CN117288938A - 一种基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents
一种基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条及其制备方法和应用，属于临床即时检测技术领域。本发明将荧光侧流免疫层析测法与荧光比率技术相结合，利用两种复合纳米结构所发出的荧光与金纳米粒子的内滤效应相混合而产生的荧光信号的比值变化，通过便携式终端设备实现了灵敏度较高的可视化读取和结果判定，使得检测更简便，更快捷，误差性更小，同时，避免了操作人员主观因素的影响，使得结果定量化，用于准确的结果检测。
Description
技术领域
本发明涉及临床即时检测技术领域，尤其涉及一种基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
临床即时检测(POCT)是医疗诊断领域未来发展的重点趋势，对于疾病的诊断有着快速，准确的判断作用。目前为止，侧流免疫层析测定法(LFIA)是目前最先进的POCT平台，这是一种基于夹心分析技术开发的一种应用，市场上的LFIA主要使用金纳米颗粒和荧光基团相互作用来实现结果的判定，具有快速、低成本、便携和简单等优点。但是LFIA在定量分析以及灵敏度等问题上有着很大的局限性。
荧光侧流免疫层析测定法(FLFIA)，通过用高发光分子发射器或量子点掺杂进入微球可以显著放大光信号提高灵敏度，解决了LFIA的灵敏度低的问题。然而，FLFIA的结果判定是基于操作人员肉眼根据颜色强度变化进行的，对于未经训练的检查者或病人很难在低浓度下用弱彩色测试线定性或半定量地区分目标，即便是通过仪器产生的判定报告，也会因为其他无关参数的影响，使得检测结果不准确。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条及其制备方法和应用。本发明制得的试纸条基于荧光颜色差异的侧流层析检测，检测结果准确。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
提供树枝状二氧化硅纳米球的分散液和油胺封端的金纳米粒子的分散液；
将所述树枝状二氧化硅纳米球的分散液、氨水和三甲氧基甲硅烷混合进行硫醇化，得到硫醇化的dSiO2；
将所述硫醇化的dSiO2、油胺封端的金纳米粒子的分散液混合，得到dSiO2/AuNPs；
将所述dSiO2/AuNPs分散在正辛基三甲氧基硅烷中，得到dSiO2/AuNPs分散液；
将所述dSiO2/AuNPs分散液、甲醇和氨水混合后进行第一固液分离，得到固体颗粒，将所述固体颗粒用甲醇洗涤后分散在水和氨水进行沉积反应，将所得沉积产物第二固液分离，将所得颗粒分散在乙醇、水和氨水的混合物中，向其中注入原硅酸四乙酯进行二氧化硅壳的生长，通过第三固液分离，得到dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球；
将所述dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球的分散液、氨水和三甲氧基甲硅烷混合进行硫醇化，得到硫醇化的dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球；
将所述硫醇化的dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球与红色荧光碳量子点的分散液混合，得到dSiO2/AuNPs/SiO2/rQDs；
将所述dSiO2/AuNPs/SiO2/rQDs的正辛基三甲氧基硅烷分散液、甲醇和氨水混合后进行第四固液分离，得到固体颗粒，将所述固体颗粒用甲醇洗涤后分散在水和氨水进行沉积反应，将所得沉积产物第五固液分离，将所得颗粒分散在乙醇、水和氨水的混合物中，向其中注入原硅酸四乙酯进行二氧化硅壳的生长，通过第六固液分离，得到SAQ；
将所述SAQ的分散液、氨水和三乙氧基硅烷混合进行胺化反应，得到胺化SAQ球；
将所述胺化SAQ球分散在含丁二酸酐的N,N-二甲基甲酰胺中进行羧化反应，得到羧基化SAQ球；
将疏水绿色荧光量子点、2,5-呋喃二酮、1-十八烯的聚合物、氨基乙醇和氯仿混合进行羧基化反应，得到亲水性羧基化gQDs；
将所述羧基化SAQ球与抗体进行酰胺化偶联反应，得到SAQ-mAb1共轭物；
将所述亲水性羧基化gQDs与抗体进行酰胺化偶联反应，得到mAb2-gQD；
利用所述SAQ-mAb1共轭物和mAb2-gQD制备试纸条，得到所述基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条。
优选地，所述树枝状二氧化硅纳米球的分散液中的树枝状二氧化硅纳米球、氨水和三甲氧基甲硅烷的用量比为4.5mg:2.5mL:1mL，所述氨水的质量分数为25％。
优选地，所述硫醇化的dSiO2与油胺封端的金纳米粒子的质量比为4.5:179。
优选地，所述dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球的分散液、氨水和三甲氧基甲硅烷混合进行硫醇化时，所述dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球、氨水和三甲氧基甲硅烷的用量比为40mg:0.5mL:0.1mL，所述氨水的质量分数为25％。
优选地，所述dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球与红色荧光碳量子点的质量比为4:1。
优选地，所述胺化反应的时间为12h。
优选地，所述制备试纸条包括以下步骤：
将所述SAQ-mAb1的分散液涂覆在共轭垫上，将所述mAb2-gQD和山羊抗小鼠IgG涂覆在硝化纤维素膜上作为测试线和对照线，然后将所述共轭垫和硝化纤维素膜干燥后，将样品垫、干燥后共轭垫、干燥后硝化纤维素膜和吸收垫组装到聚苯乙烯底板上，得到所述试纸条。
优选地，所述SAQ-mAb1的分散液的浓度为0.4wt％，涂覆量为5μL·cm-1，所述mAb2-gQD和山羊抗小鼠IgG的浓度均为1mg·cm-1，涂覆量均为1.0μL·cm-1。
本发明还提供了上述技术方案所述制备方法制得的基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条。
本发明还提供了上述技术方案所述的基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条的应用，包括以下步骤：
将待测样品加载到所述基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条的样品垫上，智能手机用500nm长通滤光片在365nm光线照射下记录结果，所述智能手机的相机设定包括：曝光时间:0.25s；ISO速度:ISO-200；曝光偏置：0阶；色温:5000K；孔径:F-2.2；计量方式：部分计量；闪光模式：不闪光；焦距：17毫米；对焦模式：AF-C。
本发明提供了一种基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：提供树枝状二氧化硅纳米球的分散液和油胺封端的金纳米粒子的分散液；将所述树枝状二氧化硅纳米球的分散液、氨水和三甲氧基甲硅烷混合进行硫醇化，得到硫醇化的dSiO2；将所述硫醇化的dSiO2、油胺封端的金纳米粒子的分散液混合，得到dSiO2/AuNPs；将所述dSiO2/AuNPs分散在正辛基三甲氧基硅烷中，得到dSiO2/AuNPs分散液；将所述dSiO2/AuNPs分散液、甲醇和氨水混合后进行第一固液分离，得到固体颗粒，将所述固体颗粒用甲醇洗涤后分散在水和氨水进行沉积反应，将所得沉积产物第二固液分离，将所得颗粒分散在乙醇、水和氨水的混合物中，向其中注入原硅酸四乙酯进行二氧化硅壳的生长，通过第三固液分离，得到dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球；将所述dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球的分散液、氨水和三甲氧基甲硅烷混合进行硫醇化，得到硫醇化的dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球；将所述硫醇化的dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球与红色荧光碳量子点的分散液混合，得到dSiO2/AuNPs/SiO2/rQDs；将所述dSiO2/AuNPs/SiO2/rQDs的正辛基三甲氧基硅烷分散液、甲醇和氨水混合后进行第四固液分离，得到固体颗粒，将所述固体颗粒用甲醇洗涤后分散在水和氨水进行沉积反应，将所得沉积产物第五固液分离，将所得颗粒分散在乙醇、水和氨水的混合物中，向其中注入原硅酸四乙酯进行二氧化硅壳的生长，通过第六固液分离，得到SAQ；将所述SAQ的分散液、氨水和三乙氧基硅烷混合进行胺化反应，得到胺化SAQ球；将所述胺化SAQ球分散在含丁二酸酐的N,N-二甲基甲酰胺中进行羧化反应，得到羧基化SAQ球；将疏水绿色荧光量子点、2,5-呋喃二酮、1-十八烯的聚合物、氨基乙醇和氯仿混合进行羧基化反应，得到亲水性羧基化gQDs；将所述羧基化SAQ球与抗体进行酰胺化偶联反应，得到SAQ-mAb1共轭物；将所述亲水性羧基化gQDs与抗体进行酰胺化偶联反应，得到mAb2-gQD；利用所述SAQ-mAb1共轭物和mAb2-gQD制备试纸条，得到所述基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条。
本发明将荧光侧流免疫层析测法与荧光比率技术相结合，利用两种复合纳米结构所发出的荧光与金纳米粒子的内滤效应相混合而产生的荧光信号的比值变化，通过便携式终端设备实现了灵敏度较高的可视化读取和结果判定，使得检测更简便，更快捷，误差性更小，同时，避免了操作人员主观因素的影响，使得结果定量化，用于准确的结果检测。
附图说明
图1为SAQ纳米球的制备示意图；
图2为SAQ羧基化的制备示意图；
图3为不同阶段的透射电镜图，其中A和C为不同放大倍率下dSiO2透射电镜图；B为dSiO2/AuNPs透射电镜图；D为dSiO2/AuNPs/SiO2透射电镜图；E为金纳米粒子透射电镜图；F为dSiO2/AuNPs/SiO2/rQDs透射电镜图；G为rQDs透射电镜图；H为SQA透射电镜图；
图4为SAQ高角度环形暗场扫描TEM图以及SAQ中不同金属元素在EDS中映射图，其中A为SAQ高角度环形暗场扫描TEM图，B～H为不同金属元素在EDS中映射图；
图5为羧基化gQDs的制备示意图；
图6为样品检测流程示意图；
图7为不同浓度样品检测颜色变化对比示意图，A为本发明制得的荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条，B为市场中胶体金试纸；
图8为本发明与市场中试纸条对不同浓度样品检测色度变化。
具体实施方式
本发明提供了一种基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
提供树枝状二氧化硅纳米球的分散液和油胺封端的金纳米粒子的分散液；
将所述树枝状二氧化硅纳米球的分散液、氨水和三甲氧基甲硅烷混合进行硫醇化，得到硫醇化的dSiO2；
将所述硫醇化的dSiO2、油胺封端的金纳米粒子的分散液混合，得到dSiO2/AuNPs；
将所述dSiO2/AuNPs分散在正辛基三甲氧基硅烷中，得到dSiO2/AuNPs分散液；
将所述dSiO2/AuNPs分散液、甲醇和氨水混合后进行第一固液分离，得到固体颗粒，将所述固体颗粒用甲醇洗涤后分散在水和氨水进行沉积反应，将所得沉积产物第二固液分离，将所得颗粒分散在乙醇、水和氨水的混合物中，向其中注入原硅酸四乙酯进行二氧化硅壳的生长，通过第三固液分离，得到dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球；
将所述dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球的分散液、氨水和三甲氧基甲硅烷混合进行硫醇化，得到硫醇化的dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球；
将所述硫醇化的dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球与红色荧光碳量子点的分散液混合，得到dSiO2/AuNPs/SiO2/rQDs；
将所述dSiO2/AuNPs/SiO2/rQDs的正辛基三甲氧基硅烷分散液、甲醇和氨水混合后进行第四固液分离，得到固体颗粒，将所述固体颗粒用甲醇洗涤后分散在水和氨水进行沉积反应，将所得沉积产物第五固液分离，将所得颗粒分散在乙醇、水和氨水的混合物中，向其中注入原硅酸四乙酯进行二氧化硅壳的生长，通过第六固液分离，得到SAQ；
将所述SAQ的分散液、氨水和三乙氧基硅烷混合进行胺化反应，得到胺化SAQ球；
将所述胺化SAQ球分散在含丁二酸酐的N,N-二甲基甲酰胺中进行羧化反应，得到羧基化SAQ球；
将疏水绿色荧光量子点、2,5-呋喃二酮、1-十八烯的聚合物、氨基乙醇和氯仿混合进行羧基化反应，得到亲水性羧基化gQDs；
将所述羧基化SAQ球与抗体进行酰胺化偶联反应，得到SAQ-mAb1共轭物；
将所述亲水性羧基化gQDs与抗体进行酰胺化偶联反应，得到mAb2-gQD；
利用所述SAQ-mAb1共轭物和mAb2-gQD制备试纸条，得到所述基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条。
本发明提供树枝状二氧化硅纳米球(dSiO2)的分散液。
在本发明中，所述树枝状二氧化硅纳米球优选由包括以下步骤的方法制得：
将68mg的三乙基铵醋酸盐添加到25mL的水中，并将反应在80℃下搅拌30分钟。然后加入380mg十六烷基三甲基溴化铵和218mg水杨酸钠，并继续反应1小时。加入4mL原硅酸四乙酯后，将上述溶液在80℃下轻轻搅拌3小时。通过离心收集由此产生的SiO2，用乙醇洗涤3次，再分散在由50mL盐酸和50mL甲醇组成的混合物中，以在60℃下搅拌6小时提取过量的表面活性剂，再次重复提取，最后将所得dSiO2分散在200mL乙醇中备用。
本发明提供油胺封端的金纳米粒子(AuNPs)的分散液。
在本发明中，所述油胺封端的金纳米粒子优选由包括以下步骤的方法制得：
将HAuCl4·3H2O(788μL，250mg·mL-1)的乙醇溶液添加到50mL三颈烧瓶中，将其保持在真空下以蒸发乙醇，然后将由25mL甲苯和2.5mL油胺组成的混合物在剧烈搅拌和氩气保护下于100℃预热6小时，加入到烧瓶中，冷却至室温后，加入等体积的乙醇，通过离心收集由此产生的AuNPs，将其重新分散在10mL氯仿中，并在4℃下保存以供使用。
得到树枝状二氧化硅纳米球后，本发明将所述树枝状二氧化硅纳米球的分散液、氨水和三甲氧基甲硅烷混合进行硫醇化，得到硫醇化的dSiO2。
本发明优选向含有dSiO2的乙醇溶液中加入2.5mL的氨和1mL的三甲氧基甲硅烷(MPTMS)，在室温下剧烈搅拌12小时后，通过离心收集硫醇化的dSiO2，用乙醇洗涤3次，并重新分散在50mL乙醇中。
得到油胺封端的金纳米粒子和硫醇化的dSiO2后，本发明将所述硫醇化的dSiO2、油胺封端的金纳米粒子的分散液混合，得到dSiO2/AuNPs。
本发明优选将1mL含有油胺封端的AuNPs的氯仿溶液添加到4.5mg硫醇化的dSiO2沉淀中，并将所得混合物超声处理8分钟以获得澄清溶液，在此过程中，由于Au-S键形成，AuNPs被捕获在dSiO2的孔中，最后通过以10000rpm离心5分钟回收dSiO2/AuNPs，并用氯仿洗涤以除去过量的AuNPs。
得到dSiO2/AuNPs后，本发明将所述dSiO2/AuNPs分散在正辛基三甲氧基硅烷中，得到dSiO2/AuNPs分散液。
本发明优选将所述dSiO2/AuNPs在超声处理下溶解在150μL的正辛基三甲氧基硅烷(OTMS)中。
得到dSiO2/AuNPs分散液后，本发明将所述dSiO2/AuNPs分散液、甲醇和氨水混合后进行第一固液分离，得到固体颗粒，将所述固体颗粒用甲醇洗涤后分散在水和氨水进行沉积反应，将所得沉积产物第二固液分离，将所得颗粒分散在乙醇、水和氨水的混合物中，向其中注入原硅酸四乙酯进行二氧化硅壳的生长，通过第三固液分离，得到dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球；
本发明优选向所述dSiO2/AuNPs分散液中加入7.5mL甲醇和187.5μL氨水，将所得混合物进一步超声处理30分钟，10000rpm离心收集固体颗粒，并用甲醇洗涤以除去过量的OTMS，在搅拌下将其重新分散在16.5mL水和444μL氨水中18小时以沉积薄的二氧化硅层，第二次离心后，将颗粒重新分散在10mL乙醇、2.5mL水和312.5μL氨水的混合物中，每1小时向其中注入12.5μL原硅酸四乙酯生长(TEOS)二氧化硅壳，10小时后，离心获得dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球，并用乙醇洗涤三次，最后，将获得的dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球重新分散在乙醇中使用。
得到dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球后，本发明将所述dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球的分散液、氨水和三甲氧基甲硅烷混合进行硫醇化，得到硫醇化的dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球。
本发明优选将100μL的MPTMS和500μL的氨水加入到20mL含有dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球(2mg·mL-1)的乙醇溶液中，并将所得混合物剧烈搅拌12小时以制备硫醇化的dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球，离心收集，用乙醇洗涤三次。
得到硫醇化的dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球后，本发明将所述硫醇化的dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球与红色荧光碳量子点的分散液混合，得到dSiO2/AuNPs/SiO2/rQDs。
本发明优选将所述硫醇化的dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球在超声下与1.0mL含rQDs氯仿溶液(10mg·mL-1)的溶液混合5分钟，以得到澄清溶液，以10000rpm离心5分钟回收dSiO2/AuNPs/SiO2/QDs纳米球，并用氯仿洗涤一次以除去过量的rQDs。
得到dSiO2/AuNPs/SiO2/rQDs后，本发明将所述dSiO2/AuNPs/SiO2/rQDs的正辛基三甲氧基硅烷分散液、甲醇和氨水混合后进行第四固液分离，得到固体颗粒，将所述固体颗粒用甲醇洗涤后分散在水和氨水进行沉积反应，将所得沉积产物第五固液分离，将所得颗粒分散在乙醇、水和氨水的混合物中，向其中注入原硅酸四乙酯进行二氧化硅壳的生长，通过第六固液分离，得到SAQ。
本发明优选将所述dSiO2/AuNPs/SiO2/QDs纳米球在超声处理下溶解在200μL OTMS中，随后在超声处理下将其与15mL甲醇和375μL氨水混合30分钟，以10000rpm离心收集固体颗粒，并用甲醇洗涤以除去过量的OTMS，在搅拌下重新分散在444mL水和66μL氨水中18小时以沉积薄的二氧化硅层，离心后，将纳米球重新分散在20mL乙醇、5mL水和625μL氨水的混合物中，每1小时注入25μL TEOS生长二氧化硅壳，3小时后，通过离心获得SAQ，并用乙醇洗涤3次。
图1为SAQ纳米球的制备示意图。
得到SAQ后，本发明将所述SAQ的分散液、氨水和三乙氧基硅烷混合进行胺化反应，得到胺化SAQ球。
本发明优选将所述SAQ重新分散在40mL乙醇、1mL氨水和40μL三乙氧基硅烷(APTES)的混合物中，所得混合物在室温下搅拌12小时，得到所述胺化SAQ球。
得到胺化SAQ球后，本发明将所述胺化SAQ球分散在含丁二酸酐的N,N-二甲基甲酰胺中进行羧化反应，得到羧基化SAQ球。
本发明优选将所述胺化SAQ球用乙醇洗涤后，再分散在20mL含0.1M丁二酸酐的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将所得混合物搅拌24小时以制备羧基化SAQ球，最后用离心法分离球体，并将其溶解在超纯水中备用。
图2为SAQ羧基化的制备示意图。
本发明将疏水绿色荧光量子点、2,5-呋喃二酮、1-十八烯的聚合物、氨基乙醇和氯仿混合进行羧基化反应，得到亲水性羧基化gQDs。
本发明优选将5mg疏水绿色荧光量子点(疏水gQDs)和75mg 2,5-呋喃二酮与1-十八烯的聚合物(PMAO)在微型离心管中与氯仿混合，并在室温下翻滚过夜，然后，将混合物转移到玻璃瓶中，向其中加入2mL含100μL的氨基乙醇，将两相混合物在室温下进一步翻滚1小时，随后用真空蒸发法除去氯仿，在水溶液中加入2mL氯仿提取过量的PMAO，去除氯仿后，将剩下的水相在4200转/分下离心5分钟，以分离任何剩余的氯仿和聚集体，将亲水性羧基化gQDs通过孔径为0.22μm的过滤器后收集，以去除任何残余聚集体。
图5为羧基化gQDs制备示意图。
得到羧基化SAQ球后，将所述羧基化SAQ球与抗体进行酰胺化偶联反应，得到SAQ-mAb1共轭物。
本发明优选将2mg羧基化SAQ纳米球、2mg EDC和2mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶解在1mL磷酸盐缓冲液(0.01M,pH＝6.0)中，混合物在室温下在摇床上孵育30分钟，然后，通过离心分离表面活化的球，并将其重新悬浮在1mL磷酸盐缓冲液(0.01M,pH＝7.4)中，并向其中添加100μg mAb1，将抗FABP 10E1抗体标记在SAQ球表面，反应时间为2.5h，随后，向混合物中加入100μL含10％W/V牛血清白蛋白(BSA)的封闭液，再进行2小时的封闭反应，最后，以10000转/分离心3分钟，用磷酸盐缓冲液(0.01M,pH＝7.4)洗涤两次，将获得的SAQ-mAb1偶联物在0.5mL、0.02M磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中重新包裹，其中含有2.5％W/V牛血清白蛋白(BSA)、1％W/V蔗糖和0.1％V/V防腐剂ProClin 300。
得到亲水性羧基化gQDs后，本发明将所述亲水性羧基化gQDs与抗体进行酰胺化偶联反应，得到mAb2-gQD。
本发明优选将含有羧基化gQDs的溶液(1mL，70nM)与50μL 1.0MHEPES缓冲液(pH＝7.1)混合，向其中加入新鲜制备的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，10mg·mL-1,100μL)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS 10mg·mL-1,100μL)水溶液，然后加入50μgmAb2，反应在室温下置于摇床上3小时，反应物进一步用1％W/V牛血清白蛋白(BSA)封闭2小时，mAb2-gQD结合物经离心滤器(50kD)在3000g下纯化8min，用磷酸盐缓冲液(0.01M,pH＝7.4)洗涤3次。
得到SAQ-mAb1共轭物和mAb2-gQD后，本发明利用所述SAQ-mAb1共轭物和mAb2-gQD制备试纸条，得到所述基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条。
在本发明中，所述制备试纸条优选包括以下步骤：
将所述SAQ-mAb1的分散液涂覆在共轭垫上，将所述mAb2-gQD和山羊抗小鼠IgG涂覆在硝化纤维素膜上作为测试线和对照线，然后将所述共轭垫和硝化纤维素膜干燥后，将样品垫、干燥后共轭垫、干燥后硝化纤维素膜和吸收垫组装到聚苯乙烯底板上，得到所述试纸条。
在本发明中，所述SAQ-mAb1的分散液的浓度优选为0.4wt％，涂覆量优选为5μL·cm-1，所述mAb2-gQD和山羊抗小鼠IgG的浓度均优选为1mg·cm-1，涂覆量均优选为1.0μL·cm-1。
在本发明中，使用的氨水的质量浓度均优选为25％。
本发明还提供了上述技术方案所述制备方法制得的基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条。
本发明还提供了上述技术方案所述的基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条的应用，包括以下步骤：
将待测样品加载到所述基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条的样品垫上，智能手机用500nm长通滤光片在365nm光线照射下记录结果，所述智能手机的相机设定包括：曝光时间:0.25s；ISO速度:ISO-200；曝光偏置：0阶；色温:5000K；孔径:F-2.2；计量方式：部分计量；闪光模式：不闪光；焦距：17毫米；对焦模式：AF-C。
在本发明中，所述智能手机配合选色器，可以轻松获取检测线线的色调值和RGB数据，优选用生成的R/G值来标定样品的浓度。
在本发明中，所述待测样品中优选含有心脏型脂肪酸结合蛋白。
为了进一步说明本发明，下面结合实例对本发明提供的基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中使用的氨水的质量浓度均为25％。
实施例1
1.量子点纳米颗粒制备
1.1树枝状二氧化硅纳米球(dSiO2)
首先，将68mg的三乙基铵醋酸盐添加到25mL的水中，并将反应在80℃下搅拌30分钟。然后加入380mg十六烷基三甲基溴化铵和218mg水杨酸钠，并继续反应1小时。加入4mL原硅酸四乙酯后，将上述溶液在80℃下轻轻搅拌3小时。通过离心收集由此产生的dSiO2，用乙醇洗涤3次，再分散在由50mL盐酸和50mL甲醇组成的混合物中，以在60℃下搅拌6小时提取过量的表面活性剂。再次重复提取。最后将dSiO2分散在200mL乙醇中。
1.1油胺封端的金纳米粒子(AuNPs)制备
首先，将HAuCl4·3H2O(788μL，250mg·mL-1)的乙醇溶液添加到50mL三颈烧瓶中，将其保持在真空下以蒸发乙醇。然后将由25mL甲苯和2.5mL油胺组成的混合物在剧烈搅拌和氩气保护下于100℃预热6小时，加入到烧瓶中。冷却至室温后，加入等体积的乙醇。通过离心收集由此产生的AuNPs，将其重新分散在10mL氯仿中，并在4℃下保存以供使用。
1.2二氧化硅纳米颗粒中嵌入AuNPs和红光量子点(rQDs)[SAQ]
1.2.1dSiO2/AuNPs制备
首先，向含有dSiO2的乙醇溶液中(其中含有树枝状二氧化硅纳米球4.5mg)加入2.5mL的氨水和1mL的三甲氧基甲硅烷(MPTMS)，以制备硫醇化的dSiO2。在室温下剧烈搅拌12小时后，通过离心收集硫醇化的dSiO2，用乙醇洗涤3次，并重新分散在50mL乙醇中。随后，将1mL含有油胺封端的AuNPs的氯仿溶液(其中油胺封端的金纳米粒子的质量为179mg)添加到4.5mg硫醇化的dSiO2沉淀中，并将所得混合物超声处理8分钟以获得澄清溶液，最后通过以10000rpm离心5分钟回收dSiO2/AuNPs，并用氯仿洗涤以除去过量的AuNPs。
1.2.2二氧化硅涂层dSiO2/AuNPs(dSiO2/AuNPs/SiO2)
dSiO2/AuNPs在超声处理下溶解在150μL的正辛基三甲氧基硅烷(OTMS)中，向其中加入7.5mL甲醇和187.5μL氨水。将所得混合物进一步超声处理30分钟。通过以10000rpm离心收集固体颗粒，并用甲醇洗涤以除去过量的OTMS，在搅拌下将其重新分散在16.5mL水和444μL氨水中18小时以沉积薄的二氧化硅层。第二次离心后，将颗粒重新分散在10mL乙醇、2.5mL水和312.5μL氨水的混合物中，每1小时向其中注入12.5μL原硅酸四乙酯生长(TEOS)二氧化硅壳。10小时后，通过离心获得dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球，并用乙醇洗涤三次。最后，将获得的dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球重新分散在乙醇中使用。
1.2.3dSiO2/AuNPs/SiO2/rQDs制备
将100μL的MPTMS和500μL的氨水加入到20mL含有dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球(2mg·mL-1)的乙醇溶液中，并将所得混合物剧烈搅拌12小时以制备硫醇化的dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球。离心收集，用乙醇洗涤三次，然后在超声下与1.0mL含rQDs氯仿溶液(10mg·mL-1)的溶液混合5分钟，以得到澄清溶液。通过以10000rpm离心5分钟回收dSiO2/AuNPs/SiO2/QDs纳米球，并用氯仿洗涤一次以除去过量的rQDs。
1.2.4二氧化硅纳米颗粒中嵌入AuNPs和rQDs
将dSiO2/AuNPs/SiO2/QDs纳米球在超声处理下溶解在200μL OTMS中，随后在超声处理下将其与15mL甲醇和375μL氨水混合30分钟。通过以10000rpm离心收集固体颗粒，并用甲醇洗涤以除去过量的OTMS，在搅拌下重新分散在444mL水和66μL氨水中18小时以沉积薄的二氧化硅层，离心后，将纳米球重新分散在20mL乙醇、5mL水和625μL氨水的混合物中，每1小时注入25μL TEOS生长二氧化硅壳，3小时后，通过离心获得SAQ，并用乙醇洗涤3次。
1.3羧基化SAQ
将SAQ纳米球重新分散在40mL乙醇、1mL氨水和40μL三乙氧基硅烷(APTES)的混合物中，所得混合物在室温下搅拌12小时，制备胺化SAQ球。然后离心，用乙醇洗涤，再分散在20mL含0.1M丁二酸酐的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中。将所得混合物搅拌24小时以制备羧基化SAQ球，最后用离心法分离球体，并将其溶解在超纯水中使用。
图3为不同阶段的透射电镜图，其中A和C为不同放大倍率下dSiO2透射电镜图；B为dSiO2/AuNPs透射电镜图；D为dSiO2/AuNPs/SiO2透射电镜图；E为金纳米粒子透射电镜图；F为dSiO2/AuNPs/SiO2/rQDs透射电镜图；G为rQDs透射电镜图；H为SQA透射电镜图。
图4为SAQ高角度环形暗场扫描TEM图以及SAQ中不同金属元素在EDS中映射图，其中A为SAQ高角度环形暗场扫描TEM图，B～H为不同金属元素在EDS中映射图。
1.4羧基化绿光量子点(gQDs)
通常，5mg疏水gQDs和75mg 2,5-呋喃二酮与1-十八烯的聚合物(PMAO)在微型离心管中与氯仿混合，并在室温下翻滚过夜，然后，将混合物转移到玻璃瓶中，向其中加入2mL含100μL的氨基乙醇，将两相混合物在室温下进一步翻滚1小时，随后用真空蒸发法除去氯仿。在水溶液中加入2mL氯仿提取过量的PMAO，去除氯仿后，将剩下的水相在4200转/分下离心5分钟，以分离任何剩余的氯仿和聚集体，亲水性羧基化gQDs通过孔径为0.22μm的过滤器后收集，以去除任何残余聚集体。
2.纳米颗粒与抗体结合
2.1酰胺化偶联反应合成SAQ-mAb1共轭物
抗FABP 10E1抗体(mAb1)购自公司，将2mg羧基化SAQ纳米球、2mg EDC和2mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶解在1mL磷酸盐缓冲液(0.01M,pH＝6.0)中，混合物在室温下在摇床上孵育30分钟，然后，通过离心分离表面活化的球，并将其重新悬浮在1mL磷酸盐缓冲液(0.01M,pH＝7.4)中，并向其中添加100μg mAb1，将抗FABP 10E1抗体标记在SAQ球表面，反应时间为2.5h。随后，向混合物中加入100μL含10％W/V牛血清白蛋白(BSA)的封闭液，再进行2小时的封闭反应，最后，以10000转/分离心3分钟，用磷酸盐缓冲液(0.01M,pH＝7.4)洗涤两次，将获得的SAQ-mAb1偶联物在0.5mL 0.02M磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中重新包裹，其中含有2.5％W/V牛血清白蛋白(BSA)、1％W/V蔗糖和0.1％V/V防腐剂ProClin 300。对于dSiO2/AuNPs/SiO2-抗体结合物，dSiO2/AuNPs/SiO2的合成过程与SAQ-mAb1相同。
2.2mAb2-gQD制备
将含有羧基化gQDs的溶液(1mL，～70nM)与50μL、1.0M HEPES缓冲液(pH＝7.1)混合，向其中加入新鲜制备的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，10mg·mL-1,100μL)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS 10mg·mL-1,100μL)水溶液，然后加入50μg mAb2。反应在室温下置于摇床上3小时。反应物进一步用1％W/V牛血清白蛋白(BSA)封闭2小时。mAb2-gQD结合物经离心滤器(50kD)在3000g下纯化8min，用磷酸盐缓冲液(0.01M,pH＝7.4)洗涤3次。
3.试纸条制备
用0.02M磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)处理，溶液中含有1％W/V牛血清白蛋白(BSA)、2.5％W/V蔗糖、1％V/V吐温20和0.1％V/V防腐剂ProClin 300,然后在37℃下干燥，随后，以5μL·cm-1的速率将SAQ-mAb1分散体(0.4wt％)均匀地喷洒在共轭垫上。将mAb2-gQD和山羊抗小鼠IgG(1mg·mL-1)分别以1.0μL·cm-1的速率喷洒在硝化纤维素膜上作为测试线和对照线。然后将共轭垫和硝化纤维素膜在37℃下干燥过夜。最后，将样品垫、共轭垫、硝化纤维素膜和吸收垫组装到重叠度为2mm的聚苯乙烯底板上。卡片被切成3.8毫米宽的条，记为荧光颜色差异的新型胶体金试纸，在室温下储存在干燥器中。
4.样品检测对比试验
将含有不同浓度心脏型脂肪酸结合蛋白的PBS溶液或血清样品(75μL)加载到条带的样品垫上，用现阶段市场所用胶体金检测试纸做同样操作。10分钟后，智能手机用500纳米长通滤光片在365纳米光线照射下记录结果。相机设定为(1)曝光时间:0.25s；(2)ISO速度:ISO-200；(3)曝光偏置：0阶；(4)色温:5000K；(5)孔径:F-2.2；(6)计量方式：部分计量；(7)闪光模式：不闪光；(8)焦距：17毫米；(9)对焦模式：AF-C。使用的手机配合选色器应用，可以轻松获取检测线线的色调值和RGB数据。用生成的R/G值来标定样品的心脏型脂肪酸结合蛋白浓度。每个样品一式三份。
图6为样品检测流程示意图。
图7为不同浓度样品检测颜色变化对比示意图，A为本发明制得的荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条，B为市场中胶体金试纸。图7中T线的荧光颜色显示出从黄色到橙色的敏感变化。这种颜色变化有利于快速测试。
图8为本发明与市场中试纸条对不同浓度样品检测色度变化，可知，本发明制得的RFLFIA条带测试以更方便的方式产生了快速和灵敏的定量结果。同时，与传统的POCT方法相比，本发明的RFLFIA条带测试可以提供更准确的半定量甚至定量结果。
由上可知，本发明荧光颜色差异的侧流层析检测提供了一种通过两种复合纳米结构所发出的荧光与金纳米粒子的内滤效应相混合而产生的荧光信号的比值变化的方式，通过便携式终端设备实现了灵敏度较高的可视化读取和结果判定，使得检测更简便，更快捷，同时，避免了操作人员主观因素的影响，使得结果定量化，用于准确的病原检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供树枝状二氧化硅纳米球的分散液和油胺封端的金纳米粒子的分散液；
将所述树枝状二氧化硅纳米球的分散液、氨水和三甲氧基甲硅烷混合进行硫醇化，得到硫醇化的dSiO2；
将所述硫醇化的dSiO2、油胺封端的金纳米粒子的分散液混合，得到dSiO2/AuNPs；
将所述dSiO2/AuNPs分散在正辛基三甲氧基硅烷中，得到dSiO2/AuNPs分散液；
将所述dSiO2/AuNPs分散液、甲醇和氨水混合后进行第一固液分离，得到固体颗粒，将所述固体颗粒用甲醇洗涤后分散在水和氨水进行沉积反应，将所得沉积产物第二固液分离，将所得颗粒分散在乙醇、水和氨水的混合物中，向其中注入原硅酸四乙酯进行二氧化硅壳的生长，通过第三固液分离，得到dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球；
将所述dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球的分散液、氨水和三甲氧基甲硅烷混合进行硫醇化，得到硫醇化的dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球；
将所述硫醇化的dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球与红色荧光碳量子点的分散液混合，得到dSiO2/AuNPs/SiO2/rQDs；
将所述dSiO2/AuNPs/SiO2/rQDs的正辛基三甲氧基硅烷分散液、甲醇和氨水混合后进行第四固液分离，得到固体颗粒，将所述固体颗粒用甲醇洗涤后分散在水和氨水进行沉积反应，将所得沉积产物第五固液分离，将所得颗粒分散在乙醇、水和氨水的混合物中，向其中注入原硅酸四乙酯进行二氧化硅壳的生长，通过第六固液分离，得到SAQ；
将所述SAQ的分散液、氨水和三乙氧基硅烷混合进行胺化反应，得到胺化SAQ球；
将所述胺化SAQ球分散在含丁二酸酐的N,N-二甲基甲酰胺中进行羧化反应，得到羧基化SAQ球；
将疏水绿色荧光量子点、2,5-呋喃二酮、1-十八烯的聚合物、氨基乙醇和氯仿混合进行羧基化反应，得到亲水性羧基化gQDs；
将所述羧基化SAQ球与抗体进行酰胺化偶联反应，得到SAQ-mAb1共轭物；
将所述亲水性羧基化gQDs与抗体进行酰胺化偶联反应，得到mAb2-gQD；
利用所述SAQ-mAb1共轭物和mAb2-gQD制备试纸条，得到所述基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述树枝状二氧化硅纳米球的分散液中的树枝状二氧化硅纳米球、氨水和三甲氧基甲硅烷的用量比为4.5mg:2.5mL:1mL，所述氨水的质量分数为25％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述硫醇化的dSiO2与油胺封端的金纳米粒子的质量比为4.5:179。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球的分散液、氨水和三甲氧基甲硅烷混合进行硫醇化时，所述dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球、氨水和三甲氧基甲硅烷的用量比为40mg:0.5mL:0.1mL，所述氨水的质量分数为25％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述dSiO2/AuNPs/SiO2纳米球与红色荧光碳量子点的质量比为4:1。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胺化反应的时间为12h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备试纸条包括以下步骤：
将所述SAQ-mAb1的分散液涂覆在共轭垫上，将所述mAb2-gQD和山羊抗小鼠IgG涂覆在硝化纤维素膜上作为测试线和对照线，然后将所述共轭垫和硝化纤维素膜干燥后，将样品垫、干燥后共轭垫、干燥后硝化纤维素膜和吸收垫组装到聚苯乙烯底板上，得到所述试纸条。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述SAQ-mAb1的分散液的浓度为0.4wt％，涂覆量为5μL·cm-1，所述mAb2-gQD和山羊抗小鼠IgG的浓度均为1mg·cm-1，涂覆量均为1.0μL·cm-1。
9.权利要求1～8任一项所述制备方法制得的基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条。
10.权利要求9所述的基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条的应用，其特征在于，包括以下步骤：
将待测样品加载到所述基于荧光颜色差异的侧流层析检测试纸条的样品垫上，智能手机用500nm长通滤光片在365nm光线照射下记录结果，所述智能手机的相机设定包括：曝光时间:0.25s；ISO速度:ISO-200；曝光偏置：0阶；色温:5000K；孔径:F-2.2；计量方式：部分计量；闪光模式：不闪光；焦距：17毫米；对焦模式：AF-C。
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