CN117304297A - 一种重组人α-防御素5及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请属于医药生物技术领域，具体涉及一种重组人α‑防御素5及其应用。其mHD5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。原始天然结构相比，其V19和L29位点均突变为R；结构突变调整后的新防御素mHD5蛋白具有更好的抗氧化性能和更好的抑菌效果，尤其是针对不同新冠毒珠刺突蛋白RBM蛋白，表现出较好的结合力，从而使得mHD5可在化妆品、食品保鲜、免疫制剂等领域相关产品中应用。

Description

一种重组人α-防御素5及其制备方法和应用
技术领域
本申请属于医药生物技术领域，具体涉及一种重组人α-防御素5及其制备方法和应用。
背景技术
防御素是一类2-5kDa大小的富含半胱氨酸的阳离子短肽，广泛存在于植物，昆虫和哺乳动物中。根据结构差异，防御素家族分为三个不同的种类：α-防御素、β-防御素和θ-防御素。其中α-防御素和β-防御素在人类和其他哺乳动物中都有表达，但θ-防御素只存在于非人类灵长类动物中。
就人类而言，目前已鉴定出六种人α-防御素。根据基因组成和来源的不同，α-防御素又被分为人中性粒细胞多肽1-4(HNP1、HNP2、HNP3和HNP4)和人肠防御素5-(HD5和HD6)两类。其中肠源性防御素HD5和HD6主要在肠道潘氏细胞(Paneth cell,PC)中表达。
研究表明，HD5是一种主要由小肠隐窝基底部的潘氏细胞分泌的广谱性宿主性防御肽，成熟肽分子由32个氨基酸残基组成，富含精氨酸和半胱氨酸，在生理pH下带4个正电荷，其氨基酸序列中6个半胱氨酸形成3对二硫键，其成键方式为C1-C5、C2-C4、C3-C6，且空间上呈β-片层样结构。
HD5作为一种防御抗菌肽，对多种致病菌(例如艰难梭菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等)具有广谱抗菌性，对多种病毒(例如乳头瘤病毒、腺病毒、疱疹病毒等)也表现出较好的抗病毒活性，另外，相关研究表明HD5在人体免疫调节以及多种肿瘤的发生发展中也具有重要的影响，因此，对于HD5在医药领域用途的深入研究，对于增强医疗健康保障水平是具有重要的技术意义的。
现有研究虽然表明HD5具有广泛的医药防治用途，但实际临床转化应用时仍然存在较多局限性，其主要原因在于HD5分子结构本身含有3对二硫键结构，使得化学合成制备HD5分子时存在技术难度大、合成费用高、合成周期长等，这些因素都限制了HD5分子的实际推广应用。
发明内容
本申请目的在于通过对HD5分子结构研究，提供一种改进型的重组人α-防御素5(HD5)分子，从而可为相关疾病的防控奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种重组人α-防御素5，其结构相较于原始天然结构的HD5，其V19和L29突变为R；结构突变调整后的mHD5蛋白的氨基酸序列(32aa)如SEQ IDNo.1所示，具体如下：
ATCYCRTGRCATRESLSGRCEISGRLYRRCCR；
对应的编码核苷酸序列(99bp)如SEQ ID No.2所示，具体如下：
GCCACCTGCTATTGCCGAACCGGCCGTTGTGCTACCCGTGAGTCCCTCTCCGGGCGTTGTGAAA TCAGTGGCCGCCTCTACAGACGCTGCTGTCGCTGA。
以pET32a或pGEX-4T-1质粒为载体，重组mHD5的编码核苷酸序列后，转化BL21的DE3型(BL21(DE3))感受态细胞，并利用IPTG诱导蛋白表达可获得本申请的重组人α-防御素5。
所述重组人α-防御素5可应用于制备新冠病毒SARS-CoV-2(COVID-19)的防治药剂。
所述重组人α-防御素5可应用于制备革兰氏阴性致病菌防治药剂中，所述革兰氏阴性致病菌例如为：肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、奇异变形杆菌(Bacillusmirabilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、或弗格森埃希菌(Escherichiafergusonii)。
所述重组人α-防御素5在制备抗氧化活性药剂中的应用，重组人α-防御素5具有清除DHHP、ABTS+自由基能力。
本发明的有意效果：
为提高现有天然HD5的应用效果，不同技术人员针对HD5分子结构中不同位点氨基酸进行了不同尝试，但不同改造方式所导致的实际技术效果也是差异较大的。本申请中，发明人通过对现有天然防御素HD5蛋白结构研究，通过对其特点位点氨基酸突变，将其结构突变调整成新的mHD5蛋白。进一步通过原核表达方式获得相关重组蛋白后，初步实验结果表明，结构突变调整后的新防御素mHD5蛋白具有更好的抗氧化性能、更好的抑菌效果，尤其是针对不同新冠毒珠刺突蛋白RBM蛋白表现出较好的结合力，这些结果都为mHD5在化妆品、食品保鲜、免疫制剂等领域相关产品的应用提供了较好的理论支持，同时也为其他生物医药蛋白的改进提供了新的技术思路。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为天然HD5与结构突变调整后mHD5分子结构对比；其中
(a)为mHD5与HD5的三维结构叠加图；核磁分析的彩色视图下，粉红色为HD5，浅蓝色为mHD5；
(b)为mHD5的拉氏图分析结果，统计结果表明，最有利范围的氨基酸占比为92.6％，所有氨基酸均处于合理范围；
图2为对HD5及mHD5的二聚体结构分析的可视化结果；
图3为HD5、mHD5分别与ACE2的结合力对比；图中：VDW，范德华力；ELE，静电作用；GB，溶剂化自由能；SA，疏水作用；Total，总结合自由能；
图4为mHD5基因的PCR扩增结果和相关鉴定结果；其中：
(a)为mHD5基因的扩增产物电泳结果(扩增后长度为129bp，其中含有同源臂30bp)，图中M为marker，1、2、3条带为扩增结果，4为阴性对照；
(b)为对空质粒pGEX-4T-1的双酶切结果，图中1为酶切前，2为酶切后；
(c)为对菌液PCR鉴定结果，图中M为marker，1、2、3条带为以菌液为模板进行PCR扩增条带结果，4为阴性对照；
图5为针对Delta-RBM基因的PCR扩增结果、pET28a-EGFP质粒酶切、以及针对重组质粒pET28a-EGFP-Delta-RBM的菌液PCR鉴定结果；其中：
(a)为Delta-RBM基因的PCR扩增结果(长度为322bp)；
(b)为pET28a-EGFP质粒的Sal I、Xhol I双酶切结果；图中1为酶切前，2为酶切后；
(c)为对重组质粒pET28a-EGFP-Delta-RBM的菌液PCR检测结果，图中：M为marker，1、2、3为以重组菌液为模板进行的扩增条带结果，4为阴性对照；
图6为诱导蛋白表达结果；其中：
(a)为不同新冠毒株的RBMs的蛋白诱导表达检测结果，重组表达的RBMs蛋白分子量为28kDa左右，图中：M为marker，1、4、7分别为SARS-Cov-2、B.1.1.7、B.1.617新冠病毒结合基序的诱导前结果；2、5、8分别为SARS-Cov-2、B.1.1.7、B.1.617新冠病毒结合基序的诱导后结果；3、6、9分别为SARS-Cov-2、B.1.1.7、B.1.617新冠病毒刺突蛋白受体结合基序的纯化后结果；
(b)为利用pGEX-4T-1诱导表达HD5(HD5-GST蛋白)前后结果，HD5(HD5-GST蛋白)分子量为36kDa左右，图中：M为marker，1为诱导前，2为诱导后，3为菌体破碎后上清，4为菌体破碎后沉淀，5为蛋白纯化后；
图7为纯化后蛋白电泳结果；其中：
(a)为HD5蛋白纯化(约21kDa)后电泳结果，图中：泳道M为marker，1为诱导前，2为诱导后，3为破菌后上清，4为破菌后沉淀，5为纯化后；
(b)为rmHD5蛋白纯化(约21kDa)后电泳结果，图中：泳道M为marker，1为诱导前，2为诱导后，3为菌体破碎后上清，4为菌体破碎后沉淀，5为纯化后；
(c)为利用pET28a-EGFP表达Delta株的RBM蛋白(约36kDa)纯化结果，图中：泳道M为marker，1为诱导前，2为诱导后，3为破菌后上清，4为破菌后沉淀，5为纯化后；
(d)为利用pET28a-EGFP表达Omicron株的RBM蛋白(约36kDa)纯化结果，图中：1为诱导前，2为诱导后，3为破菌后上清，4为破菌后沉淀，5为纯化后样品；
图8为防御素mHD5(或HD5)与不同毒株的RBM的Pull Down实验结果；图中：M泳道为marker，1为HD5(HD5-GST)电泳结果，2为纯化HD5与SARS-Cov-2RBM结果，4为纯化HD5与B.1.1.7RBM结果，6为纯化HD5与B.1.617RBM结果，8为纯化HD5与“rfoxo”(rfoxo组为阴性对照，其涉及为其他与本申请无关类型蛋白，不再详述)RBM结果；3、5、7、9分别为HD5与不同his-tag蛋白的pull down结果；
图9为mHD5(或HD5)蛋白与不同毒株的微量热涌动(亲合力)检测结果；其中：
(a)为HD5与Delta株结果，其Kd＝99.3±14.7nM；
(b)为(a)对应的热涌动曲线；
(c)为rmHD5与Delta株结果，其Kd＝10.3±1.06nM；
(d)为(c)对应的热涌动曲线；
(e)为HD5与Omicron株结果，其Kd＝3.27+0.451μM；
(f)为(e)对应的热涌动曲线；
(g)为mHD5与Omicron株结果，其Kd＝2.25±0.278μM；
(h)为(g)对应的热涌动曲线；
图10为HD5和mHD的针对不同致病菌株的抑菌活性结果；其中：
(a)为弗格森埃希菌结果；
(b)为奇异变形杆菌结果；
(c)为肺炎克雷伯氏菌结果；
(d)为铜绿假单胞菌结果；
CK组为阴性对照组(用同样浓度的空质粒pET32a表达蛋白作为替代)，rHD5即所表达的天然HD5蛋白，rmHD5即所表达的分子结构调整突变后的mHD5蛋白；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图11为HD5、mHD5针对相关自由基的清除效果；其中：
(a)为HD5、mHD5对DPPH的自由基清除能力；
(b)为HD5、mHD5对ABTS自由基清除能力；图中：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图12为HD5、mHD5的溶血实验结果；其中：
(a)为溶血率结果；
(b)为部分典型溶血实验图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
生物材料：
肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、奇异变形杆菌(Bacillusmirabilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，购买自上海鲁微科技有限公司；
耐卡那霉素的弗格森埃希菌(Escherichia fergusonii)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，生物医学研究中常见细菌，可由公开渠道获得，申请人作为专业性研究机构，长期保存有相关菌株；
大肠杆菌5α感受态细胞、BL21(DE3)感受态细胞，购自北京擎科生物科技有限公司；
质粒pET32a(氨苄青霉素抗性)、质粒pGEX-4T-1(氨苄青霉素抗性)、质粒pET28a-EGFP(卡那霉素抗性)，分子生物学研究中常用质粒载体，可由公开渠道获得，申请人作为专业性研究机构，长期保存有相关质粒；
含有天然HD5序列的质粒(HD5-pET32a)，含有SARS-Cov-2、B.1.1.7、B.1.617新冠病毒受体结合基序的合成质粒(pET32a载体)，含有德尔塔株、奥密克戎株新冠病毒的受体结合基序的合成质粒(pET28a-EGFP载体)，均由华大基因合成提供；
相关基因序列、引物合成、测序等工作，也由华大基因合成提供完成；
主要试剂：
T4连接酶，NEB公司产品；
胶回收试剂盒、纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒，OMEGA公司产品；
蛋白胨、酵母提取物，OXOID公司产品；
尿素(urea)、谷胱甘肽(还原型)，购自北京索莱宝科技有限公司；
DNA Marker、DNA loading buffer等，购自北京擎科生物科技有限公司；
Gel red、2×Taq Master Mix、2×Phanta Flash Master Mix、重组克隆试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；
ABTS+、限制性内切酶，赛默飞世尔科技公司产品；
蛋白Marker、SDS-PAGE凝胶试剂盒，购自上海雅酶生物医药有限公司；
DPPH，上海化成工业发展有限公司产品；
抗坏血酸(VC)，购自天津科密欧化学试剂有限公司；
LB培养基(液体、固体)、电泳液50×TAE、TBS、8M脲平衡缓冲液、2M咪唑洗脱液、考马斯亮蓝R-250染色液、硫酸卡那霉素和氨苄青霉素抗生素溶液、硫酸镍(50mM)、StripBuffer等，参考现有技术常规配制即可；
主要仪器设备：
电泳仪，北京六一仪器厂产品；
电泳系统、凝胶成像系统，美国伯乐(Bio-Rad)产品；
PCR扩增仪，德国艾本德(Eppendorf)产品；
酶标仪，瑞士帝肯(Tecan)公司产品；
化学发光成像仪，北京赛智创业科技有限公司产品；
微量热涌动仪，德国诺坦普科技有限公司产品。
实施例1
鉴于天然HD5分子实际应用时存在较多局限性，因此，通过对其分子结构进行进一步调整改造是增强其应用效果的良好方式，因此，借助于相关计算机分析软件，基于增强其应用效果目的，发明人首先对天然HD5分子进行了尝试性突变改造。相关过程简介如下。
首先，利用Chimera软件对HD5(protein database bank，PDB：1ZMP)分子结构进行了分析，并确定合适的结构调整位点；
随后，基于相关结构稳定性和相关化学键结合力等原因，综合考虑情况下，最终选择氨基酸序列中第19位缬氨酸(Val，V)和29位亮氨酸(Leu，L)作为调整位点，并将中第19位缬氨酸和29位亮氨酸均突变调整为精氨酸(Arg，R)，并将此突变后HD5命名为mHD5；
最后，对此结构突变调整后mHD5与天然HD5结构进行对比，并对相关化学键能情况进行分析，以评估突变调整后mHD5分子结构的合理性。
相关对比结果简介如下。
将天然HD5与突变后mHD5进行结构叠合，结果如图1所示。可以看出，分子结构调整前后，均具有类似的三维结构，同时，结构优化调整后氨基酸100％的处于合理的范围内，这些结果初步表明结构优化调整后的mHD5仍然具有原有的生物活性、以及相应的抗菌免疫作用效果。
由于二聚体是HD5发挥生物学功能的基本结构单位形式，因此，发明人利用ligplot对HD5和mHD5的二聚体结构进行了进一步分析。这种二聚体结构短肽的可视化结果如图2所示。分析可以看出：
HD5的二聚体结构中，其二聚体形式由β2链的17位丝氨酸(O)、19位缬氨酸(O，N)和21位精氨酸(O，N)和β1链的1位丙氨酸(O)、3位半胱氨酸(O，N)、5位半胱氨酸(N)来稳定；
mHD5的二聚体结构中，其二聚体形式由β2链的17位丝氨酸(O)、19位精氨酸(O，N)、21位精氨酸(O，N)和β1链的1位丙氨酸(O)、3位半胱氨酸(O，N)、5位半胱氨酸(N)稳定。
也即，分子结构突变调整前后，对于二聚体结构本身并不构成较大影响，这也确保了mHD5分子仍然具有与HD5相同的抗菌、免疫效果。另外，上述结果也表明，第19位氨基酸类型而二聚体结构形成中具有关键性作用，而通过对第19位氨基酸类型的调整，相关对比结构也初步表明，天然HD5第19为氨基酸由缬氨酸突变调整为精氨酸后，所形成的二聚体结构具有更好的稳定性。
上述分析结果基础上，更进一步的，以ACE2(Angiotensin-converting enzyme 2，血管紧张素转换酶2)作为靶向蛋白，发明人利用相关分析网站，就HD5、mHD5与其结合情况进行了模拟分析。结果如图3所示。
分析可以看出：mHD5与ACE2的结合能相较于HD5降低，表明与HD5相比，mHD5与ACE2的结合能力更强(结合能越低，表明受体与配体的结合能力越强；HD5与ACE2的总结和能为-251.1KJ/mol，mHD5与ACE2的总结和能为-225.91KJ/mol)。换言之，特定位点氨基酸突变调整后，突变体mHD5与ACE2的结合能力得到了进一步增强。
基于上述结果，可以具体明确如下：
结构突变调整后的mHD5蛋白的氨基酸序列(32aa)如SEQ ID No.1所示，具体如下：
ATCYCRTGRCATRESLSGRCEISGRLYRRCCR；
对应的编码核苷酸序列(99bp)如SEQ ID No.2所示，具体参考如下：
GCCACCTGCTATTGCCGAACCGGCCGTTGTGCTACCCGTGAGTCCCTCTCCGGGCGTTGTGAAA TCAGTGGCCGCCTCTACAGACGCTGCTGTCGCTGA。
实施例2
在实施例1明确肽链分子结构基础上，结合制备的便捷性、产业化等因素，发明人采用原核表达方式具体制备了结构突变调整后的mHD5(作为对照，同步制备了HD5)，本实施例就相关制备过程简介如下。
(一)PCR扩增获得相关基因序列
基于实施例1中mHD5的核苷酸序列，发明人委托华大基因公司合成了相关序列，并由华大基因公司进一步将该基因序列与pET32a进行了连接重组(将含有mHD5的核苷酸序列的pET32a命名为：mHD5-pET32a；同时，由该公司提供了含有HD5基因序列的重组质粒HD5-pET32a)；
结合后续酶切(酶切位点选择EcoR I、Xho I)需要，设计PCR扩增用引物序列如下：
mHD5-F：GGTTCCGCGTGGATCCGCCACCTGCTATTG，
mHD5-R：ATGCGGCCGCTCGAGTTAGCGACAGCAGAGTCT；
以mHD5-pET32a质粒为模板，利用上述引物对进行PCR扩增，扩增时，20μL扩增体系参考设计如下：
2×Taq Master Mix，10μL；
正向引物，0.5μL(10μM)；
反向引物，0.5μL(10μM)；
模板，0.5μL；
ddH2O，8.5μL；
PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸10s，30个循环；最后72℃延伸10min。
扩增完成后，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并对目的胶条进行回收、纯化(参考胶回收试剂盒说明书进行操作即可)，获得纯化的PCR扩增产物。
部分电泳结果如图4所示。可以看出，相关电泳结果符合预期，表明成功获得了相关基因序列。
需要说明的是，后续实验过程中，由于考虑需要对结构调整突变后mHD5对新冠病毒的作用效果，因此，利用：含有SARS-Cov-2、B.1.1.7、B.1.617新冠病毒受体结合基序的合成质粒(pET32a载体)，含有德尔塔株、奥密克戎株新冠病毒的受体结合基序的合成质粒(pET28a-EGFP载体)，发明人同步扩增了相关的新冠病毒毒株的RBM基因序列(仅需扩增德尔塔株、奥密克戎株，其他毒株直接转化进行蛋白表达制备)，并进行了蛋白制备；
PCR扩增时，相关引物序列设计如下：
Delta-F：ATGGACGAGCTGTACAAGGGATCCAAGATTGCTGATTATAAT，
Delta-R：GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTATGGTTGGTAACC。
针对德尔塔株新冠病毒受体结合基序(Delta-RBM基因)，电泳结果如图5所示。分析可以看出，电泳结果与理论预期结果一致(扩增产物中含同源臂的条带长度为322bp，Delta-F引物中与pET-28a-EGFP同源臂为24bp，基因特异序列18bp；Delta-R引物中与pET-28a-EGFP同源臂为21bp，基因特异序列15bp)。
(二)双酶切、连接
对质粒pGEX-4T-1进行EcoR I、Xho I双酶切，20μL酶切体系参考如下：
质粒pGEX-4T-1，6μL；
10×Buffer，2μL；
内切酶EcoR I，1μL；
内切酶Xho I，1μL；
ddH2O，10μL；
37℃酶切0.5h；
酶切完成后，进行琼脂糖凝胶电泳检测(结果如图4所示，相关结果符合预期)，回收酶切产物；
随后，将上述所回收的酶切产物与PCR扩增产物进行连接(即，将PCR扩增序列与线性化后载体进行连接)，10μL连接体系参考设计如下：
基因片段(PCR扩增产物)，4μL；
酶切后线性化质粒载体，3μL；
5×CEⅡBuffer，2μL；
ExnaseⅡ，1μL；
37℃下连接30min。
对于相关新冠毒株所涉及的pET28a-EGFP为质粒载体，酶切时，采用Sal I和XholI双酶切处理(结果如图5所示，相关结果符合预期)。
(三)转化、筛选
将上述连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并进一步进行筛选和检测，确保相关质粒重组正确(含有mHD5的重组质粒命名为：mHD5-pGEX-4T-1，其他由华大基因提供的含有不同毒株RBM的质粒统称为RBMs-pET32a或RBMs-pET28a-EGFP直接进行转化操作，无需经过前述酶切、连接操作；同时，作为对照，直接将将含有mHD5的质粒mHD5-pET32a、含有HD5基因序列的质粒HD5-pET32a进行转化操作，同样无需经过前述酶切、连接操作)。
转化时，可采用热激法转化，具体操作参考如下：
在50μL感受态DH5α细胞培养液中加入10μL连接产物，冰上静置30min后，42℃热激60s，再立即置冰上孵育5min；
随后，加入500μL的LB液体培养基，37℃、220rpm培养1h；
最后，吸取150μL转化后菌液均匀涂布在卡那霉素抗性的固体培养基平板上，37℃恒温培养箱中倒置培养过夜。
筛选操作时，挑取倒置培养后阳性单菌落接种于LB液体培养基中进行培养扩增，进一步进行菌液PCR扩增鉴定(对于pGEX-4T-1-mHD5重组质粒的鉴定结果如图4所示，针对质粒Delta-RBM-pET28a-EGFP的鉴定结果如图5所示，分析可以看出，相关结果均符合预期，表明相关质粒的连接重组是正确的)和测序鉴定，确保质粒重组正确，并将含有重组质粒正确的菌株保存备用。
(四)转化、诱导表达蛋白
对步骤(三)中含有重组质粒的mHD5-pGEX-4T-1(RBMs-pET32a或RBMs-pET28a-EGFP)的大肠杆菌扩增培养后，提取质粒(参考质粒提取试剂盒说明书进行操作即可)，参考前述操作，进一步转化BL21(DE3)感受态细胞，并进一步筛选获得转化正确的菌株；
取转化正确菌株的3ml菌液转接于300mL抗性LB培养基中，37℃、220rpm培养3h后，加入IPTG至终浓度为0.2mM，16℃、220rpm诱导表达18h。
诱导表达前、后，分别取样进行SDS-PAGE电泳检测。
(五)提取和纯化重组蛋白
按照蛋白表达形式差异(根据上述SDS-PAGE电泳检测结果)，确定合适的蛋白提取、纯化方法。具体参考如下。
由于所采用的pGEX-4T-1质粒含有GST标签序列，结合前述SDS-PAGE电泳结果，针对mHD5基因(或HD5基因)，所表达的重组蛋白主要以可溶蛋白形式表达于细胞上清，因此，具体提取、纯化方法参考如下：
首先，收集细胞培养液，4℃、6000rpm下离心10min，弃上清，PBS重悬菌体沉淀，冰上超声破碎完成后，4℃、10000rpm下离心1h，取上清，并对上清液中GST标签蛋白的含量进行测定(利用BCA试剂盒进行测定即可)；
随后，将表达的含有mHD5-GST重组蛋白(或HD5-GST重组蛋白)上清利用0.45μm的滤膜过滤后，上层析柱过滤(GST树脂，全式金DP201-01；根据前述蛋白含量检测结果，事先向层析柱填充适量填料，并事先用超纯水对填料进行洗涤和利用PBS对填料进行预平衡处理)；过滤完成后(挂柱两次)，将层析柱4℃、静置孵育30min；
孵育结束后，先用5倍柱体积的PBS洗柱以去除杂蛋白，再用谷胱甘肽洗脱液(10mM还原型谷胱甘肽，50mM Tris-HCl(pH＝8.0))洗脱目的蛋白(即，获得mHD5(或HD5))；
对洗脱后的目的蛋白(同步地，取样进行10％ SDS-PAGE凝胶电泳检测纯度)在PBS缓冲液(pH＝7.4)中进行透析后，10000rpm离心30min，留上清进行后续实验检测(或-80℃保存备用)。
针对SARS-Cov-2、B.1.1.7、B.1.617所表达的重组RBMs蛋白，以及基于pET32a所表达的重组蛋白mHD5(或HD5)，结合前述SDS-PAGE电泳结果，其以可溶蛋白形式表达于细胞中；同时，由于所采用的pET32a含有his标签，因此可采用Ni-NTA树脂纯化方法对蛋白进行纯化，具体操作可参考如下：
首先，收集细胞培养液，4℃、6000rpm下离心10min，弃上清，PBS重悬菌体沉淀，冰上超声破碎完成后，4℃、10000rpm下离心1h，分别收集上清和沉淀备用；
随后，(上清)上柱过滤(镍柱事先加有1×charge(50mM NiSO4)以使填料显示为蓝色，并用缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM imidazole)预平衡)；过滤(两遍)完成后，加入6倍柱体积的洗杂液(50mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM imidazole)，以去除杂蛋白；
再后，用洗脱液(50mM Tris-HCl(pH 8.0)，250mM imidazole)从柱上洗脱目的蛋白，并用Elution Buffer对洗脱后目的蛋白进行洗涤；
最后，对洗涤后目的蛋白(同步地，取样进行10％ SDS-PAGE凝胶电泳检测纯度)用PBS缓冲液透析12h(4℃条件)，透析完成后，4℃、10000rpm离心30min，留上清进行后续实验检测(或-80℃保存备用)。
针对德尔塔株、奥密克戎株所表达的Delta-RBM-EGFP、Omicron-RBM-EGFP重组蛋白，电泳结果表明，其以包涵体形式存在，因此，具体提取、纯化操作参考如下：
首先，收集细胞培养液，离心，留细胞沉淀，并对细胞进行超声破碎，破碎完成后，4℃、10000rpm下离心1h，收集沉淀；
随后，在上述沉淀中加入变性剂(8M urea，10mM Tris-HCl(pH＝8.0)，100mMNaH2PO4)，混匀后摇床上变性溶解2h；
溶解完成后，4℃、12000rpm离心30min，留上清并进行0.45μm的滤膜过滤；
再后，参考前述进行Ni-NTA柱进行层析分离和洗脱；
最后，将洗脱液置于透析袋中，透析液(4M urea，1×PBS)中透析12h(每6h更换一次透析液，每次更换透析液降低2M透析液中的尿素浓度)，最后再用PBS透析4h，透析完成后，4℃、12000rpm离心30min，留上清进行后续实验检测(或-80℃保存备用)。
部分表达过程中的电泳检测结果如图6、图7所示。具体而言：
电泳结果表明，以pET32a为载体重组表达的RBMs蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达，以pGEX-4T-1表达的mHD5(或HD5)也主要以可溶性蛋白的形式表达(图6)；而以pET32a为载体表达mHD5(或HD5)的重组蛋白则可溶形式或包涵体形式均有存在(图7)，因此，考虑提取便捷性以及蛋白活性问题，后续均以pGEX-4T-1表达的mHD5(或HD5)进行纯化和相关试验；而pET28a-EGFP表达的蛋白则均以包涵体形式存在；
另外，前期分析结果表明，RBMs的分子量约为28kD，电泳检测结果与此理论值是相一致的(图6)，这也表明成功获得了相关毒株的RBM蛋白，且表明相关蛋白纯度较高(图7)；而重组表达的HD5(HD5-GST)条带大小检测约为30kDa(图6)，进一步纯化后，蛋白条带大小为21kDa，这也与预期结果相符；且基于电泳条带亮度和均一性可以看出，蛋白纯度较高，可以满足后续实验要求(图7)。
(五)实验检测
基于目前新冠防治需要，发明人对所制备的分子结构突变调整后mHD5对相关典型新冠毒株的防治效果进行了初步实验探讨。
(一)GST pull down实验
具体实验操作参考如下：
首先，将GST填料进行清洗预处理后，加入到离心管中；
随后，加入前述所制备的防御素重组表达蛋白，并用超纯水补至总体积为600μL；震荡混合仪中，15rpm、4℃孵育4h；
孵育结束后，4℃、5000rpm离心2min，弃上清，沉淀中加入新冠毒株的重组表达蛋白，震荡混合仪中，15rpm、4℃孵育4h，
孵育结束后，4℃、5000rpm离心2min，弃上清；并用离心方法用PBS洗涤沉淀；
最后，将沉淀用蛋白上样缓冲液重悬后，100℃、煮样10min，取样进行SDS-PAGE凝胶电泳检测。
结果如图8所示。分析可以看出：所表达的重组蛋白HD5可以结合SARS-Cov-2、B.1.1.7、B.1.617新冠病毒刺突蛋白部分的RBM，但与对照蛋白缺乏结合性。也即，这一结果表明HD5在新冠SARS-CoV-2(COVID-19)防治中可能具有一定应用前景。
(二)微量热涌动检测
由于pull down实验结果仅是定性结果，因此，发明人进一步进行了微量热涌动实验，以对防御素mHD5与不同毒株RBM亲合力情况进行定量分析。相关实验操作参考如下。
首先，在PCR管内加入梯度稀释的防御素mHD5(或HD5)稀释液10μL(PBS稀释)；
随后，加入10μL的pET28a-EGFP所表达制备的Delta株或Omicron株的重组RBM蛋白溶液；混匀后毛细管上样检测；
测定时，采用绿色荧光通道进行检测，MST power为20％；检测结束后在NT.Affinity Analysis上对数据进行归一化处理，加热起始时间为5s，冷却起始时间为35s，加热和冷却的时长均为0.5s。重复测定3次，取平均值作为测定结果，并绘制作图。
结果如图9所示。分析可以看出：就不同毒株而言，防御素HD5(或mHD5)与Delta株具有更小的解离常数Kd；而在将HD5进行分子结构调整突变为mHD5后，不管针对哪种毒株，都更进一步降低了解离常数Kd的数值。
换言之，在将HD5突变为mHD5后，进一步增强了防御素蛋白分子与新冠毒株RBM之间的亲合力。对此情况，分析其原因可能是：HD5作为凝集素样的阳离子短肽，能结合高度糖基化的ACE2；在将HD5突变为mHD5后，进一步提高了防御素分子的正电性(pH＝7.3时，ACE2表面带20.5个负电荷)，由此导致mHD5与ACE2具有更强的亲和力。
实施例3
在实施例2基础上，发明人对所制备mHD5在不同医疗方面用途进行了进一步评估，具体情况简介如下。
(一)抑菌性能分析
具体实验操作参考如下。
首先，取保藏的不同致病菌株(4种革兰氏阴性菌：耐卡那霉素的弗格森埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌，1种革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌)，LB液体培养基中，37℃、220rpm培养至OD600＝0.3左右；
随后，在96孔板中，加入100μL纯化的mHD5重组蛋白(蛋白浓度为0.2mg/mL，HD5作为对照)，再按照1:1体积比加入100μL上述菌液；33℃培养箱中静置培养1h；
再后，加入100μL的LB液体培养基，并在37℃培养箱中静置培养7h；
最后，酶标仪检测各组样品在600nm波长处的吸光度值，并计算重组蛋白的抑菌活性。
结果如图10所示。分析可以看出：针对革兰氏阴性菌而言，总体上，将HD5突变为mHD5后，均能够进一步增强防御素蛋白对致病菌的抑制能力，但针对不同致病菌而言，这种增强效果也表现出一定差异。而就针对革兰氏阳性菌而言，无论是HD5、还是mHD5，均缺乏明显的抑制作用效果。
(二)基于DPPH自由基清除能力的抗氧化性活性效果
具体实验操作参考如下。
首先，在酶标板上加入梯度稀释后的100μL防御素蛋白样品溶液(每孔蛋白终浓度依次为：17.5μM、8.5μM、4.3μM、2.2μM、1.1μM、0.6μM)；对照组以抗坏血酸相同浓度溶液替代；
随后，对应板孔内加入100μL的DPPH工作液(0.1mmol/L，乙醇配制，现配现用)，避光反应30min；
最后，酶标仪检测OD517值，并按照如下公式计算DPPH自由基清除率；
DPPH自由基清除率(％)＝[1-(ODsample-ODblank)/ODcontrol]×100％；式中：
ODsample，试验组的吸光度值；
ODblank，无水乙醇代替DPPH的吸光度值；
ODcontrol，无水乙醇代替待测防御素蛋白所测的吸光度值。
基于DPPH自由基率的检测来判定抗氧化活性的主要技术原理为：DPPH的乙醇溶液呈紫红色，酶标仪517nm检测时具有最高的吸光度值；反应后，还原性物质可以通过其单电子配对能力而使DPPH的醇溶液褪色，此时对应的吸光度降低，从而可以反映出被测物质的抗氧化能力(被测物质接受单电子数目越多，褪色程度越明显)。检测过程中，以抗坏血酸为阳性对照。
检测结果如图11所示。分析可以看出：一方面，HD5或mHD5对DPPH自由基的清除效果呈现浓度依赖性，即防御素用量越高，DPPH清除效果也越好，但浓度超过一定限度后，两者对DPPH清除效果也逐渐趋同；另一方面，相对低浓度情况下，mHD5对DPPH清除效果明显优于HD5效果，这也表明，分子结构调整突变后的mHD5具有更好的抗氧化活性效果。分析推测认为造成这种现象的主要原因是：分子突变调整后，正电荷的增加提高了防御素蛋白分子的电子接受能力。
(三)基于ABTS+自由基清除能力的抗氧化性活性效果
具体实验操作参考如下。
首先，配制ABTS工作液，配制时，用无水乙醇将ABTS母液稀释至OD734＝0.7(ABTS母液：1.92mg ABTS和0.66mg K2S2O8溶于500μL无水乙醇中，室温下避光反应12h后形成稳定的自由基母液)；
随后，在酶标板上加入梯度稀释后的100μL防御素蛋白样品溶液(每孔蛋白终浓度依次为：17.5μM、8.5μM、4.3μM、2.2μM、1.1μM、0.6μM)；对照组以抗坏血酸相同浓度溶液替代；
再后，对应板孔内加入100μL的ABTS工作液，避光反应10min；
最后，酶标仪检测OD734值，并参考前述DPPH自由基清除率计算公式计算ABTS自由基清除率；空白组用超纯水代替ABTS工作液，阴性对照组用无水乙醇代替防御素蛋白样品，阳性对照组用相同浓度的抗坏血酸代替防御素蛋白样品。
基于ABTS自由基率的检测来判定抗氧化活性的主要技术原理为：ABTS与K2S2O8反应可以生成稳定的自由基ABTS+，溶液显蓝绿色，在734nm波长处有最大吸光度值；当自由基ABTS+与具有还原性的样品反应后，溶液颜色会变浅，基于此吸光度值变化(ABTS自由基清除率)来反应样品的抗氧化活性。
检测结果如图11所示。分析可以看出：与前述基于DPPH自由基反映结果类似，一方面，HD5或mHD5对ABTS+自由基的清除效果呈现浓度依赖性，即防御素用量越高，ABTS+清除效果也越好，但浓度超过一定限度后，两者对ABTS+清除效果也逐渐趋同(最大清除率在99.4％以上)；另一方面，相对低浓度(0.6–8.5μM浓度范围内)情况下，mHD5对ABTS+清除效果明显优于HD5效果，这也同样表明，分子结构调整突变后的mHD5具有更好的抗氧化活性效果。
(四)溶血活性分析
具体实验操作参考如下。
首先，取生长状态良好的小鼠(BALB/c)，眼眶采静脉血1ml，与生理盐水按1:1体积比混合均匀后，2000rpm离心3min，弃上清；在沉淀的小鼠血细胞中加入1.5mL生理盐水，混匀后，2000rpm离心3min，弃上清；重复此操作直至上清无色为止(大约需5次)；
随后，用生理盐水将小鼠血细胞重悬后，分组：阳性对照组(Apositive)加入含1％Triton X-100的生理盐水10μL；阴性对照组(Anegative)加入生理盐水10μL；实验组(Asample)加入防御素蛋白样品溶液10μL；
最后，检测各组在450nm波长下的吸光值，并按如下公式计算溶血率；
溶血率＝[(Asample－Anegative)/(Apositive－Anegative)]×100％。
结果如图12所示。结果表明：HD5的溶血率为1.48％，而结构调整突变后rmHD5的溶血率为5.46％，但两者在17.5μM下均无溶血作用。这一结果表明，结构调整突变后对rmHD5仍然是具有较好的安全性的。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种重组人α-防御素5，其特征在于，mHD5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
ATCYCRTGRCATRESLSGRCEISGRLYRRCCR。
2.编码权利要求1所述的重组人α-防御素5的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
GCCACCTGCTATTGCCGAACCGGCCGTTGTGCTACCCGTGAGTCCCTCTCCGGGCGTTGTGA AATCAGTGGCCGCCTCTACAGACGCTGCTGTCGCTGA。
3.制备权利要求1所述的重组人α-防御素5的方法，其特征在于：以pET32a或pGEX-4T-1质粒为载体，重组权利要求2所述的核苷酸序列后，转化BL21的DE3型感受态细胞，利用IPTG诱导蛋白表达。
4.权利要求1所述的重组人α-防御素5在制备新冠病毒SARS-CoV-2防治药剂中的应用。
5.权利要求1所述重组人α-防御素5在制备防治革兰氏阴性致病菌防治药剂中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性致病菌为：肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌或弗格森埃希菌。
7.权利要求1所述重组人α-防御素5肽作为抗氧化活性肽的、非治疗目的的应用。
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