接后电击宿主菌XL1-Blue感受态制备噬菌体抗体文库，噬菌体抗体文库经野生型辅助噬菌体VCSM13包装后进行后续筛选，具体方法按文献进行。
1.4文库筛选
按照结合、洗涤、洗脱、扩增的方式，对上述噬菌体展示抗体文库进行亲和淘选。将重组表达的鼠疫rV抗原包被于免疫管中进行固相化，包被浓度依次为500、300、200ng/mL。具体步骤如下：向免疫管中加入相应量的rV蛋白，4℃包被过夜；弃上清，0.05％ PBST洗板3次，加入3％ BSA 37℃封闭2h；弃封闭液，0.05％ PBST洗板3次，加入抗体文库，37℃先振荡孵育1h，再静置孵育1h；弃上清，0.1％ PBST洗涤10次，加入PH＝2.2的0.1M Gly-HCl洗脱，再用2M Tris中和至PH＝7.0，取10μL测定滴度，剩余噬菌体感染XL1-Blue宿主菌后进行扩增，次日用PEG6000沉淀噬菌体再进行下一轮筛选。
1.5阳性克隆鉴定
从第三轮筛选测滴度的平板上随机挑取96个单菌落于96孔深孔板中，37℃260rpm培养4h，然后1：10转接至新的深孔板中再震荡培养4h，加入1mM IPTG 37℃诱导过夜。次日用间接ELISA法检测上清中抗体的表达，具体如下：首先将鼠疫rV抗原以200ng/孔包被于96孔酶标板中，加入50μL 3％脱脂牛奶和50μL深孔板中表达上清，37℃震荡孵育1h，PBST洗板3次，加入HRP标记的抗M13噬菌体单克隆抗体，37℃孵育30min后，PBST洗板，加入TMB显色液显色10min，用2M硫酸溶液终止反应后读取OD450的吸光度值。阳性克隆提质粒后送测序，测序结果经IMGT数据库比对抗体可变区的基因序列，选取序列有差异的克隆进行全抗体表达。
1.6抗鼠疫rV人源IgG1型全抗体表达
将rV抗体的重链可变区基因经AgeI和SalI酶切位点克隆入全抗体表达载体pGI-H，轻链基因经AgeI和BsiwI酶切位点克隆入pGI-K载体。测序正确后，使用PEI转染试剂将双质粒共转染293F细胞，5天后收取细胞上清，用Protein A柱纯化目的抗体。
1.7rV人源抗体与rV抗原结合特异性鉴定
采用间接ELISA及Western Blot法鉴定人源抗体与rV抗原的结合特异性。首先，将rV蛋白以200ng/孔包被96孔酶标板，纯化抗体从1μg/mL开始倍比稀释，一抗37℃孵育1h，PBST洗涤后加入HRP标记的抗人IgG，然后37℃孵育30min，后TMB显色，终止后读取OD450吸光度值，每个样品重复3次取平均值。然后，对目的抗体进行Western Blot检测，将10μg的rV蛋白经SDS-PAGE后，将PAGE胶上蛋白转印到PVDF膜中，经3％脱脂牛奶封闭及重组rV人源单抗孵育，洗涤后加入HRP标记的抗人IgG。最后用DAB直接在PVDF膜上显色。
1.8抗体亲和力测定
本研究使用生物膜干涉技术(BLI)检测人源抗体与rV抗原结合的亲和力及动力学参数。使用Pro A传感器将抗体固化于传感器表面，再与稀释后的rV抗原反应，通过分析表面光干涉的改变得到分子间相互作用的信息。使用Octet Red96大分子作用仪实时监测整个结合及解离过程。具体步骤包括：Pro A传感器预湿、传感器平衡、固化抗体、固化后平衡、结解离以及传感器再生，利用ForteBio Data Acquistion软件实时采集和分析分子相互作用和结合动力学数据。具体操作方法参考仪器说明。
2、实验结果
2.1人源抗鼠疫耶尔森菌噬菌体文库的构建
收集了5份鼠疫疫苗接种后志愿者的外周全血，通过密度梯度离心分离出PBMC，分别提取mRNA和反转录，然后将cDNA等比例混合后用19对人ScFv引物分别扩增抗体的轻重链可变区序列，大小均为350bp左右。然后采用Overlapping PCR将轻重链随机连接成ScFv，大小约为700bp左右。酶切后连接噬菌体载体，连接产物电击2次XL1-Blue感受态细胞，测定文库的库容量达7.54×108CFU(colony-forming units)，经菌落PCR验证文库中正确插入率为100％。
2.2人源抗体的筛选及抗体序列分析
经3轮筛选后，挑取的96个单克隆菌落，经过IPTG诱导及噬菌体ELISA，确定OD450nm>1.0的阳性克隆29个，经测序后得到轻重链序列完整的克隆26株，如图1。经过IMGT数据库比对序列，获得3株特异性单克隆抗体，分别命名为RV-E8、RV-B4、RV-D1。3株抗体序列经IMGT数据库分析，发现RV-B4抗体的VH基因为VH1-46家族，轻链为Lambda 1-51；RV-D1和RV-E8重链均为VH3-30，轻链分别为Kappa链的VK3-20和VK1-39胚系基因，如表1所示。其中，抗体RV-D1的序列信息如表2所示。
表1 3株rV特异性抗胚系基因及变异度分析
表2抗体RV-D1的序列
2.3人源抗体与rV抗原结合特异性鉴定
为了进一步确定表达纯化的3株人源抗体与rV抗原结合的特异性，本发明分别进行了抗体与rV重组蛋白的间接ELISA和Western Blot实验。如图2A，3株人源抗体与rV重组蛋白ELISA结果显示所述3株抗体均能与rV抗原特异性结合，且对该重组抗体的检测灵敏度可达3ng/mL左右。Western Blot结果显示2株抗体均能与rV抗原反应，在37kD处出现明显条带，同时此结果显示所述3株抗体均识别抗原上的线性表位，如图2B。以上结果表明了3株抗体RV-E8、RV-B4、RV-D1对rV抗原均具有较高的特异性。
2.4抗体亲和力测定
利用膜干涉技术，对3个人源单克隆抗体分别与rV抗原结合、解离数据进行分析。结果如图3所示，结果显示3个鼠疫抗体与rV抗原均有很高的亲和力，其中RV-E8的Kd值最高，为1.24nM，RV-B4和RV-D1的KD值分别为2.1nM和42nM。以上结果表明了3株抗体RV-E8、RV-B4、RV-D1对rV抗原均具有很高的亲和力。

Claims (10)

1.一种特异性结合鼠疫耶尔森菌V抗原的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的重链可变区中的HCDR1-3、氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区中的LCDR1-3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示，所述LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4-6所示；
优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区或权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区；
优选地，编码权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
优选地，编码权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求3所述的核酸分子；
优选地，所述表达载体中的核酸分子与启动子可操作性地连接；
更优选地，所述启动子包括tac启动子、SV40启动子、CMV启动子、lac启动子、pLλ启动子、rac5启动子、SP6启动子、amp启动子、recA启动子、trp启动子、T7启动子、MMTV启动子；
更优选地，所述载体包括质粒载体、粘粒载体、病毒载体；
最优选地，所述病毒载体包括噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体。
5.一种基因改造的宿主细胞，其特征在于，所述基因改造的宿主细胞包含权利要求4所述的表达载体或其基因组中整合有权利要求3所述的核酸分子；
优选地，所述宿主细胞包括真核细胞、原核细胞；
更优选地，所述宿主细胞为真核细胞；
最优选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、植物细胞、真菌细胞、真核藻类细胞、昆虫细胞、原生动物细胞、鱼类细胞。
6.一种用于检测鼠疫耶尔森菌的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包含权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段。
7.一种用于检测鼠疫耶尔森菌的检测产品，其特征在于，所述检测产品包含权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求6所述的检测试剂；
优选地，所述检测产品包括试剂盒；
更优选地，所述试剂盒包括酶联免疫试剂盒、胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、荧光免疫试剂盒、放射免疫试剂盒。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段。
9.如下任一种方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)一种如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段的制备方法，所述制备方法包括：培养权利要求5所述的基因改造的宿主细胞，得到宿主细胞培养物，从培养物中分离得到权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段；
(2)一种体外非诊断性地检测鼠疫耶尔森菌V蛋白的方法，所述方法包括：采用权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求6所述的检测试剂对待测样本进行检测，从而获得待测样本中V蛋白的定性或定量检测结果；
(3)一种体外特异性抑制鼠疫耶尔森菌V蛋白活性的方法，所述方法包括：将权利要求3所述的核酸分子引入到生物体细胞中，通过表达权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段抑制V蛋白活性。
10.如下任一方面应用，其特征在于，所述应用包括：
(1)权利要求5所述的基因改造的宿主细胞在制备权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段中的应用；
(2)权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的表达载体、权利要求5所述的基因改造的宿主细胞、权利要求6所述的检测试剂和/或权利要求7所述的检测产品在非诊断性地检测鼠疫耶尔森菌V蛋白中的应用；
(3)权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的表达载体、权利要求5所述的基因改造的宿主细胞、权利要求6所述的检测试剂和/或权利要求7所述的检测产品在制备用于诊断和/或辅助诊断鼠疫耶尔森菌感染性疾病的诊断产品中的应用；
(4)权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的表达载体和/或权利要求5所述的基因改造的宿主细胞在制备用于检测鼠疫耶尔森菌V蛋白的检测试剂中的应用；
(5)权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的表达载体、权利要求5所述的基因改造的宿主细胞和/或权利要求6所述的检测试剂在制备用于检测鼠疫耶尔森菌V蛋白的检测产品中的应用；
(6)权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的表达载体和/或权利要求5所述的基因改造的宿主细胞在制备用于治疗鼠疫耶尔森菌感染性疾病的药物组合物中的应用。
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