CN107164365A - 应用三代测序技术检测染色体端粒dna全长的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及应用三代测序技术检测染色体端粒DNA全长的方法。本发明公开了染色体端粒DNA的扩增方法，包括下列步骤：1)提取基因组DNA；2)将步骤1)的基因组DNA进行预处理；3)将步骤2)获得的预处理后的基因组DNA两端的末端添加扩增接头，得到带有扩增接头的基因组DNA；4)分别对步骤3)的带有扩增接头的基因组DNA序列和扩增接头序列设计引物对，对端粒DNA进行PCR扩增。本发明公开的检测染色体端粒DNA全长的方法能达到单碱基分辨率，弥补了特异性地准确测量单条染色体完整端粒DNA技术的空白。

Description

应用三代测序技术检测染色体端粒DNA全长的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及应用三代测序技术检测染色体端粒DNA全长的方法。
背景技术
端粒是位于真核细胞线性染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体，其作用是保护染色体DNA的末端，避免染色体DNA的降解、末端融合以及非正常重组等。在哺乳动物细胞中，端粒DNA由TTAGGG序列和AATCCC序列重复串联组成。由于DNA的末端复制问题，细胞的每次分裂都伴随着端粒DNA一小段序列的丢失。细胞的每次分裂都会伴随着染色体末端端粒的缩短，细胞也因此逐渐老化、直至丧失增殖能力而死亡。端粒长度的变化与多种疾病密切相关，如癌症、早衰综合征等。因此测量端粒长度能提供与疾病相关的重要信息。
目前测量端粒长度主要是基于qPCR的方法，对重复区段进行扩增，端粒DNA的片段越长，重复区段的拷贝数就多。但是这种方法只能检测所有染色体端粒重复区段长度的大概平均值，无法精确检测单独每一条染色体的端粒长度。而且由于染色体DNA其他部分也存在类似端粒DNA重复序列的结构，这部分序列也会影响qPCR对端粒长度的检测。从实验操作上来说，由于qPCR反应很容易受到其他条件影响，基于qPCR测量方法的定量结果稳定性不好，如果结果Ct值相差1，会导致端粒长度测量结果增加1倍。
因此，研发新的、更准确的测量端粒DNA长度的方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供的应用三代测序技术检测染色体端粒DNA全长的方法，能有效解决当前不能获得端粒DNA全长和准确测量单条染色体端粒DNA的技术缺陷。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明公开了染色体端粒DNA的扩增方法，包括下列步骤：
1)提取基因组DNA；
2)将步骤1)的基因组DNA进行预处理；
3)将步骤2)获得的预处理后的基因组DNA两端的末端连接扩增接头，得到带有扩增接头的基因组DNA；
4)分别对步骤3)的带有扩增接头的基因组DNA序列和扩增接头序列设计引物对，对端粒DNA进行PCR扩增。
作为优选，所述步骤2)的基因组DNA进行预处理为将所述基因组DNA的两端进行末端修复。
作为优选，所述步骤2)基因组DNA两端进行末端修复为将基因组DNA片段的末端补平，然后对基因组DNA的5’端进行磷酸化，以及将基因组DNA片段的3’端添加腺嘌呤dA。
更为优选，所述腺嘌呤dA为脱氧腺嘌呤dA。
作为优选，所述步骤3)的扩增接头还包括标签序列。
其中，所述步骤3)的扩增接头还包括标签序列，具体为所述扩增接头与所述标签序列重组后的新型扩增接头。所述新型扩增接头除了扩增接头外还包括标签序列。
其中，所述扩增接头直接与步骤2)的预处理后的基因组DNA连接，或所述扩增接头与所述标签序列重组后的新型扩增接头与步骤2)的预处理后的基因组DNA连接。
其中，所述步骤4)扩增得到的端粒DNA产物的序列包括端粒DNA序列和标签序列。
作为优选，所述步骤3)的扩增接头的标签序列为与人类基因组DNA比对的E Value大于1的序列，不会对后续分析造成干扰。
其中，所述标签序列用于区分不同人来源的染色体端粒DNA。
作为优选，为了能应用于大样本量的项目，所述步骤3)的扩增接头的标签序列为16个bp。
作为优选，所述步骤3)还包括将得到的带有扩增接头的基因组DNA进行纯化，以便获得高质量的带有扩增接头的基因组DNA。
作为优选，所述扩增接头为Y型接头、环状接头或线性接头中的一种。
更为优选，所述扩增接头为Y型接头。
其中，所述Y型接头为形状像Y，根部互补，其余部分不互补的DNA序列。
本发明还提供了一种染色体端粒DNA的扩增试剂盒，包括基因组DNA提取体系、基因组DNA预处理体系、扩增接头、扩增接头与基因组DNA连接体系和端粒DNA的PCR体系。
其中，所述基因组DNA提取体系用于提取人体基因组DNA；所述基因组DNA预处理体系用于对基因组DNA的末端进行补平，5’端磷酸化和3’端添加腺嘌呤dA；所述扩增接头与基因组DNA连接体系用于将所述扩增接头连接到所述预处理后的基因组DNA末端；所述端粒DNA的PCR体系用于扩增基因组DNA5’端和扩增基因组DNA3’端的端粒片段。
作为优选，所述基因组DNA预处理体系包括基因组DNA的末端补平体系、基因组DNA的末端磷酸化体系和基因组DNA的末端3’端进行添加腺嘌呤dA体系。
作为优选，所述基因组DNA的末端补齐体系为基因组DNA的平末端修复体系；所述基因组DNA的平末端修复体系包括T4DNA Polymerase或/和DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)。
作为优选，所述基因组DNA的末端磷酸化体系包括T4多聚核苷酸激酶。
作为优选，所述基因组DNA片段的3’端进行添加腺嘌呤dA体系包括Klenow(exon-)。
作为优选，所述扩增接头与基因组DNA连接体系包括连接酶。所述连接酶为T4DNA连接酶。
作为优选，所述扩增接头如SEQ ID No.1～SEQ ID No.31所示。
其中，所述基因组DNA预处理可以在一个反应中完成，或多个反应中完成。
作为优选，所述端粒DNA的PCR体系的引物对为基因组DNA的5’端非端粒区的引物和所述扩增接头的引物用于扩增基因组DNA的5’端端粒，或基因组DNA的3’端非端粒区的引物和所述扩增接头的引物用于扩增基因组DNA的3’端端粒。
其中，所述基因组DNA的5’端非端粒区的引物为5’基因组DNA的近端粒区的非端粒区引物；所述基因组DNA的3’端非端粒区的引物为3’基因组DNA的近端粒区的非端粒区引物。
其中，所述端粒DNA的PCR体系的引物对包括以下的可能(从5’到3’的单链DNA)：1、扩增接头序列的引物和近5’端的端粒的非端粒区基因组DNA反向互补引物；2、近3’端的端粒的非端粒区基因组DNA引物和扩增接头序列反向互补引物。
其中，与所述扩增接头互补配对的引物和所述近3’端的端粒的非端粒区基因组DNA引物，或近5’端的端粒的非端粒区基因组DNA反向互补引物和扩增接头上的引物的具体长度不做限定。
作为优选，所述端粒DNA的PCR体系包括预处理后带有扩增接头的基因组DNA、扩增端粒DNA的PCR引物对、PCR工具酶、dNTP和PCR反应缓冲液。所述引物对由接头通用PCR引物和端粒DNA特异性引物构成，所述通用PCR引物如SEQ ID NO.32所示，端粒DNA特异性引物如SEQ ID NO.33～SEQ ID NO.35所示。
本发明还公开了应用三代测序技术检测染色体端粒DNA全长的方法，包括下列步骤：
1))提取基因组DNA片段；
2))将步骤1))的基因组DNA片段进行预处理；
3))步骤2))获得的预处理后的基因组DNA片段两端的末端添加扩增接头，得到带有扩增接头的基因组DNA片段；
4))分别对步骤3))的带有扩增接头的基因组DNA片段的基因组DNA序列和扩增接头序列设计引物对，对端粒DNA进行PCR扩增；
5))将步骤4))的PCR扩增的端粒DNA构建三代测序文库后，将所述三代测序文库上机测序，得到测序数据。
本发明还提供了应用三代测序技术检测染色体端粒DNA全长的试剂盒，包括基因组DNA提取体系、基因组DNA预处理体系、扩增接头、扩增接头与基因组DNA连接体系、端粒DNA的PCR体系和三代测序文库构建体系。
其中，所述三代测序文库构建体系用于构建扩增的端粒DNA进行三代测序文库，
综上所述，本发明公开了染色体端粒DNA的扩增方法，该方法能特异性的扩增染色体端粒DNA的全长，而且，还能通过标签序列区分不同人的染色体端粒DNA，采用不同引物还能扩增不同染色体的端粒DNA，而且该扩增方法步骤简单，特异性强。
本发明还公开的应用三代测序技术检测染色体端粒DNA全长的方法能同时测量不同人、不同染色体的端粒DNA，所扩增的端粒DNA全长片段使用3代测序方法能准确测量端粒DNA序列长度。先富集基因组DNA的端粒后在测序端粒DNA序列，大大提高了测序端粒DNA的准确率和精度，而且还能降低成本。本发明公开的检测染色体端粒DNA全长的方法能达到单碱基分辨率，弥补了特异性地准确测量单条染色体完整端粒DNA技术的空白。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示应用三代测序技术检测染色体端粒DNA全长的方法介绍图；
图2示应用三代测序技术检测染色体端粒DNA全长的方法原理步骤说明图；
图3示应用三代测序技术检测染色体端粒DNA全长的方法的胶图，其中序号1为基因组DNA胶图(M为marker，1、2、3栏为样品1、样品2、样品3的基因组DNA)、序号2为预处理后基因组DNA连接扩增接头的胶图(M为marker，1、2、3栏为样品1、2、3中基因组DNA连接扩增接头后的DNA)、序号3为端粒DNA(M为marker，1、2、3栏为一号染色体、二号染色体和七号染色体端粒DNA片段)；
图4示Nanopore MinIon测序的GC含量分析，蓝色线是总的数据集，红色线是筛选过滤后的端粒DNA的reads；
图5示Nanopore MinIon测序的Reads的读长分析，蓝色线是总的数据集，红色线是筛选过滤后的端粒DNA的reads；
图6示端粒DNA中TTAGGG或者其互补序列AATCCC重复出现在reads中的次数；
图7示本发明的方法与对比例方法测量端粒DNA长度结果比较图，其中横坐标chr1、chr2和chr7为300例样品中一号染色体、二号染色体和七号染色体的端粒DNA全长分布；对比例方法为通过qPCR方法间接测量300例样品所有染色体端粒DNA的平均长度分布。
其中，chr1为一号染色体，chr2为二号染色体，chr7为七号染色体。
具体实施方式
本发明公开了应用三代测序技术检测染色体端粒DNA全长的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的应用三代测序技术检测染色体端粒DNA全长的方法，其中所用原料及试剂均可由市场购得。
实施例1
对中青年人和老年人的端粒DNA进行测序，具体方法如下：
选取150个在18～45岁的中青年人，男女各75个；选取150个60～90岁的老年人，男女各75个。提取150个中青年人和150个老年人组的基因组DNA，具体步骤如下：
1、提取上述人群中血液的DNA，做好标记；
2、使用试剂盒illustra DNA Extraction Kit PHYTOPURE(GE Nucleon RPN-8510)提取高质量大片段基因组DNA。对获取的300例样品的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA，如图1所示，1、2和3栏为样品1、2和3基因组DNA电泳图，基因组DNA片段基本分布在15k以上。
实施例2
对实施例1提取的基因组DNA处理，具体步骤如下：
1、测定实施例1基因组DNA浓度，对基因组DNA片段进行末端修复，将基因组DNA的末端补平、磷酸化，采用如下基因组DNA的末端补平、磷酸化体系(100μl)进行基因组DNA的末端补平、磷酸化：
将以上基因组DNA的末端补平、磷酸化体系混合后，22℃反应20min，柱式法纯化，50-100μl TE洗脱，得到混合物1。
2、对步骤1的混合物1获得的基因组DNA片段的3’端进行添加dA，采用如下加dA体系(100μl)进行：
将以上加dA体系完全混合后，置于37℃反应20min，柱式法纯化后，50-100ul TE洗脱，得到基因组DNA预处理后的基因组DNA片段。
实施例3
对实施例2经过基因组DNA末端修复、5’端磷酸化和3’端添加腺嘌呤dA的基因组DNA的末端连接带有标签序列的扩增接头，其中，标签序列设于扩增接头中，在本实施例中，标签序列的长度为16bp，使得扩增接头区分不同人的端粒DNA。
扩增接头序列可以为Y型、圆环型、线状型，本实施例使用Y型扩增接头，实施例1中150个中青年人和150个老年人总共有300个样品，分别设计300个标签序列制备的Y型扩增接头区分不同样品，本实施例只列举30个Y型扩增接头。
1、Y型扩增接头制备方法如下：Y型扩增接头由两条引物退火连接而成，Y型扩增接头的引物序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.31所示，引物组合方式如表1所示(扩增接头1由SEQ ID No.1与SEQ ID No.2退火连接而成；扩增接头2由SEQ ID No.1与SEQ ID No.3退火连接而成；扩增接头3由SEQ ID No.1与SEQ ID No.4退火连接而成，以此类推)，其中，SEQID No.2～SEQ ID No.31的引物5’端需要进行磷酸化修饰以提高连接效率，引物使用引物稀释液(10mM Tris-HCl，pH 7.5)稀释至终浓度为100μM。分别将两个引物取30μl等体积混合到200μl PCR管中，放置在PCR热循环仪中，通过以下程序参数形成Y型接头：
5minutes 95℃；
5minutes 72℃；
-0.1℃/s Drop Down to 20℃，保持5minutes；
Hold at 4℃。
表1 Y型接头统计表
2、Y型扩增接头与基因组DNA片段连接方法，具体步骤如下：
Y型扩增接头使用引物稀释液(10mM Tris-HCl，pH 7.5)稀释至终浓度为1.0μM。使用UltraTMLigation Module(NEB E7445L)试剂盒进行接头连接，按照试剂盒说明书制备体系；使用移液枪轻微吹打均匀反应体系，PCR管短暂离心，把反应体系液体收集到管底，并放入PCR热循环仪中，开启热盖45℃，20℃反应15minutes。
图中2表示基因组DNA与Y型扩增接头连接后的产物的电泳图，同样取了样品1、2、和3作为电泳图展示。
实施例4
对实施例3得到的带有扩增接头的基因组DNA片段进行纯化，具体步骤如下：
使用Agencourt AMPure XP(BeckMan Coulter,A63881)核酸纯化磁珠纯化回收接头连接产物。步骤：取30μl AMPure XP beads，放置到新的PCR管中，室温平衡30minutes以上，加入到上述接头连接步骤反应体系中，使用移液枪轻微吹打均匀，室温放置10minutes。PCR管放到磁力架上吸附磁珠，等待5minutes后，使用移液枪移去上清，并加入140μl新鲜配置的80％乙醇(使用ddH2O配置),盖上管盖并保持在磁力架上，室温放置10minutes。使用移液枪移去上清。重复用140μl新鲜配置的80％乙醇清洗磁珠。移去所有乙醇后，打开管盖，室温晾干5minutes，挥发乙醇。PCR管从磁力架上拿下来，加入30μl洗脱液(10mM Tris-HCl，pH8.0)吹打均匀，室温放置10minutes,重新放在磁力架上吸附磁珠，包含纯化的接头连接产物的上清液体移到新的PCR管中，-20℃保存。
实施例5
分别在实施例4所述的基因组DNA和所述的扩增接头序列设计特异性引物对端粒DNA进行PCR扩增，具体步骤如下：
所述端粒DNA的PCR体系包括基因组DNA的5’端非端粒区引物和所述扩增接头的引物用于扩增基因组DNA的5’端端粒；或，基因组DNA的3’端非端粒区引物和所述扩增接头的引物用于扩增基因组DNA的3’端端粒。
具体来说，在5’到3’方向，PCR扩增引物为，所述扩增接头的引物和与近5’端端粒区的基因组DNA反向互补的引物，或在5’到3’方向，近3’端端粒区的基因组DNA引物和与所述扩增接头反向互补的引物。PCR引物对如SEQ ID NO.32～SEQ ID NO.35所示，两个引物等量混合，使用引物稀释液(10mM Tris-HCl，pH 7.5)稀释至终浓度10μM,组成Primer Mix。PCR引物对如表2所示。
表2 PCR引物对
使用GC Genomic LA Polymerase Mix试剂盒(Takara，CodeNo.639153)扩增端粒DNA长片段。根据试剂盒说明配置PCR扩增反应体系组分。使用移液枪轻微吹打均匀反应体系，短暂离心，把扩增反应体系液体收集到管底，并放入PCR热循环仪中，开启热盖105℃，扩增反应程序参数如下：
S1：95℃for 5minutes；
S2：95℃for 30sec；
S3：60℃for 30sec；
S4：72℃for 15minutes；
重复S2～S4：30cycles；
S5：72℃for 15minutes；
S6：Hold at 4℃。
PCR扩增产物加入75μl ddH2O扩充至100μl,然后加入40ul AMPure XP beads，如实施例4操作步骤，纯化回收扩增产物，最后使用30μl洗脱缓冲液洗脱，获得高质量的带有扩增接头的基因组DNA，将带有扩增接头的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。
图中3是通过染色体1、染色体2和染色体7近染色体端的特异性引物和接头引物，分别特异性扩增染色体1，染色体2和染色体7的全长端粒DNA片段。尽管有少许非特异性，但是本发明方法能够非常高效和特异地扩增染色体端粒DNA全长片段。
实施例6
nanopore测序文库构建
建库试剂盒用nanopore的试剂盒，1D sequencing kit(SQK-RAD002 RapidSequencing Kit)
将实施例5的带有扩增接头的基因组DNA产物按照nanopore试剂盒的说明书进行文库构建。
上机测序及数据分析，具体步骤如下：
1、按照Nanopore MinIon Sequencer的要求上机测序：上样到R9.4/FLO-MIN106flow cell中，经过MinION Mk1B测序仪器检测。
2、按照测序数据分析pipeline将测序数据转化为fastq格式；
3、数据分析：
a、过滤不包含与所述扩增接头互补配对的引物和基因组DNA上的引物的reads和，与所述基因组DNA互补配对的引物和扩增接头上的引物的reads；
b、过滤不包含重复TTAGGG和CCCTAA repeats的序列；
c、统计过滤后reads的长度分布；
d、输出分析结果。
其中，fastaq数据中的筛选符合条件的reads，筛选条件为同时有与所述扩增接头互补配对的引物和基因组DNA上的引物的reads和，与所述基因组DNA互补配对的引物和扩增接头上的引物的reads,及同时序列中具有TTAGGG或AATCCC重复序列的reads。通过接头序列中的barcode，区分不同人的样品。另外通过GraphMap 0.3.1软件比对将这些reads对比到人类近染色体端序列，区分不同染色体的reads，然后计算相应染色体reads的长度。并做如下的分析。
表3 Nanopore MinIon测序总体情况
Sequence 通过质检的端粒DNA reads
Reads 31041 25857
Total bases 269823055 197780299
Reads average length(bp) 8692 7649
其中，Nanopore MinIon测序总体情况对300例样品的测序总体情况如表3所示，总共测出310401条序列，其中端粒DNA reads数量为258564条，其中端粒DNA的平均长度为8325bp。
图4至图7为Nanopore MinIon测序的数据分析，图4示全部reads中GC含量统计图，其中，蓝色线是总的数据集，红色线是筛选过滤后的端粒DNA测序reads，筛选过滤的条件为：reads两端分别包含与所述扩增接头互补配对的引物和基因组DNA上的引物和，与所述基因组DNA互补配对的引物和扩增接头上的引物，另外reads中包含TTAGGG或CCCTAA重复序列。本发明方法得到的端粒DNAreads中GC含量约为62.5％，符合端粒DNA的碱基组成。
本发明检测端粒DNA长度的结果如表4所示。
表4端粒DNA长度的结果统计
对实施例6中图7和表4的说明如下：中青年组chr1端粒DNA长度的平均值为9267bp，老年人组chr1端粒DNA长度的平均值为8913bp；中青年组chr2端粒DNA长度的平均值为9184bp，老年组chr2端粒DNA长度的平均值为7638bp；中青年组chr3端粒DNA长度的平均值为6925bp，老年组chr3端粒DNA长度的平均值为4895bp。在chr1、chr2及chr3的端粒DNA长度测序结果中，老年组的端粒DNA平均长度均比中年组要短，说明老年组的端粒整体上相比于中青年组的要显著缩短，P<0.05。中青年组及老年组chr1、chr2及chr7端粒测序结果的箱线图见图7。
对比例中图7和表4的说明的说明如下：对比例qPCR方法测得的中青年组的端粒DNA的平均长度为8326bp，对比例测得的老年组的端粒平均长度为7356bp，老年组的端粒长度也相比于中青年组要短，中青年组及老年组qPCR检测端粒DNA平均长度结果的箱线图同见图7。
图5为Reads的读长分析，其中，蓝色线是总的数据集，红色线是筛选过滤后的端粒DNA测序reads，筛选过滤的条件如上述，图5所示，端粒DNA的reads中包含部分近端粒区序列(约1～2Kbp)，可以发现，端粒DNA测序reads读长符合已知染色体端粒长度分布范围(4-10Kbp)。
图6为端粒DNA的reads中TTAGGG或者其互补序列AATCCC重复出现在总reads中的次数分布图。从图6中可以看到，测序的端粒DNA reads片段中，存在大量的TTAGGG/AATCCC重复序列，符合已知端粒DNA序列的组成。经过统计，测序数据中符合端粒DNA条件的reads中，TTAGGG/AATCCC重复序列平均重复出现次数1200次。
对比例
采用Telomere measurement by quantitative PCR(Richard M.Cawthon，Nucleic Acids Research,2002)分析端粒DNA的方法，该方法是采用了T/S比率的比率，即T/S比率可以得出端粒的相对长度，而T/S比率与端粒长度成正比关系。T/S计算公式如下：T/S＝[2Ct(telomeres)/2Ct(36B4)]＝2-ΔCt。端粒长度可以通过标准曲线y＝1910.5x+4157计算，其中x为T/S比率，y为端粒DNA的平均长度。使用该方法计算中青年人组和老年人组全部染色体的端粒的平均长度，结果如图7中对比例方法所示。
图7为本发明方法与对比例方法测量端粒DNA长度比较图。图7的chr1、chr2和chr7为通过标签序列可以区分不同人的染色体序列，筛选的端粒DNA reads，使用GraphMap软件与人的一号染色体、二号染色体和七号染色体的近端粒区域比对，通过比对结果区分端粒DNA reads属于哪条染色体，同时该reads长度减去reads中部分近端粒的染色体DNA长度，获得该染色体端粒的长度，统计每个人一号染色体、二号染色体和七号染色体端粒DNA的长度。而对比例的测量端粒DNA的方法只能测量基因组上所有染色体端粒DNA的平均长度。
分别对中青年人和老年人组一号染色体、二号染色体和七号染色体的端粒长度做分布图，发现不同染色体中，端粒DNA长度具有差异。另外同时发现，中青年人组中一号染色体、二号染色体和七号染色体的端粒长度均大于老年人组，符合以往研究。对比例方法中同时也验证了中青年人组端粒DNA长度大于老年人组，但是由于传统方法只能检测基因组所有染色体端粒的总体长度水平，无法精确测量每个染色体的端粒长度，所以在检测结果上，置信区间的分布较本发明的大，不利于准确比较端粒的长度。
综上所述，本发明公开的应用三代测序技术检测染色体端粒DNA全长的方法能特异性的扩增不同染色体的端粒DNA全长，所扩增全长的端粒DNA片段使用3代测序方法准确测量其片段序列长度，准确率和精度都超过传统的方法，本发明公开的检测染色体端粒DNA全长的方法精度达到1bp。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州普麦健康咨询有限公司
<120> 应用三代测序技术检测染色体端粒DNA全长的方法
<130> MP1710561
<160> 35
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 3
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cga 63
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cga 63
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cga 63
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<400> 8
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gtacgtagga ggccacgtcg gaggaatagg aacactcgta tgtagtcttc tgcttccgat 60
cga 63
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gtacgtagga ggccacgtcc agtgcttctt gctagtcgta tgtagtcttc tgcttccgat 60
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<213> 人工序列
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<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
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gtacgtagga ggccacgtct ctacgcagta accgatcgta tgtagtcttc tgcttccgat 60
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gtacgtagga ggccacgtcg acgtcatctt acagctcgta tgtagtcttc tgcttccgat 60
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gtacgtagga ggccacgtct ccattgcagc gagattcgta tgtagtcttc tgcttccgat 60
cga 63
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<213> 人工序列
<400> 24
gtacgtagga ggccacgtcc aatagccaag acacctcgta tgtagtcttc tgcttccgat 60
cga 63
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<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gtacgtagga ggccacgtcc cagttgatgg tgaagtcgta tgtagtcttc tgcttccgat 60
cga 63
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<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gtacgtagga ggccacgtca agaccgtttg cgagatcgta tgtagtcttc tgcttccgat 60
cga 63
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gtacgtagga ggccacgtcg caattccgaa tccgttcgta tgtagtcttc tgcttccgat 60
cga 63
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<400> 28
gtacgtagga ggccacgtcc cgcttaatac ctgcatcgta tgtagtcttc tgcttccgat 60
cga 63
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<211> 63
<212> DNA
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<400> 29
gtacgtagga ggccacgtcg tcgattgtat ggcactcgta tgtagtcttc tgcttccgat 60
cga 63
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
gtacgtagga ggccacgtcc tcgaacacaa ctccatcgta tgtagtcttc tgcttccgat 60
cga 63
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<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
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gtacgtagga ggccacgtct gcatcgtgga catcatcgta tgtagtcttc tgcttccgat 60
cga 63
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cgatcggaagcagaagactac 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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caactccgccgttgcaaagg 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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cgtatcccacacaccacaccc 21
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
cagacagtgcacaaagccac 20

Claims (10)

1.染色体端粒DNA的扩增方法，其特征在于，包括下列步骤：
1)提取基因组DNA；
2)将步骤1)的基因组DNA进行预处理，得到预处理后的基因组DNA；
3)将步骤2)获得的预处理后的基因组DNA两端的末端连接扩增接头，得到带有扩增接头的基因组DNA；
4)分别对步骤3)的带有扩增接头的基因组DNA序列和扩增接头序列设计引物对，对端粒DNA进行PCR扩增。
2.根据权利要求1所述的染色体端粒DNA扩增方法，其特征在于，所述步骤2)的基因组DNA进行预处理为所述基因组DNA的两端进行末端修复。
3.根据权利要求2所述的染色体端粒DNA扩增方法，其特征在于，所述基因组DNA片段的末端修复为将基因组DNA片段的补平，然后对基因组DNA的5’端进行磷酸化，以及对基因组DNA片段的3’端添加腺嘌呤。
4.根据权利要求1所述的染色体端粒DNA扩增方法，其特征在于，所述步骤3)的扩增接头还包括标签序列。
5.根据权利要求1所述的染色体端粒DNA扩增方法，其特征在于，所述步骤3)还包括将得到的带有扩增接头的基因组DNA进行纯化。
6.根据权利要求1至5任意一项所述的染色体端粒DNA的扩增方法，其特征在于，所述扩增接头为Y型接头、环状接头或线性接头中的一种。
7.一种染色体端粒DNA的扩增试剂盒，其特征在于，包括基因组DNA提取体系、基因组DNA预处理体系、扩增接头、扩增接头与基因组DNA连接体系和端粒DNA的PCR体系。
8.根据权利要求7所述的染色体端粒DNA的扩增试剂盒，其特征在于，所述端粒DNA的PCR体系包括基因组DNA的5’端非端粒区引物和所述扩增接头引物，用于扩增基因组DNA的5’端端粒；
或，基因组DNA的3’端非端粒区引物和所述扩增接头引物，用于扩增基因组DNA的3’端端粒。
9.应用三代测序技术检测染色体端粒DNA全长的方法，其特征在于，包括下列步骤：
1))提取基因组DNA片段；
2))将步骤1))的基因组DNA片段进行预处理；
3))步骤2))获得的预处理后的基因组DNA片段两端的末端连接扩增接头，得到带有扩增接头的基因组DNA片段；
4))分别对步骤3))的带有扩增接头的基因组DNA片段的基因组DNA序列和扩增接头序列设计引物对，对端粒DNA进行PCR扩增；
5))将步骤4))的PCR扩增的端粒DNA构建三代测序文库后，将所述三代测序文库上机测序，得到测序数据。
10.应用三代测序技术检测染色体端粒DNA全长的试剂盒，其特征在于，包括基因组DNA提取体系、基因组DNA预处理体系、扩增接头、扩增接头与基因组DNA连接体系、端粒DNA的PCR体系和三代测序文库构建体系。
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