CN117248003A - 用于完整端粒扩增子测序的组合物、预文库及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开用于完整端粒扩增子测序的组合物、预文库及其构建方法。本发明设计了一种端粒特异性温控锚定接头，为端粒添加该接头时，能够区分和富集完整端粒末端，并避免非完整末端被建库。此外，本发明在端粒序列附近的基因组序列上还设计了针对端粒扩增使用的端粒特异性PCR引物，在连接接头后不需要进行酶切处理，同时也不需要再在片段两端添加通用接头，进一步简化了实验流程。
Description
技术领域
本发明涉及基因测序，具体地涉及用于完整端粒扩增子测序的组合物、预文库及其构建方法。
背景技术
端粒是位于真核生物线性染色体末端，由端粒DNA重复序列和相关蛋白质构成的复合物。由于线性染色体的DNA复制机制，使得细胞的每次分裂导致端粒缩短。端粒的变化与多种疾病密切相关，如癌症、早衰综合征等。因此尽可能准确的对端粒进行检测可以提供与疾病相关的重要信息。
由于端粒序列较长，且其中含有大量6碱基简单重复序列，人端粒序列的重复单元为TTAGGG(forward strand)/CCCTAA(reverse strand)，总长度约2kb-20kb，使用二代测序(NGS，代表平台为Illumina、MGI)无法测通，只能使用针对长片段测序方法(比如纳米孔测序技术)对长度在5kb以上的片段进行序列测定。
在上述测序中的常规建库方法依然存在无法区分完整端粒末端和基因组断裂端点的问题，由于基因组在提取过程中会造成大量断裂端点，此外还会存在一定量的不完整端粒末端，数量远远多于完整的端粒末端，常规的端粒建库方式无法有效地对其进行区分，将会导致这一类的建库方法无法对完整或长片段端粒序列进行有效富集，长片段端粒序列占比极低，短片段偏好严重，导致文库有效数据占比低下，会造成测序数据量的极大浪费，同时也极易导致纳米孔测序失败，很难测到准确的端粒序列和真实的长度分布状态，严重影响后续分析和解读。
此外，由于三代测序等长片段测序平台的芯片孔数限制，常规建库方法直接建库很难测到端粒序列，很难通过加大数据量来弥补，因此测序时多在带有接头的文库基础上，使用设计的端粒特异性引物和文库接头上的另一条引物进行PCR扩增，进行端粒序列的富集，但因为提取时产生的断点数量较多，还有大量的不完整端粒末端，造成富集效率较低，测到的端粒序列很少，无法有效进行端粒序列测定。另外，存在多个染色体末端序列未确定，也存在染色体的末端序列不能找到理想的引物序列，因此该方法也有局限，只能测定部分染色体的端粒序列，且其比例异常。
目前仍需要一种用于完整端粒扩增子测序的组合物、预文库及其构建方法。
发明内容
针对现有技术中存在的至少部分技术问题，发明人设计了一系列端粒特异性接头，为端粒添加接头时，能够区分和富集完整端粒末端，并避免非完整末端被建库。同时，本发明在端粒序列附近的基因组序列上设计了针对端粒扩增使用的端粒特异性PCR引物。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种用于完整端粒扩增子测序的组合物，其包括用于扩增端粒相邻区域的引物和端粒特异性温控锚定接头，所述端粒特异性温控锚定接头包括引物结合区、单碱基重复区和端粒特异性锚定区，所述端粒特异性锚定区能够与端粒3’端悬臂的至少部分特异性结合。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其中，所述用于扩增端粒相邻区域的引物包括SEQ ID No.1-12所示序列中的至少一种外侧引物和SEQ ID No.13-24所示序列中的至少一种内侧引物序列。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其中，所述单碱基重复区与所述端粒特异性锚定区两部分的Tm值(本文有时也称为T1)比所述单碱基重复区的Tm值(本文有时也称为T2)高至少5℃以上。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其中，所述端粒特异性锚定区的长度为4-10nt，优选6nt。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其中，所述端粒特异性锚定区的序列能够与重复单元为TTAGGG的序列特异性结合。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其中，所述端粒特异性锚定区的序列选自CCCTAA、ACCCTA、AACCCT、CCTAAC、TAACCC和CTAACC中的至少一种。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其中，所述单碱基重复区的Tm值(即T2)为37℃以下。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其中，所述单碱基重复区的长度为5-20nt。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其中，所述引物结合区对应的引物序列的Tm(即T3)值在55℃-70℃之间。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其中，所述引物为巢式PCR引物。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其中，所述引物结合区包含至少1条引物的结合区。
本发明的第二方面，提供一种用于完整端粒扩增子测序的预文库构建试剂或试剂盒，其包含第一方面所述的组合物。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于完整端粒扩增子测序的预文库构建试剂或试剂盒，其进一步包括用于扩增端粒相邻区域的引物。
本发明的第三方面，提供一种用于完整端粒扩增子测序的预文库构建方法，其包括以下步骤：
(1) 制备末端添加单碱基重复序列的样本片段；
(2) 使所述样本片段与本发明所述的端粒特异性温控锚定接头混合，在第一温度下预变性，然后在第二温度下杂交，其中，所述末端添加的单碱基重复序列与单碱基重复区的序列互补；
(3) 在第三温度下利用聚合酶将接头的3’端延伸补平缺口，并将未与接头互补的末端单碱基重复序列部分去除，并用连接酶将延伸后的接头3’端与端粒双链部分的反向链5’端连接，由此完成接头的添加；
(4) 使用本发明所述的组合物中的用于扩增端粒相邻区域的引物和用于扩增端粒特异性温控锚定接头的引物进行扩增，得到所述用于完整端粒扩增子测序的预文库；
其中，所述第一温度高于T1，所述第二温度大于第三温度并且为T1以下。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于完整端粒扩增子测序的预文库构建方法，其中，所述第一温度为50-90℃，所述第二温度为37±5℃。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于完整端粒扩增子测序的预文库构建方法，其中，步骤(4)中的扩增包括：
a. 使用本发明所述的组合物中的用于扩增端粒相邻区域的外侧引物和用于扩增端粒特异性温控锚定接头的外侧引物进行第一扩增；和
b. 使用所述的组合物中的用于扩增端粒相邻区域的内侧引物和用于扩增端粒特异性温控锚定接头的内侧引物进行第二扩增。
本发明的针对人类完整的端粒末端序列进行测序的温度控制锚定接头以及预文库高效地富集了完整端粒末端序列，能够有效地对其进行序列测定，更真实准确地展示各染色体端粒长度的分布状态，实现更准确的关联分析和解读。此外，本发明在端粒序列附近的基因组序列上还设计了针对端粒扩增使用的端粒特异性PCR引物，在连接接头后不需要进行酶切处理，同时也不需要再在片段两端添加通用接头，进一步简化了实验流程。
附图说明
图1为本发明的用于完整端粒扩增子测序的接头、预文库及构建方法示意图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在以下关于序列的描述中，除非另有说明，序列的方向为5’-3’。
用于完整端粒扩增子测序的组合物
本发明提供一种用于完整端粒扩增子测序的组合物，其包括用于扩增端粒相邻区域的引物和端粒特异性温控锚定接头。用于扩增端粒相邻区域的引物是针对端粒序列附近的基因组序列上端粒进行扩增所使用的端粒特异性PCR引物。在优选的实施方案中，用于扩增端粒相邻区域的引物选自以下的至少一种或组合：SEQ ID No.1的外侧引物和SEQ IDNo.13的内侧引物、SEQ ID No.2的外侧引物和SEQ ID No.14的内侧引物、SEQ ID No.3的外侧引物和SEQ ID No.15的内侧引物、SEQ ID No.4的外侧引物和SEQ ID No.16的内侧引物、SEQ ID No.5的外侧引物和SEQ ID No.17的内侧引物、SEQ ID No.6的外侧引物和SEQ IDNo.18的内侧引物、SEQ ID No.7的外侧引物和SEQ ID No.19的内侧引物、SEQ ID No.8的外侧引物和SEQ ID No.20的内侧引物、SEQ ID No.9的外侧引物和SEQ ID No.21的内侧引物、SEQ ID No.10的外侧引物和SEQ ID No.22的内侧引物、SEQ ID No.11的外侧引物和SEQ IDNo.23的内侧引物、SEQ ID No.12的外侧引物和SEQ ID No.24的内侧引物。
本发明中，端粒特异性温控锚定接头可用于端粒，特别是长片段端粒，尤其是人类完整端粒末端序列的碱基序列分析。本发明中，特异性是指该接头能够特异性锚定(或结合)至完整端粒末端，温控锚定是指通过控制反应过程中的温度来实现接头与端粒的特异性结合。
本发明的端粒特异性温控锚定接头包含引物结合区、单碱基重复区和端粒特异性锚定区，所述端粒特异性锚定区能够与端粒3’端悬臂的至少部分特异性结合。本发明所用术语“特异性结合”、“锚定”、“互补”和“杂交”可互换使用，其指两个核苷酸之间配对的能力。即，如果在核酸的给定位置处，核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸氢键键合，那么这两个核酸被认为在该位置处与彼此互补。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，也可以是完全的。
本发明的“特异性杂交”是指在限定的严格条件下，与存在于杂交混合物中的其他核苷酸序列的基本结合不存在时，核酸与靶核苷酸序列的结合。本领域技术人员可以理解，适当的杂交条件允许序列错配的存在。在具体实施方案中，在严格杂交条件下进行杂交。
本发明的端粒特异性温控锚定接头的三个区域各自具有合适的Tm值，从而在用于预文库构建时区分和富集完整端粒末端，并避免非完整末端被建库。优选地，单碱基重复区与端粒特异性锚定区两部分的Tm值(本发明有时也称为T1)比单碱基重复区的Tm值(本发明有时也称为T2)高至少5℃以上，还优选6℃以上，进一步优选7℃以上，更优选8℃以上，例如可以高至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20℃或以上。
在一个优选的实施方案中，T1高于37℃以上，优选38℃以上，进一步优选39℃以上，更优选40℃以上，例如41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、65℃或以上。T2为37℃以下，优选36℃以下，进一步优选35℃以下，更优选34℃以下，例如33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20℃或以下。
本发明中，单碱基重复区中的碱基不特别限定，可以根据后续预文库构建时为片段末端添加的碱基进行调整，优选该碱基的个数与后续预文库构建时为片段末端添加的碱基个数相同，以实现核酸分子中互补配对时碱基以氢键互补锁定。因此，单碱基重复区可以是选自以下任意一种碱基的重复：腺嘌呤(Adenine，A)、鸟嘌呤(Guanine、G)、胸腺嘧啶(Thymine，T)和胞嘧啶(Cytosine，C)。碱基的数量优选为5-20nt，还优选为5-18nt，进一步优选为6-15nt，更优选为8-13nt，例如8、9、10、11、12、13个碱基重复。
本发明的端粒特异性温控锚定接头的端粒特异性锚定区能够与端粒3’端悬臂的至少部分特异性结合。本发明所用术语“悬臂(overhang)”有时也可以称为悬突、悬端等，其是指位于端粒双链中3’端向外侧突出延伸形成的一段单链核苷酸序列。完整的端粒末端通常存在6-300碱基长度的单链“3’ overhang”，其单链部分的重复单元与端粒双链部分完全一致。虽然本发明仅示例性的以6碱基TTAGGG设计了相应的一系列端粒特异性锚定接头，但本领域技术人员能够根据本发明的教导设计其它端粒特异性锚定接头。
在一个优选的实施方案中，本发明的端粒特异性锚定区能够与端粒3’端悬臂的至少3个碱基的区域，优选4个碱基，还优选5个碱基，更优选6个碱基，例如7、8、9、10、11、12或以上的碱基特异性结合。
在一个优选的实施方案中，端粒特异性锚定区的长度为4-10nt，还优选为5-8nt，例如5、6、7、8nt。在具体实施方案中，所述端粒特异性锚定区的序列选自CCCTAA、ACCCTA、AACCCT、CCTAAC、TAACCC和CTAACC中的至少一种。
在示例性的实施方案中，本发明的端粒特异性温控锚定接头包含SEQ ID No.25-30所示的核苷酸序列。
本发明的端粒特异性温控锚定接头的引物结合区含有引物结合位点。在一个优选的实施方案中，引物结合区含有1条引物的结合位点。在另一个优选的实施方案中，引物结合区含有2条引物的结合位点。引物结合区对应的引物的Tm值(本发明有时也称为T3)在55℃-70℃之间，优选55-68℃之间，还优选57-65℃之间，例如57、58、59、60、61、62、63、64、65℃。优选地，本发明温控锚定接头的引物的结合位点为巢式引物的结合位点，相较于单一的引物结合位点，设置2条巢式引物的结合位点时能够显著去除背景噪音，从而进一步富集完整端粒序列。
在一个优选的实施方案中，端粒特异性温控锚定接头的引物结合区所对应的巢式引物包括第一引物(外侧引物)和第二引物(内侧引物)，第一引物的序列如SEQ ID No.31所示(GACTGGTCCATATGACTTGC)，第二引物的序列如SEQ ID No.32所示(GCATATGGCATTCTGTCATCC)。
本发明的温控锚定接头可用于待测样本中核酸的扩增和富集，“扩增”包含通过其复制了至少一种靶核酸的至少一部分的任何方法，典型地以模板依赖性的方式，包括且不限于用于线性地或指数地扩增核酸序列的技术。用于进行扩增步骤的非限制性方法包括连接酶链式反应(LCR)、连接酶检测反应(LDR)、聚合酶链式反应(PCR)、引物延伸、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)、基于核酸链的扩增(NASBA)、多重扩增、滚环扩增(RCA)等。
本发明所用的术语“样本”涉及包含一种或多种所感兴趣的分析物的材料或材料混合物，通常但不一定为液体形式。本发明的样本含有核酸样本，核酸样本可以是复杂样品，其包含多种不同的含有目的序列的分子，这样的样本可具有多于10、50、100或200个不同的核酸分子。
本文中，核酸样本包括DNA片段，DNA片段可源于任何来源，例如基因组DNA、cDNA(来自RNA)、cfDNA、ctDNA或人工DNA构建体或人工片段化DNA片段。本文可以采用含有DNA片段(例如基因组DNA)的任何样品，包括但不限于血液、组织样品或FFPE样品。优选地，本发明中基因组DNA片段源自人基因组DNA。
基因测序用预文库构建试剂或试剂盒
本发明还提供一种用于完整端粒扩增子测序的预文库构建试剂或试剂盒，特别是用于人类端粒基因测序用预文库构建试剂或试剂盒，其包含上述的组合物。
在一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒进一步包括用于扩增端粒特异性温控锚定接头的引物。优选地，用于扩增端粒特异性温控锚定接头的引物具有SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示的核苷酸序列。
除了上述组分，本发明的试剂盒可选地包括用于巢式PCR或高通量测序用试剂。用于巢式PCR反应的试剂包括那些常规PCR使用的任何试剂，例如聚合酶、缓冲液等。
除了上述组分之外，本发明的试剂盒还可包括与调控制造、使用或销售试剂盒相关的注意事项。另外，本发明的试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地设置在适合的优选用于以高通量设置的机器人操作的装置中。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液状态存在的情况下，这些成分的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，例如组分的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。
在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，该试剂盒还通常会包含可单独放置另外的组分的第二、第三或其它另外的容器。另外，可在容器中包含各多种组分的组合。本文所述的任何组合或试剂可为试剂盒中的组分。
预文库构建方法
本发明提供一种用于完整端粒扩增子测序的预文库构建方法，其包括使用本发明的组合物的步骤，下面进行详细说明。
步骤(1)
在步骤(1)中，首先制备末端添加单碱基重复序列的样本片段。样本片段包含末端携带3’ overhang的完整端粒以及不含有3’ overhang的非完整端粒或其它基因组片段。可以根据需要选择单碱基作为加尾的底物，在优选的实施方案中，本发明选择dATP并使用末端转移酶TdT对所有片段末端进行加A尾(多个A碱基)。反应条件不特别限定，可以根据实际需要进行调整。优选地，反应温度为30-45℃，优选32-40℃，还优选37℃。反应时间为5-60分钟，优选10-30分钟。
本发明的步骤(2)为连接端粒特异性温控锚定接头的步骤。首先在第一温度下预变性，预变性的温度不宜过高或过低，过高会导致双链部分解链，过低则可能导致后续杂交的效率降低。优选地，预变性温度为50-90℃，还优选为50-60℃，例如50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60℃。
本发明的步骤(2)中，使单链温控锚定接头与加polyA尾的端粒3’端悬臂部分在第二温度下杂交并充分结合。在一个优选的实施方案中，第二温度不低于第三温度，且不高于接头设计时“单碱基重复区与所述端粒特异性锚定区”的Tm值。优选地，第二温度为37-42℃，最优选为37℃。此时，单链温控锚定接头只能与完整的端粒末端结合，而其他片段和不完整的端粒末端都无法与其结合，因为完整的端粒末端的锚定碱基和polyA部分均可与接头互补结合，可以保证结合稳定性，其他片段只有polyA部分可与接头互补结合，在杂交和孵育温度控制下，除完整端粒末端可以稳定结合接头，其他片段的结合部分其Tm值低于30℃，明显低于反应温度而无法有效结合，从而降低背景片段加接头效率，而达到整体降低背景噪音和进一步富集完整端粒序列的目标。
在本发明的步骤(3)中，在第三温度下利用聚合酶，优选T4 DNA聚合酶将接头的3’端延伸补平缺口，同时通过其3’-5’外切酶活性将多余的polyA(不与接头互补的polyA部分)去除。完成后，通过T4 连接酶将延伸后的接头与端粒双链部分反向链(Reversestrand)的5’端连接，从而完成接头的添加。
本发明中，第三温度为30-45℃，优选32-40℃，例如32、33、34、35、36、37、38、39、40℃。
在本发明的步骤(4)中，使用组合物中的用于扩增端粒相邻区域的引物和用于扩增端粒特异性温控锚定接头的引物进行扩增，得到用于完整端粒扩增子测序的预文库。优选地，使用本发明所述的组合物中的用于扩增端粒相邻区域的外侧引物和用于扩增端粒特异性温控锚定接头的外侧引物进行第一扩增。随后，使用所述的组合物中的用于扩增端粒相邻区域的内侧引物和用于扩增端粒特异性温控锚定接头的内侧引物进行第二扩增。具体参见图1所示。
本发明的预文库适合在长片段测序平台进行测序，包括但不限于OxfordNanopore Technologies(ONT)公司的Nanopore、Pacific Biosciences(PacBio)公司的Sequel II等。本领域技术人员将理解，依据测序平台对应的试剂盒的操作说明，在添加含index序列的测序接头后可以进行高通量测序过程。
需要注意的是，在本发明的步骤(1)-(4)前后，或步骤之间还可包含其他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法。例如在每个步骤完成之后进一步对产物进行纯化的步骤。
实施例
以下示出了使用本发明设计的端粒特异性温控锚定接头和端粒特异性PCR引物用于人类完整的端粒扩增子测序的步骤。
一、样本信息
本实施例使用的样本为选用EDTA抗凝管采集的全血样本，4℃短期保存，-20℃长期期保存(人类的其他DNA亦可用于实验，比如从组织、口腔拭子、各种体液，只要保存条件较好的样本中提取的基因组DNA均可用于本发明)。
二、实验步骤
1. DNA提取
颠倒混匀全血样本后吸取200µl至1.5ml离心管中，使用Magbead Blood DNA Kit(CW2361S)，参照试剂盒说明书步骤进行基因组DNA提取。提取后的基因组DNA使用Nanodrop2000和Qubit® DNA HS Assay Kit及Qubit3.0 Fluorometer进行定量，Qubit浓度为265ng/µl，OD260/280=1.827。进行琼脂糖凝胶电泳，基因组DNA片段主要分布≥23kb。
2. 端粒3’单链末端添加polyA尾
在新的0.2ml PCR管中配制反应体系Mixture 1，试剂在冰上配制，具体见下表1：
表1
混匀并离心，PCR仪37℃反应20分钟(热盖50℃)。立即使用90µl (1.8×) VHATSDNA Clean beads(N411-02)进行纯化，20µl无核酸酶水回溶得到产物1。
3. 连接Adapter12T接头
Adaptor12T-Mixture(0.1µM)由6条引物等摩尔量混合后稀释而成(引物Adaptor12t-1至Adaptor12t-6，序列如SEQ ID No.25-30所示)。
在新的0.2ml PCR管中配制反应体系Mixture 2，试剂在冰上配制，具体见下表2：
表2
PCR仪60℃反应10min，42℃反应10min，37℃反应20min(热盖70℃)。然后在Mixture 2中加入1µl T4 DNA Polymerase(5U/µl)，吸打混匀。
PCR仪37℃反应10min(热盖off)，然后立即转移反应管至冰上。
Mixture 3需提前配置，试剂在冰上配制，具体见下表3：
表3
将准备好的Mixture3加入之前完成反应后转移至冰上的反应管中，轻缓吸打混匀。
PCR仪16℃反应2h(热盖off)。然后使用90µl (1.8×) VHATS DNA Clean beads(N411-02)进行纯化，20µl无核酸酶水回溶得到产物2。
4. PCR扩增
4.1 以下为本发明设计的端粒特异性PCR引物组合(方向5’-3’)：
P1-Outer：GCATCTCTAGTGCTGGAGTGGATGG(SEQ ID No.1)；
P2-Outer：CCACCTAGGCCAATCCACTG(SEQ ID No.2)；
P3-Outer：TTCTGTCCTGGGATACTCCACATC(SEQ ID No.3)；
P4-Outer：GAAGATTTGAGGTGCAGTAGTGGG(SEQ ID No.4)；
P5-Outer：ACGGAGTTTCGCTCTTGTTGC(SEQ ID No.5)；
P6-Outer：TACCAGAGTGGATTCGGATTGA(SEQ ID No.6)；
P7-Outer：CACATAGCACGGATAAGGAGGACA(SEQ ID No.7)；
P8-Outer：CTTCCCAACATTCTCATGCTCT(SEQ ID No.8)；
P9-Outer：GGGTGTTGGGATCGCTGGTACAGA(SEQ ID No.9)；
P10-Outer：AGCCCAAGCATTATCTCCAGG(SEQ ID No.10)；
P11-Outer：GCCACCATATCATACTCGGAAGG(SEQ ID No.11)；
P12-Outer：CGGTGCAAATCAAGTTCCGAAGG(SEQ ID No.12)；
P1-inner：TGAGGAGGTCCCACAAGGCTAA(SEQ ID No.13)；
P2-inner：GGACACGGGAAGTCTGGGCTAA(SEQ ID No.14)；
P3-inner：AGTTTGCCTTCTCCAGTGTCTCAT(SEQ ID No.15)；
P4-inner：AGCACAGTAGACAAGGGTAAGGTT(SEQ ID No.16)；
P5-inner：CAATCTCGGCTCACCATAACC(SEQ ID No.17)；
P6-inner：CAATCAGCCCACTCCTCCCTA(SEQ ID No.18)；
P7-inner：CGTAGACAAGCGGGTCCTGTAGTT(SEQ ID No.19)；
P8-inner：AACCACAAGGCTTAGACATTCG(SEQ ID No.20)；
P9-inner：TGAAGCGGGAAGGCTGGACACC(SEQ ID No.21)；
P10-inner：GTGTCGGAGGTGATTTCATAGTTG(SEQ ID No.22)；
P11-inner：ACTGCTCCCTTTGCCACGAT(SEQ ID No.23)；
P12-inner：CCTCCCAGACCCACGACTCACA(SEQ ID No.24)。
4.2端粒特异性PCR引物及扩增的端粒区域关系，见下表4：
表4
扩增区域中的E 为chromosome end；S为chromosome start，例如10E为chr10，end；XS为chrX，start。
4.3 第一轮PCR
使用TaKaRa LA Taq® with GC Buffer(TaKaRa，RR02AG)，在1个新的0.2ml PCR管中配制反应体系，具体见下表5：
表5
按照下表程序进行PCR反应，得到产物3，见下表6：
表6
4.4第二轮PCR
使用TaKaRa LA Taq® with GC Buffer(TaKaRa，RR02AG)，在1个新的0.2ml PCR管中配制反应体系Mixture 4，具体见下表7：
表7
按照下表程序进行PCR反应，然后加入30µl (0.6×) VHATS DNA Clean beads进行纯化，30µl无核酸酶水回溶得到产物4，见下表8：
表8
5. 端粒片段筛选
通过琼脂糖凝胶电泳对回溶产物进行≧2Kb片段筛选，使用Gel Extraction Kit(OMEGA，D2500-02)进行回收，得到片段筛选产物。
6. Nanopore预文库构建及上机测序
将经过片段筛选的富集端粒片段使用PCR Barcoding Kit(Nanopore，SQK-PBK004)进行预文库构建及上机测序。
以下为使用本方法进行测序得到的一条端粒序列实例，1st PCR时使用的端粒特异性扩增引物为P1-Outer、2nd PCR 时使用的端粒特异性扩增引物为P1-inner，如SEQ IDNo.33所示：
GTTGTACTTCGTTCAGCCCCTCAAGATTTGGGTATGGATGACCTTCTCGTGACAAAGAAAGTTGTCGGTGTCTTTGTGTTTCTGTTGGTGCTGATATTGCAGCGTCTGCTTGGGTGTGTTAACCTTGGGAGGTCCCACAAGGCT AAGTGGGGCAGAGTCAGGGACCTAAGGCAGTAGCAGGAAAACCAGGAAAACAAGCATAGACACAGACAGAGCCGGAATGTGAAGAAGTCAAAATAAATTCCCTGCTGGGACTCTTAGGCTGTTTTCATGCACTATGAACCTCCTCCTATTTTCCTACAATAAGCTCTACACTGTATTTCTTTTCCAATGAAGTTATCTTCCATCTTTGTACTGCCTCTTGGTGAAAAATCTTTCTTCCAAGTTAATAACTGGGACATCAGCTCTCCCCAGTAGCTCCTTTTCAGTTTAAATTTACAGAACTGATGGGGATTAATAACTGGCGCTCTGACTCTAAGTGGTGCAGGAGGCGGCCAGTAGGGGACATAGCCACCGTGCCACCGGGAGCAAAAGAGGGCCTGGCAGATCCCCATCTGCTGCGGCGTGCAGCCGACCGGGTGTCAGCAAGAGGGCCCGGCAGTGTCCCTGGCTGCCCGGCAGAGACGAACAACGACTACACTGTGAGCAAGAGGGGCCCTGCAGTGTCCTTAGCTGCGGAGGTGGCGTAGGGGCACCACACCATGAGCAAGAGGACCGTGCAGTGCCCTGGTTGCCAGCAGGACGTGCTGCCCACTACACTGGGCAAGAGGATCTGTAGTGCCCCCAGGCAGAAGAGGGCGTGCCCCGACTACACTGCAAGCAAGAGGCCCGGCAGTGTCCCCAGCTGCCAGCAGAGGCAGCGCCACTACACCTGGAGGCAAGAGGGCCCGGCAGTGTCCCCAGCTGCCAGCAGGCAGGTGTGCTGCCACACAGTAGCAGGCAAGGGCCCTGCAATGTCTGGCTGGCTGGGCGGCGTGCCTGTTATACTGCGAGCAGAGAGCCCTGCCGTGCCCCGTCGCCAGCAGAAGCACTGGACACCACTGTGAGAAGAGGGCCCCTGAAGTTGCCCTAGTCGCCAGCAGAAGGCCTGTGCTGGCGCCGTGGGCAAGCAGGTCCTGTAATTCTTGAGGTACAAGCGGGGGACACTTGAACCGGAGTTTTCCAGTTACTCAGGTTCCACCCGTCTGTGCGCTGCGCCGCCGGGGACGTGTGTCTCTGCCGTCGCACCTCGCCATTCCGCGCTCGCCGGCGGCGCCGCAGCTGTGCACCTGCCTTACGCCCGCCACCCTGGGCAACGATGCGTCCTCTGCGCCTGCGCCGCGCCGCGCCTCACTCCCGCTAGCAACGACCCTCCCCTCCGGGGACGCGGAGGCGATGATCTATGCCCTGCTGCGGACAGCTCCTGCGCCGGCGCGGCGCGCCTCTCACGCCGGCGCCGGCGCCGATGCTACCAGGCGGGTGGGTTCTCCTCAGCACAGACGCGGAGAGCATCGCGAGACGGAGCTGCGTTCATCTGCGCGGATTTCGGTGGTGCCGGGCTGGACGGGGTTCTCCTCCGGGTCCAGACCCGGGCGGGCGGGCTGAGGGCACCGCGAGGCGGAGCTGCGTTCTCTTAGCACAGACCTGGAGACACCGTAAAAGTGAGCAGCATTCTCTAAGCACAGACAGGTAGAGGCTTCATACAGCTTTAGAACAACTCAGGCCGCATCGACAGGTGAATAAAATCTTTCCCGGTTGCAGCCGTTAATAATCAAGGTCAGACCAGTTAGAACAGTTTAGTGTGGAAAACAGGGAAACCAAAGCCCCCTCTGAATCCTGCACCAAGATTCTCCAAGTCAAGACGAGGGGCTGCATTGCTGAGAACCCAACTGCAGTGTCTGAACACAAATGCAGCATTCTAATGCACATGACACCAAAATATAACCCACATTGCTCATGTGGTTTAGGGTTAGGGTGTGAAGGTGAGGTGAGGTCAGGGGTCAGGGAGTCAGGGGTCAGGAGGTCAGGGCCGGGGTCGGGAGTTAGGGTTGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTGGGGTGAGGGTTAGGGTGAGGTGAGGGTGAGGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTTAGAGGGTCCAGGGTGAGGGTCAGGGTGAGGTCCAGGGTGAGGGTCAGGGTCAGGGTCAGGGTCAGGGTCAGGGTCAGGGGTCAGGGTTAGGTTAGGGTTATAGGGTAGGGTTAGGGTTGGGTTGGGGTTAGGGTTTAGGAGTTAGAGGTCAGGGGTCAGGGCAGGTGCAGGGTTGGGTTGGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTCTGGGGTCAGGGGGTCAGGGTCCAGGTCAGGTCAGGTAGGGTTAGGGTTAGGAGTTGGGTTAGGGTTTAGGGTTAGGGTTAGGTTGGAGTTAGAAGGTCCAAGTAGAGGGTGAGGGTCAGAGGTGAGGGGTCAGGGTGAGGGTCAGGTCGAGTTAAGTTAAGTCAAATTAATTAGATTAAGGTTGATTCAAAGTTCGGTAGGGTTAGGGTTAGAGGTCAGGGTTAGGGTTTAGTTAAAATTAGAAGGTCAGGTCAGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGGTTAGAAGTTGGGGTTAGGGGTTGGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTGGGGTTGGGGTTAGGGTTAGGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGAGTTAGGGTTAGGGTTAGGG……TTAGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTGAGGTTAGGAGTTGAGAGGGTTAGGGTTAGGGTTA GAAAAAAAAAAAGGATGACAGAATGCCATATGCAGGTTAAACACCAAGCAGACATGCCAATATCCAGCACCAACAGGCCAAAGACACTTGTTTCAGCTTTCTTG，其中省略号表示TTAGGG重复单元，位于5’端的横线标注的序列表示端粒特异性PCR内侧引物序列，位于3’端的横线标注的序列表示端粒特异性单链接头3’序列。
由于采用了温度控制，提高了接头添加效率和特异性，同时通过采用端粒特异性PCR内侧引物序列，有效避免了其他非端粒片段的扩增，与其他常规的建库方法比，本发明的方法可显著提高端粒序列占比。经实验测定，常规建库(Y接头)端粒序列占比为0.4%，采用本发明的方法端粒序列占比为19%-23%。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
Claims (10)
1.一种用于完整端粒扩增子测序的组合物，其特征在于，包括用于扩增端粒相邻区域的引物和端粒特异性温控锚定接头，所述端粒特异性温控锚定接头包括引物结合区、单碱基重复区和端粒特异性锚定区，所述端粒特异性锚定区能够与端粒3’端悬臂的至少部分特异性结合。
2. 根据权利要求1所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其特征在于，所述用于扩增端粒相邻区域的引物包括SEQ ID No.1-12所示序列中的至少一种外侧引物和SEQ IDNo.13-24所示序列中的至少一种内侧引物序列。
3.根据权利要求1所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其特征在于，所述单碱基重复区与所述端粒特异性锚定区两部分的Tm值比所述单碱基重复区的Tm值高至少5℃。
4.根据权利要求3所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其特征在于，所述单碱基重复区的Tm值为37℃以下。
5.根据权利要求1所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其特征在于，所述引物结合区对应的引物序列的Tm值在55℃-70℃之间。
6.根据权利要求5所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其特征在于，所述引物结合区包含至少1条引物的结合区。
7.一种用于完整端粒扩增子测序的预文库构建试剂或试剂盒，其特征在于，包含根据权利要求1-6任一项所述的组合物。
8.一种用于完整端粒扩增子测序的预文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 制备末端添加单碱基重复序列的样本片段；
(2) 使所述样本片段与根据权利要求1-6任一项所述的组合物中的端粒特异性温控锚定接头混合，在第一温度下预变性，然后在第二温度下杂交，其中，所述末端添加的单碱基重复序列与单碱基重复区的序列互补；
(3) 在第三温度下利用聚合酶将接头的3’端延伸补平缺口，并将未与接头互补的末端单碱基重复序列部分去除，并用连接酶将延伸后的接头3’端与端粒双链部分的反向链5’端连接，由此完成接头的添加；
(4) 使用权利要求1-6任一项所述的组合物中的用于扩增端粒相邻区域的引物和用于扩增端粒特异性温控锚定接头的引物进行扩增，得到所述用于完整端粒扩增子测序的预文库；
其中，所述第一温度高于所述单碱基重复区与所述端粒特异性锚定区两部分的Tm值，所述第二温度大于第三温度并且为所述单碱基重复区与所述端粒特异性锚定区两部分的Tm值以下。
9.根据权利要求8所述的用于完整端粒扩增子测序的预文库构建方法，其特征在于，所述第一温度为50-90℃，所述第二温度为37±5℃。
10. 根据权利要求9所述的用于完整端粒扩增子测序的预文库构建方法，其特征在于，步骤(4)中的扩增包括：
a. 使用权利要求1-6任一项所述的组合物中的用于扩增端粒相邻区域的外侧引物和用于扩增端粒特异性温控锚定接头的外侧引物进行第一扩增；和
b. 使用权利要求1-6任一项所述的组合物中的用于扩增端粒相邻区域的内侧引物和用于扩增端粒特异性温控锚定接头的内侧引物进行第二扩增。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117248003B (zh) | 2024-04-12 |
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