CN117243125A - 一种海岸松的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海岸松的组织培养方法，属于植物组织培养技术领域。该组织培养方法包括以下步骤：1、获取海岸松种子的胚芽和部分胚轴；2、将无菌外植体接种于初代诱导培养基上培养28天；3、将不定芽接种于伸长和生长培养基上培养29天；4、将单个腋芽连同顶芽接种到增殖培养基上培养40天；5、将丛生芽分离成单个的芽接种于伸长和生长培养基上培养28天；6、将不定芽分离成单个不定芽后接种到生根培养基上培养45天；7、炼苗移栽。本发明首次以海岸松胚芽为外植体进行海岸松的组织培养并成功建立了再生体系，操作过程简单、组培苗质量好、生长周期短、繁殖系数高、不受季节限制，可在短期内提供较多数量的优质组培苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物组织培养方法，具体涉及一种海岸松的组织培养方法，属于植物组织培养技术领域。
背景技术
海岸松(Pinus pinaster)，裸子植物，松科松属，高可达30米，喜光乔木。海岸松原产地中海沿岸，是一种引种比较成功的林木品种，其适应性极强，沿海、沙地、荒地和石质滩地都可正常生长，对风沙、土壤干旱和盐碱、低温都有较强的耐受适应能力，从胶东半岛沿海沙地、华北河流沙地和古河床沙地到长江流域以南地区各种沙地都可栽植。海岸松生长速度快，其根系具有特有的圆形根系分配方式，纤维素含量较高，因此具有很强的张力，使得其根系具有很强的支撑作用，抗风折、抗风倒能力强。综合海岸松特性，其为海防林的建设提供一种新的造林树种。
海岸松本身也可发挥较大的生态效益和经济效益。海岸松树干可以作为优良的木材用于建筑板材、枕木和胶合板，其松脂的产量也显著高于一般的树种，树皮的提取产物“碧萝芷”被广泛应用于护肤品行业，因此海岸松国内国外需求量越来越大。
关于海岸松的组织培养体系建立的研究未见报道，而植物组织培养是种质保存的重要方式。通过组织培养手段可以缩短海岸松苗木繁育时间，提高繁殖速度，保存优良的种质的同时提供一种海岸松育苗的方式。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、繁殖系数高、组培苗质量好、启动率高的海岸松的组织培养方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种海岸松的组织培养方法，包括以下步骤：
步骤1：获取海岸松种子的胚芽和部分胚轴，得到无菌外植体；
步骤2：将无菌外植体接种于初代诱导培养基上，并置于培养箱中培养28天，长出不定芽，其中，初代诱导培养基的配方为：WPM+30.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，pH6.0；
步骤3：将长出的不定芽去除基部多余针叶，然后接种于伸长和生长培养基上，并置于培养箱中培养29天，长出小枝，其中，伸长和生长培养基的配方为：WPM+1.0g/L活性炭+30.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH 6.0；
步骤4：将长出的小枝的单个腋芽连同顶芽切下，然后接种到增殖培养基上，并置于培养箱中培养40天，长出丛生芽，其中，增殖培养基的配方为：WPM+30.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂+3.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，pH 6.0；
步骤5：将长出的丛生芽分离成单个的芽，并去除基部多余针叶，然后接种于伸长和生长培养基上，并置于培养箱中培养28天，长出不定芽，其中，伸长和生长培养基的配方为：WPM+1.0g/L活性炭+30.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH 6.0；
步骤6：将长度大于1.5cm的不定芽分离成单个不定芽，然后接种到生根培养基上，并置于培养箱中培养45天，长出发达根系且苗木达到2.0cm以上，其中，生根培养基的配方为：1/2WPM+20.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂+0.05mg/LNAA+3.0mg/L IBA，pH 6.0；
步骤7：炼苗移栽。
优选的，在步骤1中，获取海岸松种子的胚芽和部分胚轴的方法具体如下：
(1)将采集的海岸松球果自然晾晒，然后获取海岸松种子，并挑选大小一致、颗粒饱满的种子放置于4℃冰箱储存，备用；
(2)将种子清洗干净并放于55℃水中浸泡10min，等待水温自然冷却至30℃后将种子置于30℃恒温水浴锅中浸泡24h，之后取下层饱满、成熟、均匀的种子，将种子揉搓清洗后吸干水分；
(3)将种子装入三角瓶中，并向三角瓶中倒入质量浓度为0.2％的KMnO4溶液，之后将三角瓶置于振荡机上震荡30min，振荡条件为：100rpm、1511M、30℃，震荡完毕将种子冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分；
(4)用解剖刀轻轻刮掉外种皮黑色蜡质层，然后置于超净工作台上用质量浓度为10％的NaClO溶液对种子进行第一次消毒，消毒的过程具体如下：先用无菌蒸馏水清洗种子，然后用无菌滤纸吸取种子表面水分，之后用体积浓度为70％的乙醇溶液浸泡种子30s，浸泡期间每隔6s翻动种子一次，乙醇浸泡完毕无需清洗直接用质量浓度为10％的次氯酸钠溶液浸泡种子10min，浸泡期间不断搅动，最后用无菌蒸馏水冲洗种子3次；
(5)将种子置于30℃恒温水浴锅中浸泡24h，浸泡期间每隔8h换等温水一次；
(6)将种子置于超净工作台上，用质量浓度为0.1％的HgCl2溶液对种子进行第二次消毒，消毒的过程具体如下：先用无菌蒸馏水清洗种子，然后用无菌滤纸吸取种子表面水分，之后用体积浓度为70％的乙醇溶液浸泡30s，浸泡期间每隔6s翻动种子一次，乙醇浸泡完毕无需清洗直接用质量浓度为0.1％的HgCl2溶液浸泡种子5min，浸泡期间不断搅动，最后用无菌蒸馏水冲洗种子4次；
(7)将种子用无菌滤纸吸干水分，然后剥去胚乳，挑出种胚，用解剖刀切去胚根和下胚轴，留取胚芽和部分胚轴，获得无菌外植体。
优选的，在步骤7中，炼苗移栽的方法具体如下：先将组培苗移至自然光下适应环境2天，然后打开瓶盖1/3，保持3天，之后将组培苗根系处的培养基冲洗干净，随后将组培苗移栽至消过毒的基质中，并装入花盆中，最后将花盆移至温室内培养，保证空气湿度达到90％以上进行管理。
本发明的有益之处在于：
1、本发明首次以海岸松胚芽为外植体进行海岸松的组织培养并成功建立了再生体系，操作过程简单、组培苗质量好、生长周期短、繁殖系数高、不受季节限制，可在短期内提供较多数量的优质组培苗。
2、本发明填补了关于海岸松再生体系建立的空白，通过胚芽初代诱导、不定芽第一次伸长和生长、增殖培养、不定芽第二次伸长和生长、生根培养和炼苗移栽各阶段的研究，解决了海岸松无性繁育难的问题，为海岸松育苗提供了一种有效途径，对海岸松种质的保存、遗传改良和种苗繁育等方面具有一定意义。
3、本发明降低了购买海岸松苗木的成本，降低了因海岸松种子质量参差不齐而导致的造林效果差等风险，可以实现海岸松苗木的规模化繁育。
附图说明
图1是经过处理得到的海岸松种子胚芽(即外植体)图；
图2是经过第一次伸长和生长后得到的海岸松不定芽图；
图3是经过增殖培养后得到的海岸松丛生芽图；
图4是经过生根培养后得到的海岸松组培苗的根系图；
图5是移栽后得到的海岸松生根苗图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、准备种子
将采集的海岸松球果自然晾晒，然后获取海岸松种子，并挑选大小一致、颗粒饱满的种子放置于4℃冰箱储存，备用。
经发芽试验发现，海岸松种子发芽率与贮存时间关系不大，因此本实施例所使用的海岸松种子为获取时间相同但是贮存时间不同的种子。
二、根据萌发率确定种子的最佳浸泡方案
设置四个不同的水温：45℃、50℃、55℃、60℃，海岸松种子在不同水温下的浸泡时间分别为：5min、10min、15min，每个处理50粒种子，设置3次重复。
从冰箱取出海岸松种子，清洗干净，然后用不同温度(45℃、50℃、55℃、60℃)的水浸泡5min、10min或15min，等待水温自然冷却至30℃后将种子置于30℃恒温水浴锅中浸泡24h，之后将种子放置于湿润的纱布中，30天后统计种子的萌发率。
表1不同水温、不同浸泡时间对海岸松种子萌发率的影响
| 编号 | 水温(℃) | 浸泡时间(min) | 萌发率(％) |
| 1 | 45 | 5 | 5.60±0.30 |
| 2 | 50 | 5 | 50.23±0.16 |
| 3 | 55 | 5 | 57.56±0.15 |
| 4 | 60 | 5 | 0±0 |
| 5 | 45 | 10 | 24.80±0.15 |
| 6 | 50 | 10 | 78.45±0.13 |
| 7 | 55 | 10 | 91.00±0.12 |
| 8 | 60 | 10 | 17.33±0.19 |
| 9 | 45 | 15 | 10.34±0.21 |
| 10 | 50 | 15 | 69.45±0.24 |
| 11 | 55 | 15 | 73.45±0.14 |
| 12 | 60 | 15 | 2.09±0.21 |
由上表可知：
(1)在浸泡时间相同的情况下，以50-55℃水温处理海岸松种子萌发率较高，其中，以55℃水温浸泡10min情况下种子萌发率最高，随着水温升高至60℃，种子萌发率降到最低。适当的水温刺激可以活化种子内的各种酶，增强氧化和呼吸作用，但水温过高反而会降低种子内各种酶的活性导致种子的活力变差。
(2)从相同水温但不同浸泡时间上来看，种子浸泡时间以10-15min最为合适，这是因为浸泡时间过长会降低种子内各种酶的催化作用，浸泡时间太短刺激作用不明显，也会导致种子萌发率不高。
由于海岸松种子与55℃水温浸泡10min种子萌发率最高，达到了91.00％，所以确定海岸松种子的最佳浸泡水温是55℃、最佳浸泡时间是10min。
三、根据污染率和萌发率确定种子的最佳消毒方案
从冰箱取出海岸松种子，清洗干净，然后用55℃的水浸泡10min，等待水温自然冷却至30℃后将种子置于30℃恒温水浴锅中浸泡24h，之后取下层饱满、成熟、均匀的种子，将种子揉搓清洗后吸干水分并装入三角瓶中，然后向三角瓶中倒入质量浓度为0.2％的KMnO4溶液，最后将三角瓶置于振荡机上震荡30min，振荡条件为：100rpm、1511M、30℃，震荡完毕将种子冲洗干净并用滤纸吸干表面水分，用解剖刀轻轻刮掉外种皮黑色蜡质层，然后置于超净工作台上准备进行消毒。
以NaClO和HgCl2为消毒剂，观察两种消毒剂组合对海岸松种子污染率的影响。为减少试验次数，提高试验效率，采用三因素三水平正交实验设计，具体如表2所示。本试验共设置了16个处理，每个处理50粒种子，设置3个重复，以不同浓度NaClO溶液(质量浓度分别为4％、8％、10％、12％)和不同消毒时间(8min、10min、15min)组合为第一次消毒，以质量浓度0.1％的HgCl2溶液不同消毒时间(3min、5min、8min)为第二次消毒。两次消毒的过程具体如下：
(1)用无菌蒸馏水清洗种子，并用无菌滤纸吸干种子表面水分，然后用体积浓度为70％的乙醇溶液浸泡种子30s，浸泡期间每隔6s翻动种子一次，乙醇浸泡完毕无需清洗直接用不同浓度的NaClO溶液浸泡种子8min、10min或15min，浸泡期间不断搅动，最后用无菌蒸馏水冲洗种子3次；
(2)将经过NaClO消毒的种子置于30℃恒温水浴锅中浸泡24h，浸泡期间每隔8h换等温水一次；
(3)用无菌蒸馏水清洗浸泡24h后的种子，并用无菌滤纸吸干种子表面水分，然后用体积浓度为70％的乙醇溶液浸泡30s，浸泡期间每隔6s翻动种子一次，乙醇浸泡完毕无需清洗直接用质量浓度为0.1％的HgCl2溶液浸泡种子3min、5min或8min，浸泡期间不断搅动，最后用无菌蒸馏水冲洗种子4次。将获得的种子接种于PDA培养基上，15天后统计种子的污染率，30天后统计种子的萌发率。
表2不同消毒剂组合处理对海岸松种子污染率及萌发率的影响
由上表可知，不同消毒剂组合进行两次消毒后种子污染率都下降了，二次消毒的协同增效明显，但是不同组合效果不同，种子萌发率相差也较大。通过比较，4％NaClO和0.1％HgCl2组合消毒后种子萌发率较低，8-10％NaClO经过8-10min浸泡后配合0.1％HgCl2消毒种子污染率降低明显且可以保持较高的萌发率，其中，10％NaClO消毒8min配合第二次0.1％HgCl2消毒8min，种子污染率降为0，但是种子萌发率较低，仅为45.24％，而10％NaClO消毒8min配合第二次0.1％HgCl2消毒3min，种子污染率降到1.56％的同时种子还可以保持90％以上的萌发率。随着NaClO浓度的升高，种子的污染率虽然降低很多，但是种子的萌发率也降低明显，综合比较种子的污染率和萌发率，确定两次消毒最佳方案为：第一次消毒用质量浓度为10％的NaClO消毒8min，第二次消毒用质量浓度为0.1％的HgCl2消毒3min。
四、获得无菌外植体
从冰箱取出海岸松种子，清洗干净，然后用55℃的水浸泡10min，等待水温自然冷却至30℃后将种子置于30℃恒温水浴锅中浸泡24h，之后取下层饱满、成熟、均匀的种子，将种子揉搓清洗后吸干水分并装入三角瓶中，然后向三角瓶中倒入质量浓度为0.2％的KMnO4溶液，最后将三角瓶置于振荡机上震荡30min，振荡条件为：100rpm、1511M、30℃，震荡完毕将种子冲洗干净并用滤纸吸干表面水分，用解剖刀轻轻刮掉外种皮黑色蜡质层，然后置于超净工作台上，用无菌蒸馏水清洗种子，并用无菌滤纸吸干种子表面水分，然后用体积浓度为70％的乙醇溶液浸泡种子30s，浸泡期间每隔6s翻动种子一次，乙醇浸泡完毕无需清洗直接用质量浓度为10％的NaClO溶液浸泡种子8min，浸泡期间不断搅动，然后用无菌蒸馏水冲洗种子3次，将种子置于30℃恒温水浴锅中浸泡24h，浸泡期间每隔8h换等温水一次，然后用无菌蒸馏水清洗种子，并用无菌滤纸吸干种子表面水分，再用体积浓度为70％的乙醇溶液浸泡30s，浸泡期间每隔6s翻动种子一次，乙醇浸泡完毕无需清洗直接用质量浓度为0.1％的HgCl2溶液浸泡种子3min，浸泡期间不断搅动，然后用无菌蒸馏水冲洗种子4次，并用无菌滤纸吸干水分，然后剥去胚乳，挑出种胚，用解剖刀切去胚根和下胚轴，留取胚芽和部分胚轴，获得无菌外植体(图1)。
五、根据诱导率和增殖系数确定最佳初代诱导培养基的成分
培养箱培养条件为：培养温度设置为25±1℃，光照强度设置为2000-4000lx。
为了获得高质量及增殖系数较大的不定芽，本试验选用了6-BA和NAA两种激素，所使用的初代诱导培养基以WPM为基本培养基，附加30.0g/L蔗糖和7.0g/L琼脂，将6-BA设置5个水平(1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、5.0mg/L、7.0mg/L)、将NAA设置2个水平(0.05mg/L、0.1mg/L)，pH值调至6.0。试验共设置10个处理，具体见表3，每个处理接种4个无菌外植体，设置15个重复。
首先，进行初代培养，具体的：将获得的外植体接种于不同的初代诱导培养基上，置于培养箱中培养28天，统计不定芽的诱导率。
然后，进行不定芽第一次伸长和生长，具体的：将诱导出的不定芽去除基部部分多余针叶后接种于伸长和生长培养基上，进行不定芽第一次生长和生长，29天后长出1.5cm左右小枝。伸长和生长培养基配方为：WPM+1.0g/L活性炭+30.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH6.0接下来，进行增殖培养，具体的：将长出的小枝的单个芽切下接种到增殖培养基上，培养40天后长出丛生芽，统计不定芽的增殖系数。增殖培养基的配方为：WPM+3.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+30.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH6.0。
表3不同激素浓度配比对海岸松不定芽诱导的影响
由上表可知，在不同激素浓度配比下，不定芽的诱导率和增殖系数差异均很大。其中，当6-BA浓度为3.0mg/L、NAA浓度为0.1mg/L时，不定芽的诱导率最高，为65.68％，并且不定芽的增殖系数也最高，达到了6.67。
由此确定海岸松初代培养所用的激素最佳浓度配比为：6-BA浓度为3.0mg/L、NAA浓度为0.1mg/L。
六、根据诱导率和增殖系数确定最佳基本培养基
培养箱培养条件为：培养温度设置为25±1℃，光照强度设置为2000-4000lx。
为了获得高质量及增殖系数较大的不定芽，本试验选用了MS和WPM为基本培养基，分别记为MS组和WPM组，各组所使用的初代诱导培养基、伸长和生长培养基和增殖培养基的配方具体见表4。
表4MS组和WPM组所用培养基的配方(pH 6.0)
首先，将前面获得的无菌外植体接种于不同的初代诱导培养基上，并置于培养箱中培养28天，长出不定芽，统计不定芽的诱导率。
然后，将长出的不定芽去除基部部分多余针叶，将去除多余针叶的不定芽接种于对应的伸长和生长培养基上，并置于培养箱中培养29天，进行不定芽第一次伸长和生长，长出1.5cm左右小枝。
之后，将长出的小枝的单个腋芽连同顶芽切下，将切下的单个腋芽连同顶芽接种到对应的增殖培养基上，并置于培养箱中培养40天，长出丛生芽，统计不定芽的增殖系数。
表5不同基本培养基对不定芽诱导和增殖诱导的影响
由上表可知，在同样的激素浓度处理下，WPM培养基的腋芽诱导率高于MS培养基，但是两种培养基腋芽诱导率都较高，对于初代诱导来说，这两种培养基都较适宜。采用初代诱导的腋芽进行不定芽增殖培养后，两种培养基的不定芽增殖系数相差较大，MS培养基上的不定芽出现停长甚至死亡，且部分芽形成愈伤组织，40天后统计结果表明WPM培养基不定芽增殖诱导增殖系数达到3.12，可以得到大量不定芽。
由此确定适合海岸松胚芽诱导和增殖的最佳基本培养基为WPM。
七、根据生根率确定最佳生根培养基的成分
培养箱培养条件为：培养温度设置为25±1℃，光照强度设置为2000-4000lx。
为了获得根系发达的组培苗，本试验选用了NAA和IBA两种激素，所使用的生根培养基以1/2WPM为基本培养基，附加20.0g/L蔗糖和7.0g/L琼脂，将NAA设置4个水平(0.03mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.3mg/L)、将IBA也设置4个水平(1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L、)，pH值调至6.0。试验共设置16个处理，具体见表6，每个处理接种5个不定芽，设置12个重复。
首先，采用第四部分记载的方法获得无菌外植体。
然后，将无菌外植体接种于初代诱导培养基上，并置于培养箱中培养28天，长出不定芽。其中，初代诱导培养基的配方为：WPM+30.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，pH6.0。
之后，将长出的不定芽去除基部部分多余针叶，将去除多余针叶的不定芽接种于伸长和生长培养基上，并置于培养箱中培养29天，进行不定芽第一次伸长和生长，长出1.5cm左右小枝(图2)。其中，伸长和生长培养基的配方为：WPM+1.0g/L活性炭+30.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH 6.0。
接下来，将长出的小枝的单个腋芽连同顶芽切下，将切下的单个腋芽连同顶芽接种到增殖培养基上，并置于培养箱中培养40天，长出丛生芽(图3)。其中，增殖培养基的配方为：WPM+30.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA，pH 6.0。
然后，将长出的丛生芽分离成单个的芽，并去除基部部分多余针叶，将去除多余针叶的单个芽再次接种于伸长和生长培养基上，并置于培养箱中培养28天，进行不定芽第二次伸长和生长，长出长度达到1.5cm左右的不定芽。其中，伸长和生长培养基的配方为：WPM+1.0g/L活性炭+30.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH 6.0。
最后，将长度大于1.5cm的不定芽分离成单个不定芽，将分离得到的单个不定芽直接接种到不同的生根培养基上，并置于培养箱中培养45天，统计生根率。
表6不同浓度激素配比对海岸松不定根诱导的影响
由上表可知，不同激素不同浓度配比，不同处理海岸松的生根率差异很大。当NAA浓度在0.05-0.1mg/L且IBA浓度在2.0-3.0mg/L范围内时，海岸松保持比较高的生根率。其中，当NAA浓度为0.05mg/L且IBA浓度为3.0mg/L时，海岸松的生根率最高，为53.33％，根部愈伤组织很少，根长较长，可达5.2cm，根系发达(图4)，并且再生苗的高度达到了2.0cm以上；当NAA浓度达到0.3mg/L且IBA浓度达到4.0mg/L时，不定芽基部产生大量愈伤组织，生根率严重下降，几乎不形成不定根或者是不定根畸形。
由此确定海岸松生根培养基所用的激素最佳浓度配比为：NAA浓度为0.05mg/L、IBA浓度为3.0mg/L
八、炼苗移栽
将前面在1/2WPM+20.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂+0.05mg/L NAA+3.0mg/L IBA(对应表6中的第10组，生根率53.33％)这个生根培养基上培养获得的组培苗移栽至温室，移栽过程具体如下：
先将组培苗移至自然光下适应环境2天，然后打开瓶盖1/3，保持3天，之后将组培苗根系处的培养基冲洗干净，随后将冲洗干净的组培苗移栽至消过毒的基质中，并装入花盆中(图5)，最后将花盆移至温室内培养，保证空气湿度达到90％以上进行管理。
需要说明的是，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明技术方案所引申出的显而易见变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (6)
1.一种海岸松的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：获取海岸松种子的胚芽和部分胚轴，得到无菌外植体；
步骤2：将无菌外植体接种于初代诱导培养基上，并置于培养箱中培养28天，长出不定芽，其中，初代诱导培养基的配方为：WPM+30.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，pH6.0；
步骤3：将长出的不定芽去除基部多余针叶，然后接种于伸长和生长培养基上，并置于培养箱中培养29天，长出小枝，其中，伸长和生长培养基的配方为：WPM+1.0g/L活性炭+30.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH 6.0；
步骤4：将长出的小枝的单个腋芽连同顶芽切下，然后接种到增殖培养基上，并置于培养箱中培养40天，长出丛生芽，其中，增殖培养基的配方为：WPM+30.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂+3.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，pH 6.0；
步骤5：将长出的丛生芽分离成单个的芽，并去除基部多余针叶，然后接种于伸长和生长培养基上，并置于培养箱中培养28天，长出不定芽，其中，伸长和生长培养基的配方为：WPM+1.0g/L活性炭+30.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH 6.0；
步骤6：将长度大于1.5cm的不定芽分离成单个不定芽，然后接种到生根培养基上，并置于培养箱中培养45天，长出发达根系且苗木达到2.0cm以上，其中，生根培养基的配方为：1/2WPM+20.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂+0.05mg/LNAA+3.0mg/LIBA，pH 6.0；
步骤7：炼苗移栽。
2.根据权利要求1所述的海岸松的组织培养方法，其特征在于，在步骤1中，获取海岸松种子的胚芽和部分胚轴的方法具体如下：
(1)将采集的海岸松球果自然晾晒，然后获取海岸松种子，并挑选大小一致、颗粒饱满的种子放置于4℃冰箱储存，备用；
(2)将种子清洗干净并放于55℃水中浸泡10min，等待水温自然冷却至30℃后将种子置于30℃恒温水浴锅中浸泡24h，之后取下层饱满、成熟、均匀的种子，将种子揉搓清洗后吸干水分；
(3)将种子装入三角瓶中，并向三角瓶中倒入质量浓度为0.2％的KMnO4溶液，之后将三角瓶置于振荡机上震荡30min，震荡完毕将种子冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分；
(4)用解剖刀轻轻刮掉外种皮黑色蜡质层，然后置于超净工作台上用质量浓度为10％的NaClO溶液对种子进行第一次消毒；
(5)将种子置于30℃恒温水浴锅中浸泡24h，浸泡期间每隔8h换等温水一次；
(6)将种子置于超净工作台上，用质量浓度为0.1％的HgCl2溶液对种子进行第二次消毒；
(7)将种子用无菌滤纸吸干水分，然后剥去胚乳，挑出种胚，用解剖刀切去胚根和下胚轴，留取胚芽和部分胚轴，获得无菌外植体。
3.根据权利要求2所述的海岸松的组织培养方法，其特征在于，在步骤(3)中，振荡条件为：100rpm、1511M、30℃。
4.根据权利要求2所述的海岸松的组织培养方法，其特征在于，在步骤(4)中，消毒的过程具体如下：
先用无菌蒸馏水清洗种子，然后用无菌滤纸吸取种子表面水分，之后用体积浓度为70％的乙醇溶液浸泡种子30s，浸泡期间每隔6s翻动种子一次，乙醇浸泡完毕无需清洗直接用质量浓度为10％的次氯酸钠溶液浸泡种子10min，浸泡期间不断搅动，最后用无菌蒸馏水冲洗种子3次。
5.根据权利要求2所述的海岸松的组织培养方法，其特征在于，在步骤(6)中，消毒的过程具体如下：
先用无菌蒸馏水清洗种子，然后用无菌滤纸吸取种子表面水分，之后用体积浓度为70％的乙醇溶液浸泡30s，浸泡期间每隔6s翻动种子一次，乙醇浸泡完毕无需清洗直接用质量浓度为0.1％的HgCl2溶液浸泡种子5min，浸泡期间不断搅动，最后用无菌蒸馏水冲洗种子4次。
6.根据权利要求1所述的海岸松的组织培养方法，其特征在于，在步骤7中，炼苗移栽的方法具体如下：
先将组培苗移至自然光下适应环境2天，然后打开瓶盖1/3，保持3天，之后将组培苗根系处的培养基冲洗干净，随后将组培苗移栽至消过毒的基质中，并装入花盆中，最后将花盆移至温室内培养，保证空气湿度达到90％以上进行管理。
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Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0799855A (ja) * | 1993-10-01 | 1995-04-18 | New Oji Paper Co Ltd | 木本性植物プロトプラストの培養方法 |
| CN102480926A (zh) * | 2009-05-07 | 2012-05-30 | 阿博根公司 | 用于再生和转化树木的材料和方法 |
| CN103329803A (zh) * | 2013-06-26 | 2013-10-02 | 广西壮族自治区林业科学研究院 | 南方松树丛芽诱导及继代培养方法 |
| CN104663445A (zh) * | 2015-02-25 | 2015-06-03 | 杨惠才 | 一种高产脂湿地松的离体快繁技术 |
| CN108887065A (zh) * | 2018-07-16 | 2018-11-27 | 安徽省强家庄生态农业有限公司 | 一种松树营林树种育苗及种植技术 |
| CN113711918A (zh) * | 2021-09-16 | 2021-11-30 | 安徽农业大学 | 一种黄山松的组培快繁方法 |
| CN113711913A (zh) * | 2021-08-19 | 2021-11-30 | 贵州大学 | 一种马尾松胚乳二倍体愈伤组织诱导与增殖的方法 |
| CN116998278A (zh) * | 2023-08-18 | 2023-11-07 | 烟台市森林资源监测保护服务中心(烟台沿海防护林省级自然保护区管理服务中心、烟台市林业科学研究所) | 一种组培用海岸松种子消毒的方法 |
| CN117136782A (zh) * | 2023-10-18 | 2023-12-01 | 烟台市森林资源监测保护服务中心(烟台沿海防护林省级自然保护区管理服务中心、烟台市林业科学研究所) | 一种北方引种海岸松后结实种子的容器育苗方法 |
-
2023
- 2023-10-26 CN CN202311398421.XA patent/CN117243125A/zh active Pending
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0799855A (ja) * | 1993-10-01 | 1995-04-18 | New Oji Paper Co Ltd | 木本性植物プロトプラストの培養方法 |
| CN102480926A (zh) * | 2009-05-07 | 2012-05-30 | 阿博根公司 | 用于再生和转化树木的材料和方法 |
| CN103329803A (zh) * | 2013-06-26 | 2013-10-02 | 广西壮族自治区林业科学研究院 | 南方松树丛芽诱导及继代培养方法 |
| CN104663445A (zh) * | 2015-02-25 | 2015-06-03 | 杨惠才 | 一种高产脂湿地松的离体快繁技术 |
| CN108887065A (zh) * | 2018-07-16 | 2018-11-27 | 安徽省强家庄生态农业有限公司 | 一种松树营林树种育苗及种植技术 |
| CN113711913A (zh) * | 2021-08-19 | 2021-11-30 | 贵州大学 | 一种马尾松胚乳二倍体愈伤组织诱导与增殖的方法 |
| CN113711918A (zh) * | 2021-09-16 | 2021-11-30 | 安徽农业大学 | 一种黄山松的组培快繁方法 |
| CN116998278A (zh) * | 2023-08-18 | 2023-11-07 | 烟台市森林资源监测保护服务中心(烟台沿海防护林省级自然保护区管理服务中心、烟台市林业科学研究所) | 一种组培用海岸松种子消毒的方法 |
| CN117136782A (zh) * | 2023-10-18 | 2023-12-01 | 烟台市森林资源监测保护服务中心(烟台沿海防护林省级自然保护区管理服务中心、烟台市林业科学研究所) | 一种北方引种海岸松后结实种子的容器育苗方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| J. M. ÁLVAREZ等: "An improved micropropagation protocol for maritime pine ( Pinus pinaster Ait.) isolated cotyledons", 《FORESTRY》, vol. 82, no. 2, 29 January 2009 (2009-01-29), pages 175 - 184 * |
| 季孔庶;王潘潘;王金铃;阮倩倩;潘婷;朱沛煌;郭天玮;刘靖;: "松科树种的离体培养研究进展", 南京林业大学学报(自然科学版), no. 01, 15 January 2015 (2015-01-15), pages 145 - 151 * |
| 王虹, 张金凤, 董建生: "针叶树组织培养繁殖技术研究进展", 河北林业科技, no. 02, 28 April 2004 (2004-04-28), pages 17 - 21 * |
| 邢世岩;: "松树微体快速繁殖的激素调控", 山东林业科技, no. 03, 15 June 2007 (2007-06-15), pages 88 - 90 * |
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