CN117286209A - 一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法及其应用，所述人参皂苷制剂包括富皂苷制剂、富皂苷糖浆的至少其中一种；本发明采用酵母、乳酸联合菌剂所制成的复合生物酶制剂中富含氨基酸残基，酰胺，辅酶和乳酸，亚油酸等活性基团，可通过在复合酶生物制剂中添加单糖或多糖制备出含有人参皂苷的人参皂苷制剂，为人参皂苷及其制品的获得提供新的方向与思路。

Description

一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法及其应用
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，尤其涉及一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法及其应用。
背景技术
人参皂苷(Ginsenoside)是一类固醇类化合物，又称三萜皂苷。主要存在于人参属药材中。人参皂苷被视为是人参中的活性成分，具有抗血栓、抗疲劳、抗衰老、控制肿瘤、增强免疫力等诸多作用，其中的人参皂苷Rg1具有快速缓解疲劳、改善学习记忆、延缓衰老，具有兴奋中枢神经作用、抑制血小板凝集作用等作用，人参皂苷Rf则可使乙酰胆碱引起的肠管收缩减弱，并具有溶血活性等作用。而人参皂苷多天然存在五加科植物中的根、花蕾、茎中，例如人参、三七、西洋参等，目前对于用于制备人参皂苷制剂所用皂苷多是从上述植物中提取，但是这些植物中的人参皂苷的含量较低，其提取成本较高，难以满足日益增长的医药需求。
发明内容
因此，基于以上背景，本发明提供一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法及其应用，通过酵母、乳酸联合菌剂制备的复合酶制剂制备出含有人参皂苷的人参皂苷制剂，所制备的人参皂苷制剂可用于制备具有保健功能产品，以此可为人参皂苷的相关产品的制备提供新的思路与方向。
本发明提供的技术方案为：
一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法，所述人参皂苷制剂中含有人参皂苷；
所述人参皂苷制剂由复合生物酶制剂制成，所述复合生物酶制剂由酵母、乳酸菌联合菌剂的发酵产物制成；
所述酵母、乳酸菌联合菌剂包括酵母菌和乳酸菌：
所述酵母菌包括嗜酒假丝酵母B-JJ1；
所述乳酸菌包括布氏乳杆菌B-JR1、类干酪乳杆菌B-JR2、玉米乳杆菌B-JR4、植物乳杆菌B-JR5、乳杆菌B-JR6的至少一种；
所述嗜酒假丝酵母B-JJ1的保藏编号为CCTCC NO:M2021136，其分类命名为Candida ethanolica；
所述布氏乳杆菌B-JR1的保藏编号为CCTCC NO:M2021132，其分类命名为Lactobacillus buchneri；
所述类干酪乳杆菌B-JR2的保藏编号为CCTCC NO:M2021133，其分类命名为Lactobacillus paracasei；
所述玉米乳杆菌B-JR4的保藏编号为CCTCC NO:M2021135，其分类命名为Lactobacillus zeae；
所述植物乳杆菌B-JR5的保藏编号为CCTCC NO:M2021501，其分类命名为Lactobacillus plantarum；
所述乳杆菌B-JR6的保藏编号为CCTCC NO:M2021502，其分类命名为Lactobacillus chiayiensis。
所述人参皂苷制剂的制备方法如下：
1)其可由复合生物酶制剂直接制成；
或2)向复合生物酶制剂中按照其0-100％的体积比加入糖浆，搅拌均匀后，进行加热制成；
或3)向复合生物酶制剂中按照其0-100％的重量比直接加入固体糖，搅拌均匀后，进行加热制成。
进一步地，所述人参皂苷制剂包括富皂苷制剂、富皂苷糖浆的至少其中一种；
其制备包括如下步骤：
(1)选用复合生物酶制剂，所述复合生物酶制剂由酵母、乳酸菌联合菌的发酵产物制成；
(2)向步骤(1)中的复合生物酶制剂中按照其0-100％的体积比加入糖浆并搅拌均匀；
(3)将步骤(2)的混合料进行加热；
(4)当步骤(2)的混合料经蒸发后的体积至原混合料体积的1/3-2/5时，则可制备得到富皂苷制剂；
(5)对步骤(4)的富皂苷制剂继续加热，直至蒸发后的体积量等于步骤(2)的糖浆的所加入量时，将料进行冷却后，则可制得富皂苷糖浆。
进一步地，所述富皂苷制剂或富皂苷糖浆可用于制备固态人参皂苷制剂；
其制备方法为：
将富皂苷制剂或富皂苷糖浆通过摇荡或通入空气发泡，静置后提取泡沫；然后将泡沫在90-120℃进行脱水后，即可制备得到固态人参皂苷制剂。
进一步地，所述糖浆为单糖制成的糖浆。
进一步地，所述糖浆为果葡糖浆。
进一步地，所述糖浆为包括但不限于的葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、麦芽二糖，麦芽三糖至少一种配制而成的糖浆。
进一步地，所述人参皂苷制剂中所含皂苷至少包括人参皂苷Rg1、人参皂苷Rf的其中一种。
进一步地，所述复合生物酶制剂的制备步骤如下：
(1)选用酵母、乳酸菌联合菌作菌种；所述酵母、乳酸菌联合菌剂包括酵母菌和乳酸菌：
所述酵母菌包括嗜酒假丝酵母B-JJ1；
所述乳酸菌包括布氏乳杆菌B-JR1、类干酪乳杆菌B-JR2、玉米乳杆菌B-JR4、植物乳杆菌B-JR5、乳杆菌B-JR6的至少一种；
(2)菌种活化：将无菌水按照重量比1:1濡湿土豆泥雪花粉，再按照1:2的重量比将菌种与濡湿后的土豆泥雪花粉混合后，在无菌环境下进行有氧活化；
(3)培养基的制备和接种：所述培养基以土豆泥雪花粉、小麦胚芽、糯米为主料配制而成，将培养基加水搅拌均匀后，蒸熟，然后无菌环境下晾至摄氏45度以下即培养基制备完成；
将制备的培养基与步骤(2)活化后的菌种按照重量比10：1的比例进行混合均匀；
(4)对步骤(3)接种后的培养基的湿度进行调节，保证握团有水渍出，培养基整体保持湿润透气；
(5)将步骤(4)的培养基进行有氧培养48小时以上；当培养基出现均匀肉眼可见的白色、乳白色菌斑时，将培养基转入发酵罐中；固态发酵物占据发酵罐的三分之一即可，并封闭发酵罐的所有通道，以使得入罐的培养基发酵物在罐体中继续有氧培养，直至耗尽罐体中的氧气，自行进入无氧发酵状态；
(6)当发酵罐内压力无变化时，固态发酵物进入饱和发酵，开罐有浓郁的酵香味溢出，肉眼观察有丰茂的菌丝体覆盖在固态培养基表面，取发酵产物进行检测，酵母菌活菌总数6.4×104-5.9×105cfu/ml；乳酸菌总数4×108-5.1×109cfu/ml，此时固态发酵过程已经达到饱和，进入液态发酵阶段；
(7)将步骤(6)的固态发酵物按照质量比1:3的比例加入无菌水，并充分搅拌，以稀释固态发酵过程中的代谢底物，并确保发酵罐体至少有1/5的空间，进行有氧活化培养72小时以上，直至液态发酵物表面密布白色或乳白色菌斑时，即可封闭发酵罐所有通道，再次让发酵物逐渐耗尽氧气进入无氧发酵过程；
(8)当步骤(7)的液态发酵物表面菌斑折叠态，中上层清液呈现金黄色，清澈透明，底层固态发酵物和中层液体层次分明不粘连时，即固态发酵–液态发酵过程全部完成；所得发酵产物即可。
进一步地，所述复合生物酶制剂的制备步骤还包括：
(9)将步骤(8)的物料逐步升温至78-88℃之间，2个小时后，进行冷却，提取发酵物的上清液，即制得复合生物酶制剂。
本发明还提供了采用上述方法制备的人参皂苷制剂在制备具有保健功能产品中的应用。
进一步地，所述保健功能产品包括饮品。
本发明还提供了采用上述方法制备的人参皂苷制剂所制备的纯化粉剂在医药领域中的应用。
进一步地，所述保健功能产品包括饮品。
本发明采用酵母、乳酸联合菌剂所制成的复合生物酶制剂中富含氨基酸残基，酰胺，辅酶和乳酸，亚油酸等活性基团，可通过在复合酶生物制剂中添加单糖或多糖制备出含有人参皂苷的人参皂苷制剂，为人参皂苷及其制品的获得提供新的方向与思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明所制备的人参皂苷制剂的照片；
图2为本发明制备固体粉末的人参皂苷制剂的过程照片；
图3为本发明制备固体粉末的人参皂苷制剂产品照片，其中：
图3a为焦糖色凝膏状的粗提固态人参皂苷制剂；
图3b为初提纯固态人参皂苷制剂；
图3c为第三次提取泡沫制备经过无水乙醇萃取降杂后制备的纯度更高的人参皂苷粉剂；
图3d为乙醇萃取时沉淀的氨基酸等杂质；
图3e为滤出物残渣；
图3f为高纯度人参皂苷制剂。
本发明的所述嗜酒假丝酵母B-JJ1的保藏编号为CCTCC NO:M2021136；保藏日期为2021年01月21日；保藏机构为中国典型培养物保藏中心；保藏地点为中国武汉大学。
所述布氏乳杆菌B-JR1的保藏编号为CCTCC NO:M2021132；保藏日期为2021年01月21日；保藏机构为中国典型培养物保藏中心；保藏地点为中国武汉大学。
所述类干酪乳杆菌B-JR2的保藏编号为CCTCC NO:M2021133；保藏日期为2021年01月21日；保藏机构为中国典型培养物保藏中心；保藏地点为中国武汉大学。
所述玉米乳杆菌B-JR4的保藏编号为CCTCC NO:M2021135；保藏日期为2021年01月21日；保藏机构为中国典型培养物保藏中心；保藏地点为中国武汉大学。
所述植物乳杆菌B-JR5的保藏编号为CCTCC NO:M2021501；保藏日期为2021年05月07日；保藏机构为中国典型培养物保藏中心；保藏地点为中国武汉大学。
所述乳杆菌B-JR6的保藏编号为CCTCC NO:M2021502；保藏日期为2021年05月07日；保藏机构为中国典型培养物保藏中心；保藏地点为中国武汉大学。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：
本发明制备复合生物酶制剂所用的酵母、乳酸菌联合菌剂中的嗜酒假丝酵母B-JJ1、布氏乳杆菌B-JR1、类干酪乳杆菌B-JR2、玉米乳杆菌B-JR4、植物乳杆菌B-JR5、乳杆菌B-JR6的培育可参考申请号为202111198135X的发明专利，其中一种培育的方法见下：
(1)种菌提取：取白酒酿造窖池不同方位的窖泥发酵物，所说的不同方位指的东南西北，窖池壁和窖池底部，按照2:1的重量比将35-38℃无菌水加入窖泥发酵物中，拌开后静置备用；
本实施例的酿造池为苏北窑湾古镇的某白酒传统酿造池。
(2)培养基配制：取高粱米4份，土豆泥雪花粉3份，小麦胚芽1份，荞麦1份，糯米1份后进行混合，按照1:1的重量比加入水后，并搅拌均匀，然后经蒸汽蒸馏约四十分钟，待粒状物膨胀即可放入无菌容器中摊开散热，晾至摄氏45度以下备用；
(3)菌株接种：将步骤(1)的窖泥发酵物和步骤(2)的配制的培养基按照重量比1:2比例进行混合均匀，然后放置在26℃以上的无菌环境中进行恒温有氧培植45小时以上，在此过程中需注意培养基变化；
(4)无氧选育：当步骤(3)的培养基出现白色或乳白色菌斑均匀分布时，拨开料面有湿粘感并有淡淡的酵香味时，将培养基按照1-5公斤分袋包装，并将分袋包装后的培养基放置在37℃中继续恒温发酵；
在此步骤中，由于之前的培养物伴有大量的好氧菌落，封袋后会有气体产出，应此需要注意适时放气减压。
(5)获取兼氧性酵母、乳酸联合菌：当袋中的残余氧气被消耗尽以后，袋内培养基呈真空板结块，并有白色、乳白色菌斑，菌膜覆盖时，此时多种曲霉、毛霉类好氧菌即进入凋亡，能够生存并缓慢增殖的主要为兼氧性酵母菌、乳酸联合菌；
(6)优化兼氧性酵母、乳酸菌联合菌：将上述袋中的培养基继续进行无氧发酵，以让兼氧菌继续增殖，进一步排除好氧菌，直至白色、乳白色菌膜完全覆盖培养基，完成占位并饱和发酵；此时好氧菌已经几乎没有生存的条件(可能会有极少数真菌孢子等存在但也会因为群落优势的压制及后续的工序中将其彻底杀灭)；同时兼氧菌也逐渐进入休眠状态，并等待复苏；
(7)取样检测鉴定所获共生菌落：对步骤(6)的联合菌活性进行检测，当酵母菌的活菌平均值为6.4×104cfu/ml以上；乳酸菌的活菌平均值为4×108cfu/ml以上时，即得到一代酵母、乳酸联合菌；
本实施例中，酵母菌的活菌的最高值为3.1×105cfu/ml，乳酸菌的活菌最高值为1.2×109cfu/ml。
(8)联合菌驯化：由于获取的联合菌落，脱离了曲霉，毛霉等等大群体互补后，形成新的小群体之间的共生性适应、对培养基的适应及有氧无氧环境的转换等生存环境的改变的适应，因此需要对联合菌进行驯化；将步骤(2)中的培养基与步骤(7)的一代酵母、乳酸菌联合菌按量质量1:1的进行混合，并喷淋无菌水，直至濡湿至湿散，手攥握有水滴出；然后将其放置于无菌26℃以上进行有氧活化48小时以上，直至培养基表面出现白色或乳白色菌斑均匀分布，拨开表面培养基有湿黏感并伴有酵香味溢出；然后将混合培养基料置入密闭环境中进行继续发酵，直至逐渐耗周围氧气进行入无氧发酵；无氧发酵25天后，酵母、乳酸菌联合菌落生长旺盛，即酵母、乳酸联合菌落驯化完成。
(9)联合菌包装：将步骤(8)的酵母、乳酸联合菌驯化后的培养基按照5–10公斤/袋进行真空包装，隔绝空气以杜绝好氧菌感染和彻底杀灭可能由一代株残留的曲霉、毛霉等真菌孢子，以此可便于工业化运输和应用。
本实施例在对步骤(9)中分装后的酵母、乳酸联合菌进行检测，其酵母菌的活菌平均值为6.4×104cfu/ml以上，乳酸菌的活菌平均值为4×108cfu/ml以上，有害菌中的霉菌<10cfu/ml；大肠杆菌<30cfu/ml；沙门氏菌ND；志贺氏菌ND；金黄色葡萄球菌ND(ND即未检测出)。
具体实施时，可根据实际的需要，将联合菌进行纯化分离后，再进行混合配制成具有不同的性能的联合菌，例如本发明的酵母、乳酸均联合菌可包括嗜酒假丝酵母B-JJ1、布氏乳杆菌B-JR1、乳杆菌B-JR6；或嗜酒假丝酵母菌B-JJ1、布氏乳杆菌B-JR1、类干酪乳杆菌B-JR2、乳杆菌B-JR6；或嗜酒假丝酵母菌B-JJ1、乳酸菌由布氏乳杆菌B-JR1、类干酪乳杆菌B-JR2、玉米乳杆菌B-JR4、乳杆菌B-JR6。
实施例2：复合生物酶制剂的制备步骤如下：
(1)选用酵母、乳酸菌联合菌作菌种；
本实施例中所用的酵母、乳酸菌联合菌包括酵母菌和乳酸菌：
所述酵母菌包括嗜酒假丝酵母B-JJ1；
所述乳酸菌包括布氏乳杆菌B-JR1、类干酪乳杆菌B-JR2、玉米乳杆菌B-JR4、植物乳杆菌B-JR5、乳杆菌B-JR6；
(2)菌种活化：将无菌水按照重量比1:1濡湿土豆泥雪花粉，再按照1:2的重量比将菌种与濡湿后的土豆泥雪花粉混合后，在无菌环境下进行有氧活化；
(3)培养基的制备和接种：所述培养基以土豆泥雪花粉、小麦胚芽、糯米为主料配制而成，将培养基加水后搅拌均匀后，蒸熟，然后无菌环境下晾至摄氏45度以下即培养基制备完成；
将制备的培养基与步骤(2)活化后的菌种按照重量比10：1的比例进行混合均匀；
本步骤中的培养基的制备过程为：
将高粱米、荞麦、糯米按50：10：20比例清洗后，再与10％小麦胚芽、10％土豆泥雪花粉混合均匀，1：1加水搅拌均匀后，入柜蒸熟，然后无菌环境下晾至摄氏45度即培养基制备完成。
(4)对步骤(3)接种后的培养基的湿度进行调节，保证握团有水渍出，培养基整体保持湿润透气；
(5)将步骤(4)的培养基进行有氧培养48小时以上；当培养基出现均匀肉眼可见的白色、乳白色菌斑时，将培养基转入发酵罐中；固态发酵物占据发酵罐的三分之一即可，并封闭发酵罐的所有通道，以使得入罐的培养基发酵物在罐体中继续有氧培养，直至耗尽罐体中的氧气，自行进入无氧发酵状态；
(6)当发酵罐内压力无变化时，固态发酵物进入饱和发酵，开罐有浓郁的酵香味溢出，肉眼观察有丰茂的菌丝体覆盖在固态培养基表面，取发酵产物进行检测，酵母菌活菌总数6.4×104-5.9×105cfu/ml；乳酸菌总数4×108-5.1×109cfu/ml，此时固态发酵过程已经达到饱和，可以进入液态发酵阶段；
(7)将步骤(6)的固态发酵物按照质量比1:3的比例加入无菌水，并充分搅拌，以稀释固态发酵过程中的代谢底物，并确保发酵罐体至少有1/5的空间，进行有氧活化培养72小时以上，直至液态发酵物表面密布白色或乳白色菌斑时，即可封闭发酵罐所有通道，再次让发酵物逐渐耗尽氧气进入无氧发酵过程；
(8)当步骤(7)的液态发酵物表面菌斑折叠态，中上层清液呈现金黄色，清澈透明，底层固态发酵物和中层液体层次分明不粘连时，即固态发酵–液态发酵过程全部完成；所得发酵产物即可为制得的生物酶制剂。
(9)将步骤(8)设置在逐步升温至78-88℃之间，2个小时后，进行冷却后，提取发酵物的上清液，即制得复合酶制剂。
本步骤为生物酶制剂的灭活过程，其灭活的具体操作为：
将步骤(8)物料逐步升温至78-88℃(升温后的一个小时保持55摄氏度，之后缓慢升温至78–88摄氏度之间，共计两个小时后，罐体夹层通入冷水冷却至常温，提取发酵物的上清液，即制得复合酶制剂。
并且本实施例中对步骤(9)所制备得到的生物酶制剂的总皂苷含量进行检测，检测结果为本发明所用的生物酶制剂中的中总皂苷含量为1260mg/L(报告编号为：2021SP00507R01)。
此检测是由广东省微生物分析检测中心根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中保健食品功效成分及卫生指标检验规范第二部分(二十三、保健食品中总皂甙的测定)P306-307完成，接下来有关总皂苷含量的检测如无再提及方法，均是由此完成。
实施例3：一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法，所述人参皂苷制剂为富皂苷制剂；
其制备包括如下步骤：
(1)选取实施例2制备的复合生物酶制剂；
(2)将步骤(1)的复合生物酶制剂升温至160℃进行加热，直至其蒸发后体积到原料体积的1/3后，即可制备得到富皂苷制剂。
对本实施例的步骤(2)富皂苷制剂的总人参皂苷进行检测，检测结果为总皂苷含量为3700mg/L(报告编号为：2021SP01348R01)。
实施例4：一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法，所述人参皂苷制剂为富皂苷制剂。
其制备包括如下步骤：
(1)选取实施例2制备的复合生物酶制剂；
(2)向步骤(1)中的生物酶制剂中按照4％的体积比加入型号为F55的果葡糖浆，并搅拌均匀；
(3)将步骤(2)的混合料加热至160℃以上；
(4)当步骤(2)的混合料中的蒸发后体积达到原混合料的1/3时，则可制备得到富皂苷制剂。
对本实施例步骤(4)的富皂苷制剂的总人参皂苷进行检测，检测结果为总皂苷含量为7600mg/L(报告编号为：2021SP01348R02)。
本实施例结合与实施例3进行比较，本实施例制备的富皂苷制剂的总皂苷含量为实施例3制备的富皂苷制剂的总皂苷的2倍以上，可以充分合理推测加入的果葡糖浆与生物酶制剂有所反应，在原有的总皂苷的基础上有生成了新的皂苷。
并且本实施例中尝试将果葡糖浆加入实施例2的生物酶制剂制备步骤(8)所制备的生物酶制剂后，然后再按照步骤(9)进行加热灭活，在对加入果葡糖浆后的灭活后生物酶制剂的总皂苷进行检测，其总皂苷含量为1580mg/L，略高于实施例1中的直接灭活的生物酶制剂的总皂苷含量，推测为可能是由灭活时果葡糖浆与生物酶制剂有所反应导致的总皂苷浓度出现少量变化。
实施例5：一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法，所述人参皂苷制剂为富皂苷制剂。
其制备包括如下步骤：
(1)选取实施例2制备的复合生物酶制剂；
(2)向步骤(1)中的生物酶制剂中按照15％的体积比加入型号为F55的果葡糖浆并搅拌均匀；
(3)将步骤(2)的混合料加热至160℃以上；
(4)当步骤(2)的混合料中的蒸发后体积达到原混合料的2/5时，则可制备得到富皂苷制剂。
对本实施例步骤(4)的富皂苷制剂的总人参皂苷进行检测，检测结果为总皂苷含量为18000mg/L(报告编号为：2021SP03577R04)，由此数据可更进一步地合理推断，步骤(4)所得到的总皂苷检测量的增加是由糖浆与生物酶制剂通过反应生成而非简单加热富集。
实施例6：一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法，所述人参皂苷制剂为富皂苷糖浆。
其包括如下步骤：
(1)选取实施例2制备的复合生物酶制剂；
(2)向步骤(1)中的生物酶制剂中按照100％的体积比加入果葡糖浆并搅拌均匀；
(3)将步骤(2)的混合料加热至160℃以上；
(4)当步骤(2)的混合料中的蒸发后体积等于所加入果葡糖浆的体积时，则可制得富皂苷糖浆。
对本实施例步骤(4)的富皂苷制剂的总人参皂苷进行检测，检测结果为总皂苷含量为16000mg/L(报告编号为：2021SP06170R02)。
本发明采用生物酶制剂与糖浆共混加热制备人参皂苷的方法，推测其反应原理为：
其主要是可利用生物酶制剂中具有的丰富的自由活性基团(氨基酸残基，酰胺，辅酶和乳酸，亚油酸等活性基团)经过一系列的酶解、酸解、水解、加热催化脱水缩合，酰基修饰等，再利用单糖的多羟基醛，多羟基酮特征，和具备的多羟基反应，氧化酯化反应，缩醛反应，醛基、羰基反应等属性，经加热、催化等多重反应，生成主要以皂苷Rf,Rg1为主的皂苷，由于生物酶制剂中的活性成分较为复杂，具体的有关生物酶制剂加单糖源制备皂苷的机理还需进行试验验证。
实施例7：一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法，所述人参皂苷制剂为富皂苷制剂。
其制备包括如下步骤：
(1)选取实施例2制备的复合生物酶制剂；
(2)向步骤(1)中的生物酶制剂中按照25％的重量比加入双糖-冰糖结晶体并搅拌均匀；
(3)将步骤(2)的混合料加热至100℃以上，冰糖水解由双糖转化为单糖；
(4)将步骤(3)的混合料升温至160℃以上继续加热缩合；
(5)当步骤(4)的混合料中的蒸发后体积达到原生物酶制剂体积的2/5时，则可制得富皂苷制剂。
对步骤(5)的富皂苷制剂进行检测，检测结果显示其总皂苷含量在66000mg/L(报告编号为：2021SP07432R01)。本实施例说明也可采用多糖，例如冰糖、砂糖、红糖等双糖与生物酶制剂反应生成皂苷，推测多糖在加热后会先通过水解生成单糖，例如双糖C12H22O11加热水解成单糖C6H12O6，然后单糖再参与反应生成皂苷。
实施例3至实施例7所制备的人参皂苷制剂的照片如附图所示，其颜色可呈红棕色或棕色。
实施例8：本实施采用实施例7所制备的富皂苷制剂用来制备固态人参皂苷制剂。
其制备方法为：
将实施例7所制备的富皂苷制剂降温至40℃以下，通过摇荡或通入空气发泡，静置后提取泡沫；反复操作提取直至没有泡沫产生；然后将提取的泡沫在90-120℃进行脱水后，即可制备得到焦糖色凝膏状的固态人参皂苷制剂(即粗提固态人参皂苷制剂)(附图2为制备过程中富皂苷制剂的照片，粗提固态人参皂苷制剂产品照片见附图3a)。
具体实施时，将上述的粗提固态人参皂苷制剂用蒸馏水水稀释十倍以上；再次重复常振荡或通入空气发泡，静置后提取泡沫；反复操作提取直至没有泡沫产生；然后将提取的泡沫在90-120℃进行脱水后，然后再次得到淡焦糖色的固态人参皂苷制剂，即为初提纯固态人参皂苷制剂，产品照片见图3b，此操作为洗除制剂的其他水溶性杂质，进行进一步地对皂苷制剂进行提纯。
进一步地，对上述的初提纯固体人参皂苷制剂加入无水乙醇十倍进行溶解，沉淀分离出氨基酸等杂质，静置澄清后，用400目滤纸或滤布，过滤出乙醇溶液，蒸发乙醇后得到图3c所示的Rg1、Rf混合制剂粉末，图3d为沉淀物残渣，图3e为过滤出的残渣。
取正丁醇饱和水溶液，充分对Rg1、Rf混合制剂粉末进行溶解，萃取人参皂苷，弃水溶液，减压回收正丁醇，制备得到高纯度人参皂苷制剂，见图3f。
实施例9：采用实施例3至实施例7制备饮品，在饮品的制备过程中可加入制备饮料常规的原料，例如其可加水进行稀释，或还加入果汁进行调味；或是直接灌装即可。
对实施例4所制备的饮料进行检测，检测由国家食品机械质量监督检验中心采用标准对照法进行检测(报告编号为：2129053)，检测出人参皂苷Rf含量为333.6mg/L、人参皂苷Rg1的含量为1318mg/L。
并且采用本发明所制备的人参皂苷制剂加工生产制备饮料时，无需增加防腐剂等，即可进行长时间保存(不低于两年)，本发明采用的复合生物酶制剂可用于作为保鲜剂(参见申请号为202111198135X的发明专利，在此不进行赘述)，因此本发明的人参皂苷制剂所制备保健功能饮料更为安全，健康。
并且在具体实施时，本发明所制备的人参皂苷制剂中可根据需求人参皂苷进行提纯，以可为人参皂苷及其人参皂苷制品的医药应用提供新的思路与方向。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，上述实施例所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的实施方式并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的实现方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法，其特征在于，
所述人参皂苷制剂中含有人参皂苷；
所述人参皂苷制剂由复合生物酶制剂制成，所述复合生物酶制剂由酵母、乳酸菌联合菌剂的发酵产物制成；
所述酵母、乳酸菌联合菌剂包括酵母菌和乳酸菌：
所述酵母菌包括嗜酒假丝酵母B-JJ1；
所述乳酸菌包括布氏乳杆菌B-JR1、类干酪乳杆菌B-JR2、玉米乳杆菌B-JR4、植物乳杆菌B-JR5、乳杆菌B-JR6的至少一种；
所述嗜酒假丝酵母B-JJ1的保藏编号为CCTCC NO:M2021136，其分类命名为Candidaethanolica；
所述布氏乳杆菌B-JR1的保藏编号为CCTCC NO:M2021132，其分类命名为Lactobacillus buchneri；
所述类干酪乳杆菌B-JR2的保藏编号为CCTCC NO:M2021133，其分类命名为Lactobacillus paracasei；
所述玉米乳杆菌B-JR4的保藏编号为CCTCC NO:M2021135，其分类命名为Lactobacillus zeae；
所述植物乳杆菌B-JR5的保藏编号为CCTCC NO:M2021501，其分类命名为Lactobacillus plantarum；
所述乳杆菌B-JR6的保藏编号为CCTCC NO:M2021502，其分类命名为Lactobacilluschiayiensis。
所述人参皂苷制剂的制备方法如下：
1)其可由复合生物酶制剂直接制成；
或2)向复合生物酶制剂中按照其0-100％的体积比加入糖浆，搅拌均匀后，进行加热制成；
或3)向复合生物酶制剂中按照其0-100％的重量比加入固体糖，搅拌均匀后，进行加热制成。
2.根据权利要求1所述的一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法，其特征在于，
所述人参皂苷制剂包括富皂苷制剂、富皂苷糖浆的至少其中一种；
其制备包括如下步骤：
(1)选用复合生物酶制剂，所述复合生物酶制剂由酵母、乳酸菌联合菌的发酵产物制成；
(2)向步骤(1)中的复合生物酶制剂中按照其0-100％的体积比加入糖浆并搅拌均匀；
(3)将步骤(2)的混合料进行加热；
(4)当步骤(2)的混合料经蒸发后的体积至原混合料体积的1/3-2/5时，则可制备得到富皂苷制剂；
(5)对步骤(4)的富皂苷制剂继续加热，直至蒸发后的体积量等于步骤(2)的糖浆的所加入量时，将料进行冷却后，则可制得富皂苷糖浆。
3.根据权利要求2所述的一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法，其特征在于，所述富皂苷制剂或富皂苷糖浆可用于制备固态人参皂苷制剂。
4.根据权利要求1至3任一项所述的一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法，其特征在于，所述糖浆为单糖制成的糖浆。
5.根据权利要求4所述一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法，其特征在于，所述糖浆为果葡糖浆。
6.根据权利要求1至3任一项所述的一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法，其特征在于，所述糖浆为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、麦芽二糖，麦芽三糖至少一种配制而成的糖浆。
7.权利要求1至6任一项所述采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法中所用复合生物酶制剂的制备方法，其特征在于，
所述复合生物酶制剂的制备步骤如下：
(1)选用酵母、乳酸菌联合菌作菌种；所述酵母、乳酸菌联合菌剂包括酵母菌和乳酸菌：
所述酵母菌包括嗜酒假丝酵母B-JJ1；
所述乳酸菌包括布氏乳杆菌B-JR1、类干酪乳杆菌B-JR2、玉米乳杆菌B-JR4、植物乳杆菌B-JR5、乳杆菌B-JR6的至少一种；
(2)菌种活化：将无菌水按照重量比1:1濡湿土豆泥雪花粉，再按照1:2的重量比将菌种与濡湿后的土豆泥雪花粉混合后，在无菌环境下进行有氧活化；
(3)培养基的制备和接种：所述培养基以土豆泥雪花粉、小麦胚芽、糯米为主料配制而成，将培养基加水后搅拌均匀后，蒸熟，然后无菌环境下晾至摄氏45度以下即培养基制备完成；
将制备的培养基与步骤(2)活化后的菌种按照重量比10：1的比例进行混合均匀；
(4)对步骤(3)接种后的培养基的湿度进行调节，保证握团有水渍出，培养基整体保持湿润透气；
(5)将步骤(4)的培养基进行有氧发酵48小时以上；当培养基出现均匀肉眼可见的白色、乳白色菌斑时，将培养基转入发酵罐中；固态发酵物占据发酵罐的三分之一即可，并封闭发酵罐的所有通道，以使得入罐的培养基发酵物在罐体中继续有氧培养，直至耗尽罐体中的氧气，自行进入无氧发酵状态；
(6)当发酵罐内压力无变化时，固态发酵物进入饱和发酵，开罐有浓郁的酵香味溢出，肉眼观察有丰茂的菌丝体覆盖在固态培养基表面，取发酵产物进行检测，酵母菌活菌总数6.4×104-5.9×105cfu/ml；乳酸菌总数4×108-5.1×109cfu/ml，此时固态发酵过程已经达到饱和，进入液态发酵阶段；
(7)将步骤(6)的固态发酵物按照质量比1:3的比例加入无菌水，并充分搅拌，以稀释固态发酵过程中的代谢底物，并确保发酵罐体至少有1/5的空间，进行有氧活化培养72小时以上，直至液态发酵物表面密布白色或乳白色菌斑时，即可封闭发酵罐所有通道，再次让发酵物逐渐耗尽氧气进入无氧发酵过程；
(8)当步骤(7)的液态发酵物表面菌斑折叠态，中上层清液呈现金黄色，清澈透明，底层固态发酵物和中层液体层次分明不粘连时，即固态发酵–液态发酵过程全部完成；所得发酵产物即可。
8.根据权利要求7所述一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法，其特征在于，所述复合生物酶制剂的制备步骤还包括：
(9)将步骤(8)的物料逐步升温至78-88℃之间，2个小时后，进行冷却，提取发酵物的上清液，即制得复合生物酶制剂。
9.权利要求1或2所述的人参皂苷制剂在制备具有保健功能产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述保健功能产品包括饮品。
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