CN1172925C - 一种联合制备高纯度紫杉醇、三尖杉宁碱，10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从紫杉植物的树叶、树皮或树枝的醇提取物中联合生产高纯紫杉醇、10-脱乙酰基巴卡亭III和三尖杉宁碱的方法，用乙酸丁酯溶解醇提取物后，用碳酸氢钠溶液反萃取去除杂质将有机相减压蒸发除去溶剂，用乙腈溶解残渣，冷冻结晶得到10-脱乙酰基巴卡亭III，以结晶母液作原料，用以高分子填料为固定相的反相色谱法分离，纯化获得三尖杉宁碱和紫杉醇，用冷冻结晶法从反相色谱洗脱液中分离出有效成分，再结合以硅胶为固定相的正相色谱法深度纯化紫杉醇产品，其纯度达99.6%以上。

Description

一种联合制备高纯度纯紫杉醇、三尖杉宁碱，10-脱乙酰基巴卡亭III的方法

技术领域

本发明涉及用红豆杉科植物及其变种的树叶、树皮、树枝作原料联合制备纯度达≥99.5％的紫杉醇(Taxol)、三尖杉宁碱(Cephalmannine)、10-脱乙酰基巴卡亭III(10-deacetyl baccatin III)的方法。

背景技术

紫杉醇和一些半合成紫杉烷类衍生物如Taxotere已成为一类有效的抗癌药物。10-脱乙酰基巴卡亭III和三尖杉宁碱是半合成紫杉烷类药物的主要原料，与紫杉醇一起存在于许多红豆杉科植物的树叶、树皮、树枝中，现代医药工业要求紫杉醇原料药的纯度达≥99.5％，三尖杉宁碱和10-脱乙酰基巴卡亭III的纯度也应达≥98％。

现已报道的从各种紫杉植物中提取紫杉醇的方法，需经过繁冗的分离过程，例如O.C.H.Huang等在J.Nat.Prod.49 665(1986)揭示的分离方法，仍是较流行的紫杉醇生产方法，该法是先用甲醇浸出粉碎后的短叶紫杉树皮，将浸提液浓缩，用二氯甲烷萃取浓缩物，将二氯甲烷溶液与水进行萃取，再将二氯甲烷层干燥、浓缩制得浸膏。将浸膏溶解后制样，用硅胶作固定相进行多次正相色谱分离，得到紫杉醇浓缩物，再经过氧化，色谱法提纯，重结晶得到紫杉醇产品。这类方法收率低，许多付产品，如三尖杉宁碱经氧化后，已被分解，10-脱乙酰基巴卡亭III也不易回收。

中国专利公开号CN1140170A提出了一种用多孔高分子填料为固定相的反相液相色谱法，从紫杉植物的浸膏中回收紫杉醇的方法。该方法选择性好，回收率高，有可能在生产紫杉醇时，综合回收其他付产品。但用该方法在制备浸膏时，仍用二氯甲烷(或氯仿)萃取紫杉树皮或树叶的甲醇提取物，此阶段10-脱乙酰基巴卡亭III会流失于水相中，造成该付产品损失。该方法揭示，在从洗脱液中分离出紫杉醇等有效成分时，采用浓缩干燥的方法在工业上操作不便，易造成紫杉醇产品的降解。在该方法应用中发现，由于某些存放年代较久的树皮或树叶的浸膏中会产生了大量的降解产物，这些降解产物与紫杉醇的保留值相近，干扰了反相色谱法制备紫杉醇，影响了产品的纯度。至今，未见制备三尖杉宁碱纯品的报道。

发明内容

作为本发明的主题，本发明者发明了一种适合于以各种紫杉植物的树叶、树皮，或树枝作原料联合制备高纯度紫杉醇、10-脱乙酰基巴卡亭III和三尖杉宁碱的方法，方法回收率高，产品纯度好，实现了对紫杉植物原料的综合利用。

本发明的方法包括：

1、用甲醇或乙醇渗滤浸出研磨后的紫杉植物的树叶、树皮或树枝，将滤液过滤后，减压浓缩至干，用乙酸丁酯(或乙酸乙酯)溶解残余物，过滤，往得到的乙酸丁酯(或乙酸乙酯)溶液中加入5％碳酸氢钠(或碳酸钠)水溶液进行反萃取，分出有机相，再用水洗涤有机相至水相呈中性，分出乙酸丁酯(或乙酸乙酯)层用无水硫酸钠干燥后，减压蒸发至干，用乙腈溶解残渣，在0-5℃下放置24小时，10-脱乙酰基巴卡亭III沉淀析出，过滤，洗涤沉淀，干燥后得到纯度85-90％的10-脱乙酰基巴卡亭III产品，产品在二氯甲烷/石油醚中重结晶得到纯度99％的10-脱乙酰基巴卡亭III。

2、将上步得到的乙腈滤液中加入多孔高分子填料，在回转蒸发器中减压蒸发除去乙腈后得到固相上样物料，将此固相上样物料置于填充有多孔高分子填料固定相的反相色谱柱的床层顶端，用不同浓度的甲醇水溶液进行洗脱，三尖杉宁碱，紫杉醇顺次序馏出，分别收集三尖杉宁碱和紫杉醇馏分，加水稀释后在0-5℃下放置一天，三尖杉宁碱和紫杉醇分别沉淀出，过滤得到两者的粗产品，分别再用上述反相色谱法进行分离，沉淀和干燥，得到三尖杉宁碱纯品(纯度99％)和紫杉醇纯品(根据原料不同，纯度在95-98％范围)。

3、将紫杉醇纯品溶于二氯甲烷中，注入一以硅胶做固定相的正相色谱柱内，用环己烷/乙酸乙酯(7∶3V/V)进行洗脱，收集紫杉醇馏分，减压蒸出溶剂后，将残渣在甲醇/水中重结晶，得到高纯紫杉醇，在冻干机内干燥后，其纯度达99.6％。

本发明可以用各种紫杉植物的树叶、树皮或树枝部分的醇提取物来联合生产高纯度紫杉醇，10-脱乙酰基巴卡亭III和三尖杉宁碱。

本发明的特征在于用乙酸丁酯(或乙酸乙酯)，溶解紫杉树叶、树皮或树枝的醇提取物，然后用碳酸氢钠(或碳酸钠)水溶液反萃取除去色素等酸性杂质后，蒸发除去溶剂，用乙腈溶解残渣，冷冻结晶得到10-脱乙酰基巴卡亭III。

本发明的特征在于从沉淀了10-脱乙酰基巴卡亭III的母液作原料，用以高分子填料为固定相的反相色谱法分离和纯化获得三尖杉宁碱和紫杉醇。

本发明的特征在于所述及的反相色谱法运作中，采用冷冻结晶法分离洗脱液中有效成分，再结合以国产硅胶为固定相的正相色谱法深度纯化紫杉醇产品，获得99.6％以上纯度的紫杉醇。

具体实施方式

以下实施例详述本发明

取30Kg云南红豆杉干树叶，粉碎后用300L甲醇在室温下搅拌浸提8小时，离心过滤，用100L甲醇洗涤滤渣，合并滤液，在40℃下，减压蒸出溶剂。用20升乙酸乙酯溶解残留物，加1Kg硅藻土，搅拌后过滤。将滤液与20L 5％NaHCO₃水溶液一起放入一搅拌槽中进行搅拌萃取，分层后弃去水相，再加入20L 5％NaHCO₃水溶液，搅拌萃取后弃去水相，用水洗涤有机相，至水相呈中性，分出有机相，往其中加入无水硫酸钠干燥过夜，在40℃下减压蒸发有机溶剂，得到210克固体残渣，用1.5L乙腈将渣溶解，溶液在0-5℃下放置24小时，10-脱乙酰基巴卡亭III沉淀析出，沉淀再在二氯甲烷/己烷混合液中重结晶得到6.8克纯度为99.0％白色粉末状10-脱乙酰基巴卡亭III。

过滤后得到的乙腈母液，加入300克A05型聚苯乙烯-二乙烯基苯高分子固定相(粒径50-70微米，比表面积400m²/g，平均孔径150A°，发明者研制，参见Liu kailu et al，J.Liquid Chrom.16(14)3083-3092(1993))，减压蒸发除去溶剂，得到负载有浸出物的高分子固定相，将此负载浸出物高分子固定相加至一反相色谱柱的床层顶端，此不锈钢色谱柱直径Ф80mm，色谱床层高1500mm，色谱固定相为A05型聚苯乙烯-二乙烯基苯高分子固定相，按顺序用50％，60％，70％(V/V)甲醇-水溶液来洗脱色谱柱，有色杂质，叶绿素，10-deacetyl-7-Epi-baccatin III，10-deacetyl taxol，三尖杉宁碱和紫杉醇顺次馏出，分别进行收集。收集的富三尖杉宁碱馏分，加入等体积的水，在0-5℃下放置24小时，有结晶析出，过滤得到三尖杉宁碱粗品2.7g，含量85％。将此粗品溶于70％甲醇中，注入一直径Ф40mm，长1000mm的不锈钢反相色谱柱内，色谱固定相为A05型高分子固定相(30-40微米粒径)用70％醇/水溶液进行洗脱，将含有有效成分的馏分加水后，冷冻结晶，得到纯度为99％三尖宁碱产品2.1g。

将富紫杉醇馏分加入等体积水，在-5℃下放置24小时，过滤沉淀，得紫杉醇2.8克，用70％甲醇溶解此产品，注入上述Ф40mm，长100mm色谱柱中，用70％甲醇/水溶液进行洗脱，馏出的富紫杉醇馏分，加水稀释，在-5℃下冷冻结晶，干燥后得紫杉醇2.1克，纯度为98.0％。

将上述产品用二氯甲烷溶解，注入一直径Ф40mm，长50mm的不锈钢色谱柱中，固定相为青岛海洋化工厂生产色谱级硅胶，粒径30-40微米，用7∶3(V/V)的环己烷/乙酸乙酯洗脱，得到的紫杉醇馏分在减压下蒸发至干，残余物用少许甲醇溶解，加入水进行重结晶，得到白色絮状晶体，经真空冻干得产品1.8克，纯度为99.6％。

实例2

按实例1所述方法，用300L95％7醇在室温下浸提30Kg粉碎后的云南红豆杉树皮，过滤，用100L95％乙醇洗滤渣，合并滤液，在40℃下减压蒸发除去溶剂，得4.85Kg的醇提取物。按实例1所述方法，得到5.6克纯度99％10-脱乙酰基巴卡亭III，三尖杉宁碱6.2克，纯度为98.1％，紫杉醇6.8克，纯度为99.7％。

Claims (2)

1、一种从紫杉植物的叶、树皮或树枝的醇提取物中联合生产高纯紫杉醇、10-脱乙酰基巴卡亭III和三尖杉宁碱的方法，其特征是用乙酸丁酯或乙酸乙酯来溶解此醇提取物，得到的乙酸丁酯或乙酸乙酯溶液经碳酸氢钠或碳酸钠水溶液反萃取去除杂质后，有机相蒸发除去溶剂，用乙腈溶解残渣，冷冻结晶得到10-脱乙酰基巴卡亭III，以结晶母液作原料，用以高分子填料为固定相的反相色谱法分离和纯化获得三尖杉宁碱和紫杉醇。

2、权利要求1的方法，其特征是在所述及的反相色谱法中，采用冷冻结晶法分离洗脱液中有效成分，再结合以国产硅胶为固定相的正相色谱法深度纯化紫杉醇产品，获得纯度达99.6％以上紫杉醇。