CN114560932A

CN114560932A - 一株鼠疫中和抗体及其应用

Info

Publication number: CN114560932A
Application number: CN202210150974.2A
Authority: CN
Inventors: 杨志新; 陆健昇; 谢青; 王荣; 黄莺; 杜鹏; 余云舟; 陈蕾
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2022-02-18
Filing date: 2022-02-18
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2042-02-18
Also published as: CN114560932B

Abstract

本发明公开了一株鼠疫中和抗体及其应用。本发明提供的抗体的重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1的第26‑33位、第51‑58位、第97‑110位所示；所述抗体的轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.2的第27‑32位、第50‑52位、第89‑97位所示。本发明所提供的抗体能够特异性结合鼠疫菌保护性抗原F1蛋白，能够中和鼠疫菌，可完全保护小鼠免受10倍LD50鼠疫菌肺递送攻击。本发明所提供的抗体可用于鼠疫菌感染的防治，具有重要的生物学和医学意义。

Description

一株鼠疫中和抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一株鼠疫中和抗体及其应用。

背景技术

鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis，简称鼠疫菌/鼠疫杆菌)感染引起的传染病，历史上曾发生过三次鼠疫大流行，造成超过两亿人的死亡。目前鼠疫的发病率很低，但世界各地仍有疫情发生。《中华人民共和国传染病防治法》将鼠疫列为甲类传染病，执行最严格的防控措施。

目前对鼠疫的临床治疗主要采用抗生素，但抗生素的使用易产生耐药株，在马达加斯加已分离出鼠疫耶尔森菌的多重耐药菌株，因此研究新的治疗手段就显得尤为重要，而特异性的鼠疫抗体用于鼠疫治疗是未来的一个重要发展方向。

发明内容

本发明的目的是提供一株鼠疫中和抗体及其应用。

第一方面，本发明要求保护一种抗体。该抗体为抗鼠疫耶尔森氏菌的抗体。

本发明要求保护的抗体，其重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1的第26-33位、SEQ ID No.1的第51-58位、SEQ ID No.1的第97-110位所示；所述抗体的轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.2的第27-32位、SEQ ID No.2的第50-52位、SEQ ID No.2的第89-97位所示。

其中，HCDR1、HCDR2和HCDR3为重链可变区中的三个互补决定区，LCDR1、LCDR2和LHCDR3为轻链可变区中的三个互补决定区。互补决定区的序列根据Kabat定义。

进一步地，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.1，或者与SEQ ID No.1具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(FR))。所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.2，或者与SEQ ID No.2具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(FR))。

在本发明保护范围内，所述抗体可为全长抗体、单链Fv片段、Fab片段、F(ab’)2片段等各种形式。

在本发明的具体实施方式中，所述全长抗体的重链恒定区为IgG1亚型，轻链恒定区为kappa亚型。

具体地，所述抗体的重链的氨基酸序列为SEQ ID No.5，或者与SEQ ID No.5具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(FR))。所述抗体的轻链的氨基酸序列为SEQ ID No.6或者与SEQ ID No.6具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(FR))。

第二方面，本发明要求保护一种核酸分子。

本发明要求保护的核酸分子为编码前文第一方面中所述抗体或所述抗体中的抗原结合部分的核酸分子。

进一步地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID No.3自5’端起第76-99位、第151-174位、第289-330位所示。编码所述抗体的轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LCDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID No.4自5’端起第79-96位、第148-156位、第265-291位所示。

更进一步地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的所述重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.3或者与SEQ ID No.3具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(FR))。编码所述抗体的所述轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.4或者与SEQ ID No.4具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(FR))。

更加具体地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的重链的核苷酸序列为SEQ IDNo.7或者与SEQ ID No.7具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(FR))。编码所述抗体的轻链的核苷酸序列为SEQ IDNo.8或者与SEQ ID No.8具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(FR))。

第三方面，本发明要求保护含有前文第二方面所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。

在本发明的具体实施方式中，将SEQ ID No.7(抗体重链的编码基因)克隆到pcDNA3.1(+)载体的酶切位点Hind III和BamH I之间后得到表达所述抗体的重链的重组表达载体；将SEQ ID No.8(抗体轻链的编码基因)克隆到pcDNA3.1(+)载体的酶切位点HindIII和BamH I之间后得到表达所述抗体的轻链的重组表达载体。所述重组细胞为将上述分别表达所述抗体重链和轻链的两个重组表达载体共转染HEK293-F细胞后得到的重组细胞。

第四方面，本发明要求保护一种药物组合物。

本发明所要求保护的药物组合物包含前文第一方面中所述的抗体和药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

第五方面，本发明要求保护如下任一所示应用：

(A1)前文第二方面中所述的核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌在制备前文第一方面中所述抗体或前文第四方面中所述药物组合物中的应用；

(A2)前文第一方面中所述抗体在制备前文第四方面中所述药物组合物中的应用；

(A3)前文第一方面中所述抗体或前文第二方面中所述核酸分子或前文第三方面中所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或前文第四方面中药物组合物在制备用于预防和/或治疗由鼠疫耶尔森氏菌感染所致疾病的产品中的应用；

(A4)前文第一方面中所述抗体或前文第二方面中所述核酸分子或前文第三方面中所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或前文第四方面中药物组合物在制备用于抑制鼠疫耶尔森氏菌感染的产品中的应用；

(A5)前文第一方面中所述抗体或前文第二方面中所述核酸分子或前文第三方面中所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或前文第四方面中药物组合物在制备用于检测鼠疫耶尔森氏菌的产品中的应用；

(A6)前文第一方面中所述抗体或前文第二方面中所述核酸分子或前文第三方面中所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或前文第四方面中药物组合物在制备用于中和鼠疫耶尔森氏菌的产品中的应用；

(A7)前文第一方面中所述抗体或前文第二方面中所述核酸分子或前文第三方面中所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或前文第四方面中药物组合物在制备用于检测鼠疫耶尔森氏菌的F1蛋白的产品中的应用；

(A8)前文第一方面中所述抗体或前文第二方面中所述核酸分子或前文第三方面中所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或前文第四方面中药物组合物在制备用于结合鼠疫耶尔森氏菌的F1蛋白的产品中的应用。

在本发明的具体实施方式中，所述鼠疫耶尔森氏菌具体为鼠疫耶尔森氏菌201株。

本发明制备了一种抗鼠疫菌的中和抗体。实验证明，该抗体能够特异性结合鼠疫菌保护性抗原F1蛋白，能够中和鼠疫菌，可完全保护小鼠免受10倍LD50鼠疫菌肺递送攻击。本发明所提供的抗体可用于鼠疫菌感染的防治，具有重要的生物学和医学意义。

附图说明

图1为纯化后的mhS1抗体SDS-PAGE检测结果。

图2为表达目的蛋白的SDS-PAGE图

图3为纯化F1蛋白的SDS-PAGE图。

图4为mhS1抗体特异性检测。

图5为抗体mhS1与F1的结合能力检测。

图6为抗体mhS1小鼠体内中和活性检测。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、抗体的发现

一、小鼠免疫及免疫抗体库的制备

取雌性6-8周龄Balb/C小鼠，免疫之前小鼠尾静脉采血留本底血清。首次免疫取鼠疫菌F1重组蛋白(实施例3步骤一制备)用弗氏完全佐剂乳化，每只小鼠腹腔注射20μg重组蛋白。间隔2周加强免疫，取重组F1蛋白以弗氏不完全佐剂乳化，每只小鼠腹腔注射20μg重组蛋白，注射前断尾采血，共进行两次加强免疫。三免后2周处死小鼠，取脾，分离脾细胞。

利用细胞总RNA提取试剂盒(OMEGA，R6834-01)提取脾细胞的RNA。以提取的总RNA为模板，利用反转录试剂盒(Invitrogen，180180-051)反转录cDNA，引物采用试剂盒中的随机引物。然后以反转录得到的cDNA为模板，参考文献(Journal of ImmunologicalMethods，201(1997)，35-55)合成引物，通过PCR分别扩增鼠抗体重链可变区和轻链可变区基因，再利用重叠延伸PCR技术，构建为单链抗体(scFv)形式并克隆至pADSCFV-S载体(参见发明专利201510097117.0)，构建scFv库。经检测抗体库的库容达到1.9×10⁸。

二、抗鼠疫杆菌F1蛋白小鼠单链抗体库的筛选

以F1重组蛋白(实施例3步骤一制备)为抗原，利用固相筛选策略(实验方案参考“噬菌体展示：通用实验指南/(美)克拉克森(Clackson,T)，(美)洛曼(Lowman,H.B.)编；马岚等译。化学工业出版社，2008.5”)筛选上述构建的小鼠单链抗体噬菌体库，共进行三轮筛选，最终获得能特异性结合鼠疫杆菌F1蛋白的单链抗体克隆S1。其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.1(对应的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3)，轻链可变区为SEQ IDNo.2(对应的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.4)。

实施例2、抗鼠疫菌嵌合抗体的制备

将筛选到的鼠单链抗体克隆S1改造为人鼠嵌合的全抗体，命名为mhS1(重链恒定区为IgG1，轻链为Kappa)。过程如下：

一、重组质粒的构建

1、将SEQ ID No.7的序列利用常规的分子生物学技术克隆至pcDNA3.1(+)(Invitrogen，V79020)的HindIII和BamH I两个酶切位点之间，所得重组质粒经测序验证正确后命名为pcDNA3.1-mhS1H，为抗体mhS1的重链表达质粒。

2、将SEQ ID No.8的序列利用常规的分子生物学技术克隆至pcDNA3.1(+)(Invitrogen，V79020)的Hind III和BamH I两个酶切位点之间，所得重组质粒经测序验证正确后命名为pcDNA3.1-mhS1K，为抗体mhS1的轻链表达质粒。

人鼠嵌合全抗体mhS1，其重链氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

SEQ ID No.5中，自N端第1-121位氨基酸残基组成重链可变区VH(其中，第26-33位氨基酸残基组成HCDR1，第51-58位氨基酸残基组成HCDR2，第97-110位氨基酸残基组成HCDR3)，第122-451位氨基酸残基为重链恒定区和铰链区。

SEQ ID No.6中，自N端第1-107位氨基酸残基组成轻链可变区VL(其中，第27-32位氨基酸残基组成LCDR1，第50-52位氨基酸残基组成LCDR2，第89-97位氨基酸残基组成LCDR3)，第108-214位氨基酸残基组成轻链恒定区CL。

SEQ ID No.7所示的DNA分子编码SEQ ID No.5所示的多肽(重链)。SEQ ID No.7中，自5’端第1-363位核苷酸编码VH(其中，第76-99位核苷酸编码HCDR1，第151-174位核苷酸编码HCDR2，第289-330位核苷酸编码HCDR3)，第364-1353位核苷酸编码重链恒定区和铰链区，第1354-1356位核苷酸为终止密码子。

SEQ ID No.8所示的DNA分子编码SEQ ID No.6所示的多肽(轻链)。SEQ ID No.8中，自5’端第1-321位核苷酸编码VL(其中，第79-96位核苷酸编码LCDR1，第148-156位核苷酸编码LCDR2，第265-291位核苷酸编码LCDR3)，第322-642位核苷酸编码CL，第643-645位核苷酸为终止密码子。

其中，互补决定区的序列根据Kabat定义。抗体mhS1为IgG1，轻链类型为kappa(κ)型。

二、抗体的制备

1、抗体的表达

将上述步骤一构建好的表达质粒pcDNA3.1-mhS1H和pcDNA3.1-mhS1K，利用转染试剂FectoPRO DNA Transfection Reagent(Polyplus，116-001)共转染FreeStyle^TM HEK293-F细胞(Invitrogen，R79007)。具体如下：转染前一天选取生长状态良好的，密度在2-3×10⁶/mL左右的FreeStyle^TM HEK293-F细胞，离心去除上清，用FreeStyle293培养基(Gibco，12338-018)重悬，调整细胞密度为1.0×10⁶/mL，按30mL细胞悬液/瓶进行分装，37℃，5％CO₂，125rpm，细胞摇床中震荡培养；转染当天，转染复合物制备：24μL的FectoPRO转染试剂稀释于3mL FreeStyle 293培养基，轻轻混匀，加入轻重链质粒DNA各12μg，混匀后室温放置10min；然后将混合溶液加到准备好的FreeStyle^TM HEK293-F细胞中，轻轻混匀，放回细胞摇床中继续培养；转染后48小时开始监测细胞活度，在细胞活度降到80-85％时8,000rpm离心10min收集培养上清进行纯化。

2、抗体的纯化

收集的抗体表达上清用0.45μm滤膜过滤以去除杂质，利用HiTrap^TMMabSelectXtra预装柱(GE，28-4082-58)进行纯化，收集UV280>100时的洗脱峰。再用Hitrap^TMDedalting层析柱置换缓冲液为0.01M的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)，取部分样品SDS-PAGE检测和浓度检测，其余的分装冻存于-80℃备用。

图1为纯化后的mhS1抗体SDS-PAGE检测结果。由图可见，纯化后的mhS1抗体还原性样品有两条清晰的条带，分子量较大的条带为重链，分子量较小的条带为轻链。

3、抗体的定量

将纯化并置换后的抗体溶液用0.45μm滤膜过滤除菌，取样用NanoDrop紫外分光光度计(Thermo Scientific)测定蛋白浓度(4mg/mL)。

实施例3、mhS1抗体的特异性结合能力检测

一、F1重组蛋白的制备

(1)鼠疫菌F1蛋白基因的合成与重组蛋白表达质粒的构建

根据GENEBANK公布的F1基因序列(ID：57977636，SEQ ID No.10，编码SEQ ID No.9所示的F1蛋白)，委托上海生工生物工程公司进行全基因合成，两端分别添加酶切位点EcoRI和XhoI，合成基因酶切后插入同样酶切的原核表达载体pET32a(Novagen)，经测序验证正确后命名为pET-F1。

(2)重组F1蛋白的表达与纯化

将重组质粒pET-F1转化入E.coli BL21(DE3)，IPTG(0.4mmol/L)，30℃，进行诱导表达，4h后8000rpm离心30min，弃掉上清，收集菌体，用PBS缓冲液重悬菌体，混匀至适当浓度(200ml的菌液离心后用100mL PBS缓冲液重悬)，置于冰水混合物中，用超声波细胞粉碎仪进行超声破碎，4℃，8000rpm离心10min，收集上清、沉淀、未诱导菌液、诱导全菌，通过SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达(图2)。

取阳性表达克隆扩大培养，IPTG(0.4mmol/L)进行诱导表达。

用Ni-NTA柱纯化目的蛋白：

首先用去离子水冲洗管道至平衡，过程中将HisTrap^TM HP(5mL)纯化柱连接到AKTA蛋白纯化仪上，然后换成A1液(20mM pH7.5磷酸盐缓冲液，500mM NaCl，20mM咪唑)平衡三个柱床体积，以上流速均为3mL/min。从A管道将上述含有F1的上清上样，再用A1液洗去未结合蛋白，用B1液(20mM pH7.5磷酸盐缓冲液，500mM NaCl，500mM咪唑)进行梯度洗脱，收集洗脱峰。再用HisTrap^TM Desalting(5mL)对纯化样品脱盐：首先去离子水平衡至pH7.0，最后用A2液平衡三个柱床体积，流速均为3mL/min，从侧管道上样，并收集样品40mL，获得的洗脱峰进行SDS-PAGE检测，结果显示，纯化后F1蛋白无杂带，条带大小在15-25KD之间(图3)，与预期分子量18.7KD一致，分装冻存于-80℃。

二、ELISA检测抗体mhS1与F1的特异性结合

1、取F1重组蛋白(步骤一制备)，补碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)稀释至2μg/mL，按每孔100μL加入到酶标板(Corning，9018)中，每个样品设置2个复孔，4℃包被过夜；

2、取上述酶标板，PBST(PBS+0.1％Tween20)洗板3次，加入含有2％BSA的PBS封闭液，37℃孵育2h。弃去封闭液，每孔加入100μL的实施例2得到的mhS1抗体(稀释到浓度20μg/mL)，37℃孵育90min；

4、取上述酶标板，PBST(PBS+0.1％Tween20)洗3次，每孔加入100μL的1：5000倍稀释酶标抗体-山羊抗人IgG-HRP(中杉金桥，ZB-2304)，37℃孵育45min；

5、取所述酶标板，然后PBST洗板3次，每孔加入100μL OPD底物显色液，室温下孵育10min；

6、每孔加入100μL 2M硫酸溶液终止反应；

7、酶标仪492nm/630nm双波长测定光密度值。

以上步骤同时设置采用鼠疫杆菌V重组蛋白、鼠疫杆菌V270重组蛋白、肉毒毒素BHC、EHC、FHC混合样品和7型腺病毒LP12蛋白，作为无关抗原对照组。

结果如图4所示。结果表明，mhS1抗体可以特异性结合F1重组蛋白，而不结合鼠疫杆菌重组V蛋白、鼠疫杆菌重组V270蛋白、肉毒毒素BHC、EHC、FHC混合样品和7型腺病毒LP12蛋白。

三、mhS1抗体与F1结合能力的检测

2、取上述酶标板，PBST(PBS+0.1％Tween20)洗板3次，加入含有2％BSA的PBS封闭液，37℃孵育2h；

3、取上述酶标板，弃去封闭液，每孔加入100μL按照3倍倍比稀释的实施例2得到的mhS1抗体(最高浓度为20μg/mL，133.33nmol/L)，一共设置15个梯度，37℃孵育90min；

6、每孔加入100μL 2M硫酸溶液终止反应；

7、酶标仪492nm/630nm双波长测定光密度值。

结果如图5所示。图中，横坐标为蛋白摩尔浓度的对数值，纵坐标为光密度值。分析显示mhS1抗体与F1重组蛋白的结合能力为EC50＝0.01144nM。

实施例4、mhS1抗体小鼠体内中和活性检测

用攻毒剂量为200CFU(10×LD50)的鼠疫耶尔森菌201株(记载于“杨文慧等.鼠疫耶尔森菌人工气溶胶的沉降与衰亡空气生物学特性研究.军事医学,2019年9期”一文，按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用)以液体气溶胶肺递送方式(采用肺部液体定量雾化器，HRH-MAG4，北京慧荣和科技有限公司产品)攻毒小鼠(雌性6-8周龄Balb/C小鼠)，两组小鼠，每组六只。20小时后通过尾静脉对抗体组小鼠注射抗体mhS1 400μg，注射体积为100μL，对照组小鼠尾静脉注射生理盐水100μL，观察并记录攻毒后14天内各组小鼠生存情况，绘制生存曲线。

结果如图6所示，在10×LD50鼠疫菌201株攻击下，对照组小鼠在第4天已经全部死亡，平均存活时间为3.8d，mhS1抗体400μg组至实验结束全部存活，存活率为100％(6/6)。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一株鼠疫中和抗体及其应用

<130> GNCLN220666

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial sequence

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1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Met Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Ile Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Ala Ser Ser Asn Ala Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Gly Tyr Glu Lys Arg Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

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<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys

100 105

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<211> 363

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

caggtgcagc tgaaggagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60

tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tacactggat gaagcagagg 120

cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtca ttctatatat 180

gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagacg catcctccaa cgcagcctac 240

ttgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagatcctat 300

ggttacgaga agaggtatgc catggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtgtcc 360

tca 363

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<212> DNA

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<400> 4

gacattgtga tgacccagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gtgcaagtca gggcattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120

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ggcaccaagc tggaaatgaa a 321

<210> 5

<211> 451

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 5

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Met Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Ile Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Ala Ser Ser Asn Ala Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Gly Tyr Glu Lys Arg Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 6

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 6

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 7

<211> 1356

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

caggtgcagc tgaaggagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60

tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tacactggat gaagcagagg 120

cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtca ttctatatat 180

gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagacg catcctccaa cgcagcctac 240

ttgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagatcctat 300

ggttacgaga agaggtatgc catggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtgtcc 360

tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1080

gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320

acgcagaaga gcctctccct gtccccgggt aaatga 1356

<210> 8

<211> 645

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

gacattgtga tgacccagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gtgcaagtca gggcattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaagtcct gatctattac acatcaactt tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagcaa cctggaacct 240

gaggatattg ccacttacta ttgtcagcag tatagcaaac ttccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatgaa acgtacggtg gcggcgccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggtaccgct agcgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645

<210> 9

<211> 170

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 9

Met Lys Lys Ile Ser Ser Val Ile Ala Ile Ala Leu Phe Gly Thr Ile

1 5 10 15

Ala Thr Ala Asn Ala Ala Asp Leu Thr Ala Ser Thr Thr Ala Thr Ala

20 25 30

Thr Leu Val Glu Pro Ala Arg Ile Thr Leu Thr Tyr Lys Glu Gly Ala

35 40 45

Pro Ile Thr Ile Met Asp Asn Gly Asn Ile Asp Thr Glu Leu Leu Val

50 55 60

Gly Thr Leu Thr Leu Gly Gly Tyr Lys Thr Gly Thr Thr Ser Thr Ser

65 70 75 80

Val Asn Phe Thr Asp Ala Ala Gly Asp Pro Met Tyr Leu Thr Phe Thr

85 90 95

Ser Gln Asp Gly Asn Asn His Gln Phe Thr Thr Lys Val Ile Gly Lys

100 105 110

Asp Ser Arg Asp Phe Asp Ile Ser Pro Lys Val Asn Gly Glu Asn Leu

115 120 125

Val Gly Asp Asp Val Val Leu Ala Thr Gly Ser Gln Asp Phe Phe Val

130 135 140

Arg Ser Ile Gly Ser Lys Gly Gly Lys Leu Ala Ala Gly Lys Tyr Thr

145 150 155 160

Asp Ala Val Thr Val Thr Val Ser Asn Gln

165 170

<210> 10

<211> 513

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

atgaaaaaaa tcagttccgt tatcgccatt gcattatttg gaactattgc aactgctaat 60

gcggcagatt taactgcaag caccactgca acggcaactc ttgttgaacc agcccgcatc 120

actcttacat ataaggaagg cgctccaatt acaattatgg acaatggaaa catcgataca 180

gaattacttg ttggtacgct tactcttggc ggctataaaa caggaaccac tagcacatct 240

gttaacttta cagatgccgc gggtgatccc atgtacttaa catttacttc tcaggatgga 300

aataaccacc aattcactac aaaagtgatt ggcaaggatt ctagagattt tgatatctct 360

cctaaggtaa acggtgagaa ccttgtgggg gatgacgtcg tcttggctac gggcagccag 420

gatttctttg ttcgctcaat tggttccaaa ggcggtaaac ttgcagcagg taaatacact 480

gatgctgtaa ccgtaaccgt atctaaccaa taa 513

Claims

1.抗体，其特征在于：所述抗体的重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1的第26-33位、SEQ ID No.1的第51-58位、SEQ ID No.1的第97-110位所示；所述抗体的轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.2的第27-32位、SEQ ID No.2的第50-52位、SEQ ID No.2的第89-97位所示。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNo.1，或者与SEQ ID No.1具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性；和/或

所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.2，或者与SEQ ID No.2具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性。

3.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于：所述抗体为全长抗体、单链Fv片段、Fab片段或F(ab’)₂片段。

4.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于：所述全长抗体的重链恒定区为IgG1亚型，轻链恒定区为kappa亚型。

5.根据权利要求4所述的抗体，其特征在于：所述抗体的重链的氨基酸序列为SEQ IDNo.5，或者与SEQ ID No.5具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性；和/或

所述抗体的轻链的氨基酸序列为SEQ ID No.6或者与SEQ ID No.6具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性。

6.核酸分子，其特征在于：所述核酸分子编码权利要求1-5中任一所述的抗体或所述抗体中的抗原结合部分。

7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于：在所述核酸分子中，编码所述抗体的重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID No.3自5’端起第76-99位、第151-174位、第289-330位所示；和/或

在所述核酸分子中，编码所述抗体的轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LCDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID No.4自5’端起第79-96位、第148-156位、第265-291位所示；

或

进一步地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的所述重链可变区的核苷酸序列为SEQID No.3或者与SEQ ID No.3具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性；和/或

进一步地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的所述轻链可变区的核苷酸序列为SEQID No.4或者与SEQ ID No.4具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性；

或

更进一步地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的重链的核苷酸序列为SEQ ID No.7或者与SEQ ID No.7具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性；和/或

更进一步地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的轻链的核苷酸序列为SEQ ID No.8或者与SEQ ID No.8具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性。

8.含有权利要求6或7所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。

9.药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包含权利要求1-5中任一所述的抗体和药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

10.应用，为如下任一所示：

(A1)权利要求6-8中任一所述的核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌在制备权利要求1-5中任一所述抗体或权利要求9所述药物组合物中的应用；

(A2)权利要求1-5中任一所述抗体在制备权利要求9所述药物组合物中的应用；

(A3)权利要求1-9中任一所述抗体或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于预防和/或治疗由鼠疫耶尔森氏菌感染所致疾病的产品中的应用；

(A4)权利要求1-9中任一所述抗体或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于抑制鼠疫耶尔森氏菌感染的产品中的应用；

(A5)权利要求1-9中任一所述抗体或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于检测鼠疫耶尔森氏菌的产品中的应用；

(A6)权利要求1-9中任一所述抗体或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于中和鼠疫耶尔森氏菌的产品中的应用；

(A7)权利要求1-9中任一所述抗体或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于检测鼠疫耶尔森氏菌的F1蛋白的产品中的应用；

(A8)权利要求1-9中任一所述抗体或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于结合鼠疫耶尔森氏菌的F1蛋白的产品中的应用。