CN117257925A - 基于人巨细胞病毒编码即刻早期蛋白ie的疫苗、其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基于人巨细胞病毒编码即刻早期蛋白IE的疫苗，包括如下的一种：IE1腺病毒载体类疫苗；IE2腺病毒载体类疫苗；IE1重组蛋白类疫苗；IE2重组蛋白类疫苗；其中野生型IE1的突变体IE1‑mut的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，野生型IE2的突变体IE2‑mut的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明采用上述的基于人巨细胞病毒编码即刻早期蛋白IE的疫苗，能够识别和消灭脑部癌细胞，可广泛应用于制备治疗胶质瘤的药品。

Description

基于人巨细胞病毒编码即刻早期蛋白IE的疫苗、其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及疫苗技术领域，尤其是涉及基于人巨细胞病毒编码即刻早期蛋白IE的腺病毒载体疫苗、其制备方法和应用。
背景技术
本发明提供两种基于病毒编码即刻早期蛋白(IE)腺病毒载体疫苗及亚单位蛋白疫苗。人类巨细胞病毒(HCMV)是一种普遍存在的β-疱疹病毒，感染了全球人口的很大一部分。在免疫功能受损的人群中，包括移植接受者和HIV/AIDS患者，它是导致发病率和死亡率显著的原因。HCMV可以建立终身的潜伏感染，病毒会周期性地重新激活和排放。该病毒可以感染人体的各种细胞，包括上皮细胞、内皮细胞和白细胞，导致广泛的临床表现，包括先天性感染、肝炎、视网膜炎、脑炎和肺炎。该病毒还可以导致移植接受者的并发症，如器官排斥和移植物衰竭。因此，开发有效的预防和治疗策略来预防HCMV感染，对于提高受影响个体的健康结果至关重要。最近的研究还表明，HCMV与某些类型的脑肿瘤，特别是胶质母细胞瘤之间存在潜在联系。神经胶质母细胞瘤是一种特别具有侵略性的脑癌，目前的治疗选择在其疗效方面存在一定限制。因此，研究人员一直在探索新颖的治疗方法，包括针对HCMV蛋白，特别是IE蛋白的疫苗的使用。HCMV编码的即刻早期蛋白IE分为即刻早期蛋白IE1(IE1)及即刻早期蛋白2(IE2)。它们在癌细胞的生存和增殖中起着至关重要的作用，使其成为免疫疗法的一个有吸引力的靶点。研究人员一直在研发以IE蛋白为免疫靶点的疫苗，以触发细胞免疫反应帮助识别和消灭脑部癌细胞。
发明内容
本发明的目的是提供基于人巨细胞病毒编码即刻早期蛋白IE的疫苗，能够识别和消灭脑部癌细胞，可广泛应用于制备治疗胶质瘤的药品。
为实现上述目的，本发明提供了基于人巨细胞病毒编码即刻早期蛋白IE的腺病毒载体疫苗，包括如下的一种：
IE1腺病毒载体类疫苗；
IE2腺病毒载体类疫苗；
IE1重组蛋白类疫苗；
IE2重组蛋白类疫苗；
其中野生型IE1的突变体IE1-mut的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，野生型IE2的突变体IE2-mut的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述的基于人巨细胞病毒编码即刻早期蛋白IE的疫苗的制备方法，IE1腺病毒载体类疫苗或IE2腺病毒载体类疫苗的制备方法包括以下步骤：
1)细胞培养；
2)腺病毒包装。
本发明还提供了上述的基于人巨细胞病毒编码即刻早期蛋白IE的疫苗的制备方法，IE1重组蛋白类疫苗或IE2重组蛋白类疫苗的制备方法包括以下步骤：
1)设计引物，通过PCR扩增出目的基因；
2)用BamHI-HF对质粒载体进行酶切，线性化；
3)将目的基因同源重组入线性化载体；
4)转化；
5)挑取步骤4)中的转化子进行菌落PCR鉴定；
6)人巨细胞病毒突变型即刻早期蛋白IE大肠杆菌表达。
优选的，所述步骤1)中目的基因的扩增引物为F1和R1、F1-2和R1-2，F1的序列如SEQ ID NO.3所示，R1的序列如SEQ ID NO.4所示，F1-2的序列如SEQ ID NO.7所示，R1-2的序列如SEQ ID NO.8所示。
优选的，所述步骤3)的具体操作为：将目的基因片段和线性化载体以摩尔比2：1加到试管中进行重组反应，混匀后42℃孵育30分钟，然后转移到冰上，放置2-3分钟后取10uL反应液体转化到感受态细胞中。
优选的，所述步骤4)的具体操作为：取感受态细胞于冰上，待溶解后加入10μL连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟；
a、将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90秒；
b、快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟；
c、每管加900μL LB培养液，然后将管转移到37℃摇床上，温育1小时使细菌复苏；
d、取恰当量的转化菌液涂布于LB琼脂平板上，平板上含表达载体相应的抗生素。
e、倒置平板，于恒温培养箱中37℃培养，16小时。
优选的，所述步骤5)中菌落PCR鉴定所需的引物为F2和R2、F2-2和R2-2，F2的序列如SEQ ID NO.5所示，R2的序列如SEQ ID NO.6所示，F2-2的序列如SEQ ID NO.9所示，R2-2的序列如SEQ ID NO.10所示。
本发明还提供了上述的基于人巨细胞病毒编码即刻早期蛋白IE的疫苗在制备治疗胶质瘤药品中的应用。
本发明所述的基于人巨细胞病毒编码即刻早期蛋白IE的腺病毒载体疫苗、其制备方法和应用的优点和积极效果是：
1、本发明中的腺病毒载体类和蛋白类疫苗能够刺激T细胞活化并分泌IL2，IFN-γ，TNFα，IL4及IL6等细胞因子。
2、本发明中的腺病毒载体类和蛋白类疫苗能够识别和消灭脑部癌细胞，可广泛应用于制备治疗胶质瘤的药品。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明中蛋白类疫苗质粒载体图谱；
图2为本发明中酶切图谱；
图3为本发明中PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱；
图4为本发明中菌落PCR鉴定示意图；
图5为本发明中菌落PCR鉴定结果图；
图6为本发明中阳性克隆测序结果图；
图7为本发明中小试表达SDS-PAGE检测结果；
图8为本发明中小试表达Western blot检测结果；
图9为本发明中大量表达SDS-PAGE&Western blot分析图；
图10为本发明中腺病毒载体疫苗质粒图谱；
图11为本发明中重组腺病毒流程图；
图12为本发明中IE1腺病毒包装结果图；
图13为本发明中IE2腺病毒包装结果图；
图14为本发明中IE1腺病毒载体疫苗免疫反应；
图15为本发明中IE1重组蛋白疫苗免疫反应；
图16为本发明中IE2腺病毒载体疫苗免疫反应；
图17为本发明中IE2重组蛋白疫苗免疫反应；
图18为本发明中IE1腺病毒载体疫苗对神经胶质瘤的治疗效果图；
图19为本发明中IE2腺病毒载体疫苗对神经胶质瘤的治疗效果图；
图20为本发明中野生型IE和突变型IE对肿瘤细胞的影响；
图21为本发明中突变型IE可逆转野生型IE对细胞周期的阻滞。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
实施例1
1.IE突变型的氨基酸序列
1.1IE1突变型(IE1-mut)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：MESSAKRKMDPDNPDEGPSSKVPRPETPVTKATTFLQTMLRKEVNSQLSLGDPLFPELAEESLKTFEQVTEDCNENPEKDVLAELVKQIKVRVDMVRHRIKEHMLKKYTQTEEKFTGAFNMMGGCLQNALDILDKVHEPFEEMKCIGLTMQSMYENYIVPEDKREMWMACIKELHDVSKGAANKLGGALQAKARAKKDELRRKMMYMCYRNIEFFTKNSAFPATTNGCSQAMAALQALPQCSPDEIMAYAQKIFKILDEERDKVLTHIDHIFMDILTTCVETMCAEYKVTSDACMATMYGGISLLSEFCAVLCCYVLEETSVMLAKRPLITKPEVISVMKRRIEEICMKVFAQYILGADPLRVCSPSVDDLRAIAEESDEEEAIVAYTLATAGVSSSDSLVSPPESPVPATIPLSSVIVAENSDQEESEQSDEEEEEGAQEEREDTVSVRSEPVSEIEEVAPEEEEDGAEEPTASGGKSTHPMVTRSKADQ。
1.2IE2突变型(IE2-mut)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
MESSAKRKMDPDNPDEGPSSKVPRPETPVTKATTFLQTMLRKEVNSQLSLGDPLFPELAEESLKTFEQVTEDCNENPEKDVLAELGDILAQAVNHAGIDSSSTGPTLTTHSCSVSSAPLNKPTPTSVAVTNTPLPGASATPELSPRKKPRKTTRPFKVIIKPPVPPAPIMLPLIKQEDIKPEPDFTIQYRNKIIDTAGCIVISDSEEEQGEEVETRGATASSPSTGSGTPRVTSPTHPLSQMNHPPLPDPLGRPDEDSSSSSSSSCSSASDSESESEEMKCSSGGGASVTSSHHGRGGFGGAASSSLLSCGHQSSGGASTGPRKKKSKRISELDNEKVRNIMKDKNTPFCTPNVQTRRGRVKIDEVSRMFRNTNRSLEYKNLPFTIPSMHQVLDEAIKACKTMQVNNKGIQIIYTRNHEVKSEVDAVRCRLGTMCNLALSTPFLMELTMPVTLPPEVAQRTADACNEGVKAAWSLKELHTHQLCPRSSDYRNMIIHAATPVDLLGALNLCLPLMQKFPKQVMVRIFSTNQGGFMLPIYETAAKAYAVGRFEQPTETPPEDLDTLSLAIEAAIQDLRNKSQ。
实施例2重组蛋白类疫苗的制备
下面以IE1重组蛋白类疫苗为例，详细说明其制备方法
2.人巨细胞病毒重组蛋白腺病毒载体表达
质粒载体图谱如图1所示。
2.2多克隆位点：
用BamHI-HF对质粒载体进行酶切，回收5275bp载体片段，酶切图谱如图2所示。
2.3目的基因扩增
引物F1：CTTGGGCTGCAGGTCGACGCCACCATGGAGTCTAGCGCTAAGAGAA(SEQ ID NO.3)；R1：AGGGAGAGGGGCGGATCCTTACTGGTCGGCCTTGCTTCTGG(SEQ ID NO.4)，用于PCR钓取目的基因IE-2的序列，PCR产物标记为b。
2.4PCR扩增目的基因片段
PCR反应体系(表1)：
表1
PCR循环条件(表2)：
表2
PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱如图3所示，由图3可知，PCR产物b大小为1518bp。
2.5目的基因同源重组入表达载体：
将目的DNA片段和线性化载体以摩尔比2:1加到试管中进行重组反应(表3)：
表3
混匀后在42℃孵育30分钟，然后转移到冰上。放置2-3分钟后取10ul反应液体转化到感受态细胞中。
说明：阳性对照和自连对照，加入的载体和连接组一致，但阳性对照加入的基因片段是目的基因(带有同样的同源重组交换臂)
2.6转化：
取一支感受态细胞(每管100μl，-80℃保存)于冰上，待溶解后加入10μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。
1.将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90秒。
2.快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟。
3.每管加900μl LB培养液，然后将管转移到37℃摇床上，温育1小时使细菌复苏。
4.取恰当量的转化菌液涂布于LB琼脂平板上(含表达载体相应的抗生素)。
5.倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养，16小时。
2.7阳性克隆鉴定：
挑取平板上长出的转化子重悬于10μl LB培养液中，从中取1μl做模板进行菌落PCR鉴定。菌落PCR鉴定示意图如图4所示。菌落PCR鉴定引物F2：GGTATAAGAGGCGCGACCAG(SEQID NO.5)，R2：CCTCACATTGCCAAAAGACG(SEQ ID NO.6)，用于菌落PCR鉴定转化子。阳性克隆得到1698bp的片断，阴性克隆得到0bp的片断。
菌落PCR反应体系(表4)：
表4
PCR仪进行反应，按以下循环条件(表5)：
表5
菌落PCR鉴定结果如图5所示，其中5～8为挑取PSE5868的4个转化子。接种阳性克隆，保种并分装100ul送测序。测序没有问题的，再接种抽提质粒。
2.8阳性克隆测序结果分析：
阳性克隆测序结果如图6所示，和预期的目的基因序列基本一致，深色标记的为载体序列，浅色标记为目的基因IE1-mut的序列。
3.人巨细胞病毒突变型即刻早期蛋白IE1大肠杆菌表达
3.1基因合成和亚克隆(表6)
表6
3.2表达评估
3.2.1转化
3.2.1.1从超低温冰箱中取出BL21(DE3)和RosettaTM2(DE3)感受态细胞，置于冰上融化；
3.2.1.2加入质粒(100ng)，轻轻吹吸充分混匀；
3.2.1.3冰上放置30min；
3.2.1.4水浴锅42度热激90s；
3.2.1.5冰上放置3min；
3.2.1.6加入100μl室温LB液体培养基；
3.2.1.7在摇床中37度，200转震荡培养60分钟；
3.2.1.8将菌液混匀后涂至卡那霉素抗性平板上；
3.2.1.9平板倒置，37度培养过夜。
3.2.2小试表达
3.2.2.1分别挑取3个单克隆，分别接种到4ml含有50μg/ml卡那霉素的LB试管中，3.2.2.2在摇床中37度200转震荡培养；
3.2.2.3当OD600达到0.6～0.8时，向2个试管中分别加入0.5mM IPTG，15度培养16小时和37度培养4小时，最后一支试管为阴性参照；
3.2.2.4SDS-PAGE和Western blot检测蛋白质的表达和溶解度；
3.3样品准备
取450μl培养基离心后的沉淀，重悬于300μl裂解缓冲液(50mM Tris-Hcl,150mMNaCl,5％glycerol,pH 8.0)，超声裂解1分钟；
3.3.1全菌样品：取100μl裂解液，与50μl 5x loading buffer混合均匀，100度加热10分钟，15000转离心5分钟；
3.3.2上清和包涵体样品：取剩余200μl裂解液，15000转离心10分钟，分别取上清和沉淀。混合90μl 5x loading buffer到180μl上清，做为上清样品；用150μl 5x loadingbuffer重悬沉淀，做为包涵体样品，100度加热10分钟后，15000转离心5分钟，待上样。
3.4.实验结果
用SDS-PAGE和Western blot检测全菌、上清、包涵体样品。结果如图7和图8所示。图7为SDS-PAGE检测结果，图8为Western blot检测结果。
图7中：Lane M1:Protein marker；
Lane M2:Western blot Protein marker；
Lane PC1:BSA(1μg)；
Lane PC2:BSA(2μg)；
Lane NC:未诱导的全细胞；
Lane 1:15℃诱导16h的全细胞；
Lane 2:37℃诱导4h的全细胞；
Lane NC1:未诱导的细胞裂解上清；
Lane 3:15℃诱导16h的细胞裂解上清；
Lane 4:37℃诱导4h的细胞裂解上清；
Lane NC2:未诱导的细胞裂解沉淀
Lane 5:15℃诱导16h的细胞裂解沉淀；
Lane 6:37℃诱导4h的细胞裂解沉淀；
用于Western blot的抗体为anti-His抗体(GenScript，Cat.No.A00186)。
3.5蛋白大量表达SDS-PAGE&Western blot分析，结果如图9所示。
IE2重组蛋白类疫苗的制备方法与IE1重组蛋白类疫苗的制备方法相同，区别在于：IE2重组蛋白类疫苗的制备过程中目的基因的扩增引物F1-2：CTTGGGCTGCAGGTCGACGCCACCATGGAGTCCAGCGCTAAGCGTA(SEQ ID NO.7)；R1-2：AGGGAGAGGGGCGGATCCTTACTGGCTCTTATTTCTCAGATCC(SEQ ID NO.8)。
阳性克隆鉴定引物F2-2：GGTATAAGAGGCGCGACCAG(SEQ ID NO.9)；R2-2：CCTCACATTGCCAAAAGACG(SEQ ID NO.10)
实施例3腺病毒载体类疫苗的制备
下面以IE1腺病毒载体类疫苗为例，详细说明其制备方法
1.细胞株和质粒(表7)：
表7
2.主要试剂(表8)
表8试剂
3.主要仪器设备(表9)
表9仪器设备
细胞的培养
1.细胞复苏
1)准备适当的灭菌培养瓶，标上细胞系名称、传代数和日期；
2)穿戴好适当的防护设备从液氮罐中取出冻存的细胞，并在密封容器中转移到实验室中；
3)穿戴防护衣，将细胞从容器中拿出到适当温度中的水浴箱中，用37℃水浴。只浸没冻存管的下半部分，解冻到小瓶中只剩少量冰块，通常1～2min，转移到生物安全柜中；
4)用70％酒精浸湿的棉花擦拭冻存管的外部，并在酒精灯前打开冻存管；
5)慢慢的用移液管逐滴移至温育过的培养液中，用以稀释DMSO；
6)在适当的温度和浓度的CO2中进行培养；
7)24h后显微镜观察细胞，如果有必要需进行传代。
2.细胞传代
1)用倒置显微镜观察细胞，评估细胞汇合的程度以及确认无细菌和真菌污染；
2)移去培养瓶中的培养液；
3)相当于培养液体积一半的PBS清洗单层细胞，一般三次即可；
4)按1mL/25cm2表面积的量加入0.25％胰酶消化单层细胞。摇晃培养瓶使其胰蛋白酶覆盖细胞单层，倒出多余的胰蛋白酶；
5)将培养瓶放回培养箱，放置2～10min；
6)用倒置显微镜观察细胞以确保所有细胞都分离且漂浮，轻拍培养瓶的一侧来释放残留的贴壁细胞；
7)用少量的含新鲜血清的培养液重悬细胞以灭活胰蛋白酶，取出100～200μl用于计数；
8)将所需数量的细胞移至一个新标记好的含温育过培养液的培养瓶中或者培养板上；选择适当培养条件培养细胞系；
9)按照细胞系的生长特性重复该步骤，直到细胞状态良好、无污染，可以铺六孔板使用，其余选择冻存。
3.活细胞计数
取一瓶传代的细胞，待长成单层以后使用；细胞悬液的制备方法：用0.25％的胰酶消化、PBS液洗涤后，加入培养液(或Hanks液或PBS等平衡盐溶液)，吹打制成待测细胞悬液。盖好盖玻片，取一套血球计数槽上，制备计数用的细胞悬液：用吸管吸适量细胞悬液(如5滴)到离心管中，加入等体积台盼蓝染液(0.4％)，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。若仅是单纯的进行细胞计数，不考虑细胞的活力，则可省略台盼蓝染色步骤；将细胞悬液滴入计数板，注意盖玻片下不要有气泡，也不要悬液流入旁边槽中；统计四个大格的细胞数，将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的大格(每格含有16个中格)中没有被染液染上色的细胞数目；计算原细胞悬液的细胞数。按照下面公式计算细胞密度：
(细胞悬液的细胞数)/mL＝(四个大格子细胞数/4)×2×104
说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数，公式中乘以2因为细胞悬液于染液1：1稀释。
4.准备六孔板
选择细胞状态良好、无污染的HEK293细胞，使用细胞传代的方式，均匀铺与六孔板中，保证每孔细胞量相同，应该达到2×106个，隔天细胞长到50～80％左右开始转染。
5.细胞冻存
用倒置显微镜观察细胞，评估细胞密度以及确认无细菌和真菌污染，移去培养瓶中的培养液，用相当于培养液体积一半的PBS清洗单层细胞，一般三次即可，按1mL/25cm2表面积的量加入0.25％胰酶消化单层细胞。摇晃培养瓶使胰蛋白酶覆盖细胞单层。倒出多余的胰蛋白酶，将培养瓶放回培养箱，放置2～10min，用倒置显微镜观察细胞以确保所有细胞都分离且漂浮，轻拍培养瓶的一侧来释放残留的贴壁细胞，用少量的含新鲜血清的培养液重悬细胞以灭活胰蛋白酶。取出100～200μl用于计数。为了冻存后有好的复苏效果，理想细胞的存活率应超过90％。将剩余的细胞150g离心5min，在冻存培养液中，以2～4×106个细胞/mL的密度重悬细胞，吸取1mL细胞悬液转移至标有细胞系名称、传代次数的冻存管中，将冻存管放置冻存盒中放入-80℃冰箱过夜，最后将冷冻的冻存管转移到液氮的气相层内存放，并记录位置。
腺病毒包装过程
1.AdMax腺病毒包装系统简介
AdMax腺病毒包装系统是FrankL.Graham教授建立的，由加拿大microbix公司经销。它的工作原理是将携带外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的辅助包装质粒共转染HEK293细胞，利用Cre/loxP(或FLP/frt)重组酶系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。这个系统操作简便、重组效率高、获得的病毒产率高、目的基因的表达水平高。
2.包装过程(以10cm培养板为例)：
转染前一天，将细胞接种10cm细胞培养器皿中，控制细胞转染时的密度为70-90％。转染前一小时取出细胞培养器皿，去除原有细胞培养基，加入10ml的Opti-MEM培养基，将细胞送回培养箱。
制备转染试剂和质粒的复合物：
a.取1.5mlEp管一支，加入待转染的病毒载体质粒，用Opti-MEM培养基补齐到500μl，轻轻混匀；
b.取1.5mlEp管一支，加入Trans-EZ溶液，用Opti-MEM培养基补齐到500μl，轻轻混匀；
c.将Trans-EZ稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20分钟，使DNA和Trans-EZ充分结合形成稳定的转染复合体。
取出细胞培养板，将上面得到的DNA-Trans-EZ复合体加入到细胞培养器皿中，做好标记，放回培养箱；6h后吸去培养基，PBS洗一次，加入10mL新鲜生长培养基培养，如有大量细胞漂起，则不去上清，加入6mL完全培养基，37℃过夜培养，次日换液；三天换一次，大概7-15天左右出现病毒空斑，等待病变后纯化。
3.包装结果
如图12所示。
4.重组腺病毒的收获
待大部分细胞出现典型的病变，且有50％的细胞脱壁，收集细胞，-70℃与37℃反复冻融3次，收集病毒上清于-70℃保存。
5.病毒的小量扩增
当培养的HEK293细胞达80～90％汇合时，弃培养液，陈留少许覆盖细胞表面；用移液枪将10μl的病毒液加入10cm2 dish中，混匀，放入37℃，5％CO2培养箱中；2h后补加10mL培养液，放入培养箱培养；4～5天后待培养的HEK293变圆，脱壁，一些细胞漂浮，并且其颜色从橙色变为黄色时即表明细胞已病变，可以用移液枪收集，-70℃保存备用。
6.重组腺病毒的大量扩增及梯度离心纯化
注释：许多实验研究都是用原病毒感染细胞，然而有些实验尤其是动物实验，通常使用纯化的病毒。本公司采用Hitt等人(1998)的经典氯化铯梯度离心方法。以30×150mm培养皿中富集病毒的方法为例。
1、准备细胞：
对于30×150mm培养皿：当所有被感染的细胞变圆并且部分漂浮，刮净培养皿，然后将细胞和上清转入50ml离心管中，750g，离心10分钟。用15ml的0.1M的Tris-HCl(PH8.0)重悬,-80度保存。
2、溶解样品，每15ml细胞溶解物加入1.5ml5％脱氧胆酸钠，混匀室温孵育30分钟。这个结果是相对澄清的，高粘度的悬浮液。
3、每15ml的细胞溶解物加入150ul氯化镁和75ul的DNaseⅠ溶液，混匀，37度孵育30-60分钟，每隔10分钟混匀一次。粘稠度应该减小，仅仅比水的稍微粘稠些。
4、使用高速台式离心机，4度，高速离心15分钟。
5、同时，准备氯化铯梯度(用SW41转子的超纯管子，用于5ml的样品)：每个管子中加0.5ml的1.5g/cc的氯化铯溶液，轻轻的在上面铺上3ml的1.35g/cc的氯化铯溶液，轻轻的再铺上一层3ml的1.25g/cc的氯化铯溶液。加好之后不可以打乱梯度。
6、每个梯度的管子加入第4步中得到的上清5ml。
7、用SW41转子，4度，35000rpm离心，1小时(加速和减速设置1)
8、收集病毒条带(应该在1.25g/cc和1.35g/cc之间)。
9、将得到的病毒条带转移到SW50.1转子配套的无菌管子中，用1.35g/cc溶液加满管子)，混匀。用SW50.1转子，4度，35000rpm，离心16-20小时。(或者用SW41转子，10度，35000rpm，离心16-24小时)。
10、用尽可能小的体积收集病毒(通常是0.5-1ml)，转入透析袋中，4度，500倍体积(或者更大)的10MmTris-HCl，PH8.0透析，至少24小时，之间更换二-三次溶液。
11、透析之后，纯化的病毒分装小份-80保存。
IE2腺病毒载体类疫苗的制备方法与IE1腺病毒载体类疫苗的制备方法相同，IE2腺病毒包装结果如图13所示。
实施例4疫苗免疫反应
IE1腺病毒载体疫苗和IE1重组蛋白疫苗在脾脏中诱导产生T细胞反应。
于小鼠体内一次注射IE1腺病毒载体疫苗后14天检测脾脏中T细胞的活化情况，结果如图14所示。由图14可以看出蛋白疫苗能够刺激T细胞活化并分泌IL2，IFN-γ，TNFα，IL4及IL6。于小鼠体内三次注射IE1重组蛋白疫苗后14天检测脾脏中T细胞的活化情况，结果如图15所示，由图15可知，蛋白疫苗能够刺激T细胞活化并分泌IL2，IFN-γ，TNFα，IL4及IL6。
IE2腺病毒载体疫苗和IE2重组蛋白疫苗在脾脏中诱导产生T细胞反应。
于小鼠体内一次注射IE2腺病毒载体疫苗后14天检测脾脏中T细胞的活化情况，结果如图16所示。由图16可以看出蛋白疫苗能够刺激T细胞活化并分泌IL2，IFN-γ，TNFα，IL4及IL6。于小鼠体内三次注射IE2重组蛋白疫苗后14天检测脾脏中T细胞的活化情况，结果如图17所示，由图17可知，蛋白疫苗能够刺激T细胞活化并分泌IL2。
实施例5疫苗对神经胶质瘤的治疗效果
IE1腺病毒载体疫苗对神经胶质瘤的治疗效果。
注射一针IE1腺病毒载体疫苗及IE1蛋白疫苗后对小鼠进行颅内荷瘤，结果如图18所示，由图18可知肿瘤体积显著变小。
IE2腺病毒载体疫苗对神经胶质瘤的治疗效果。
注射一针IE2腺病毒载体疫苗及IE2蛋白疫苗后对小鼠进行颅内荷瘤，结果如图19所示，由图19可知肿瘤体积显著变小。
实施例6
野生型IE促进肿瘤细胞增殖能力并抑制肿瘤细胞的凋亡能力，而突变型IE可逆转此种趋势(图20所示)。由图20可知，CCK8增殖实验显示，野生型IE1及IE2可以促进细胞的增殖能力。细胞凋亡实验显示野生型IE1及IE2可以抑制细胞的凋亡。然而，突变型的IE1及IE2皆可以逆转野生型IE1及IE2对细胞增殖及凋亡能力的调节。
实施例7
突变型IE可逆转野生型IE对细胞周期的阻滞(图21所示)。
由图21可知，细胞周期实验显示野生型IE1可以引起细胞G0/G1期阻滞，而且野生型IE2可以引起细胞S期及G2/M期的阻滞。然而，突变型IE1及IE2皆可以逆转野生型IE1及IE2对细胞周期阻滞的能力。
因此，本发明采用上述的基于人巨细胞病毒编码即刻早期蛋白IE的疫苗，能够识别和消灭脑部癌细胞，可广泛应用于制备治疗胶质瘤的药品。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.基于人巨细胞病毒编码即刻早期蛋白IE的疫苗，其特征在于，包括如下的一种：
IE1腺病毒载体类疫苗；
IE2腺病毒载体类疫苗；
IE1重组蛋白类疫苗；
IE2重组蛋白类疫苗；
其中野生型IE1的突变体IE1-mut的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，野生型IE2的突变体IE2-mut的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的基于人巨细胞病毒编码即刻早期蛋白IE的疫苗的制备方法，其特征在于，IE1腺病毒载体类疫苗或IE2腺病毒载体类疫苗的制备方法包括以下步骤：
1)细胞培养；
2)腺病毒包装。
3.如权利要求1所述的基于人巨细胞病毒编码即刻早期蛋白IE的疫苗的制备方法，其特征在于，IE1重组蛋白类疫苗或IE2重组蛋白类疫苗的制备方法包括以下步骤：
1)设计引物，通过PCR扩增出目的基因；
2)用BamHI-HF对质粒载体进行酶切，线性化；
3)将目的基因同源重组入线性化载体；
4)转化；
5)挑取步骤4)中的转化子进行菌落PCR鉴定；
6)人巨细胞病毒突变型即刻早期蛋白IE大肠杆菌表达。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中目的基因的扩增引物为F1和R1、F1-2和R1-2，F1的序列如SEQ ID NO.3所示，R1的序列如SEQ ID NO.4所示，F1-2的序列如SEQ ID NO.7所示，R1-2的序列如SEQ ID NO.8所示。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)的具体操作为：将目的基因片段和线性化载体以摩尔比2：1加到试管中进行重组反应，混匀后42℃孵育30分钟，然后转移到冰上，放置2-3分钟后取10uL反应液体转化到感受态细胞中。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)的具体操作为：取感受态细胞于冰上，待溶解后加入10μL连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟；
a、将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90秒；
b、快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟；
c、每管加900μL LB培养液，然后将管转移到37℃摇床上，温育1小时使细菌复苏；
d、取恰当量的转化菌液涂布于LB琼脂平板上，平板上含表达载体相应的抗生素；
e、倒置平板，于恒温培养箱中37℃培养，16小时。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤5)中菌落PCR鉴定所需的引物为F2和R2、F2-2和R2-2，F2的序列如SEQ ID NO.5所示，R2的序列如SEQ ID NO.6所示，F2-2的序列如SEQ ID NO.9所示，R2-2的序列如SEQ ID NO.10所示。
8.如权利要求1所述的基于人巨细胞病毒编码即刻早期蛋白IE的疫苗在制备治疗胶质瘤药品中的应用。
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