CN116998278A - 一种组培用海岸松种子消毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种组培用海岸松种子消毒的方法，经过海岸松种子浸泡：55℃水浸泡10min+30℃水浸泡24h，接种前剥去种皮外层，以及两次消毒剂组合处理，可显著降低海岸松种子的污染率，提高组培用海岸松种子的发芽率。
Description
技术领域
本申请涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及海岸松组培用种子的消毒处理方法。
背景技术
海岸松(Pinus pinasterAit)，裸子植物，松科松属，喜光乔木，高可达30米。生长迅速，年均直径生长量达1.2cm，生长15年左右即可成林，30-40年可采伐。海岸松适应温暖、湿润的气候条件，我国北部山东沿海地区到我国最南端的各种沿海沙地都可以种植海岸松。其对沿海沙地、盐碱地和风沙等气候环境有很强的耐受能力，同时抗风能力强，具有强大根系。我国有18000km大陆海岸线，分布在这些沿海地区的海岸防护林林木老化衰退、病虫害严重、透风度大等现象越来越明显，综合海岸松特性，改变我国海防林建设现状有较广阔前景，为我国沿海防护林的造林带来较为可观的经济、生态和社会效益。
海岸松是一种多用途树种，其树型高大紧密，防风固沙能力强的同时可以提供木材。其松针和树皮中多酚类抗氧化物含量较高，其畅销的提取物制成产品“碧萝芷”具有较强的抗氧化能力，广泛应用于化妆品护肤业。通过对海岸松进行组织培养育苗可以提高其繁殖系数，获得生长整齐且质量高的组培苗。海岸松进行组织培养采用以顶芽作为外植体，污染较难控制且容易发生褐化，采用种子作为外植体一般是剥去胚乳，去掉部分胚轴采用胚芽进行，在这过程中由于种子成熟度不一致，容易产生畸形芽，胚轴部分保留大小不一致而产生愈伤组织或者胚轴生长过快，顶芽生长导致的顶芽生长不良，而采用种子直接进行诱导芽进行组织培养既可以保证芽的质量又可以采用完整顶芽。
因此，提供一种适于海岸松组织培养的消毒方法并且保证较高的成活率和较低的污染率是本领域技术人员需要解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种适于组织培养用种子的消毒方法，经过接种前两次消毒和剥去种皮外层，提高了种子发芽率，降低了种子污染率。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种组培用海岸松种子消毒的方法，包括如下步骤：
(1)将采集的海岸松(Pinus pinaster)球果自然晾晒，获取海岸松种子，挑选大小一致、颗粒饱满的种子放置于4℃冰箱储存21-42天；
(2)将种子用50-55℃水浸泡10-15min，等待自然冷却至30℃后置于30℃恒温水浴锅中浸泡24h，取下层饱满、成熟、均匀的种子；
(3)将种子装入三角瓶，倒入0.2％KMnO4溶液，置于振荡机上15-30min，冲洗干净后备用；
(4)将所述步骤3)所得到的海岸松种子刮去种子外种皮蜡质层；
(5)将所述步骤4)中的种子置于超净工作台上，进行第一次消毒，消毒剂先后采用70％乙醇和8-10％次氯酸钠溶液，消毒时间为乙醇浸泡30-45s，次氯酸钠浸泡8-10min，最后用无菌水清洗3-4次；
(6)将处理好的种子置于30℃恒温水浴锅中浸泡24h；
(7)将所述步骤6)中得到种子置于超净工作台上，进行第二次消毒，消毒剂先后采用70％乙醇和0.1％HgCl2，消毒时间为乙醇浸泡30-45s，0.1％HgCl2浸泡3-5min。
进一步的，所述步骤(1)中，海岸松种子取自蓬莱海防林过渡区。
进一步的，所述步骤(2)中，海岸松种子在55℃水中浸泡10min。
进一步的，所述步骤(3)中，0.2％KMnO4振荡时间为30min，振荡条件为100rpm，1511M，30℃。
进一步的，所述步骤(4)中，用解剖刀刮去种子外种皮蜡质层。
进一步的，所述步骤(5)中，种子第一次消毒先后采用70％乙醇和次氯酸钠溶液，具体过程为：先用70％乙醇漂洗30s，再利用10％次氯酸钠浸泡8min，最后再用无菌水冲洗3次。
进一步的，所述步骤(6)中，种子经第一次消毒后继续在30℃恒温下浸泡24h，期间每隔8h换等温水一次。
进一步的，所述步骤(7)中，种子第二次消毒先后采用70％乙醇和0.1％HgCl2消毒，具体过程为：先用70％乙醇漂洗30s，再利用0.1％HgCl2消毒3min，最后再用无菌水冲洗4次。
本发明的有益效果：
1.通过低温冷藏和55℃水浸泡后的海岸松种子，萌发率提高，缩短了海岸松种子组培瓶内发芽时间。剥去海岸松种子外种皮蜡质层，经过两次消毒处理，可有效去除种子表面杂质和病菌。不同水温不同浸泡时间对海岸松种子萌发率最佳组合是：55℃水浸泡10min+30℃水浸泡24h(两次浸泡)。
2.本发明通过大量的试验，摸索出了海岸松种子消毒和萌发的影响因素。经过70％乙醇配浓度为8-10％的次氯酸钠和70％乙醇配0.1％HgCl2不同浸泡时间进行消毒，保证了海岸松种子萌发率，降低了种子在组培过程中的污染率。通过正交试验，我们进一步得出影响海岸松种子污染率和萌发率的各因素影响次序均为次氯酸钠浓度>次氯酸钠消毒时间>0.1％HgCl2消毒时间。
3.我们意外的发现，海岸松种子剥去外种皮蜡质层对其种子消毒及进一步的萌发起到了至关重要的作用，通过对比试验，我们得出海岸松种子在不剥去蜡质层的情况下所有的海岸松种子全部污染，且种子都没有萌发。同时，通过对照刮种皮+消毒剂组合处理海岸松种子的不同处理方法，我们还得出，通过刮种皮+本发明的二次消毒处理组合后的效果优于单独使用两种消毒处理组合试验，且效果优于单独使用其中一种消毒剂处理组合，说明本发明的消毒组合具有协同增效的技术效果。
附图说明
图1：本发明组培用海岸松种子消毒流程图；
图2：剥去种子外种皮黑色蜡质层。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，本文所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，对于本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种组培用海岸松种子的消毒方法，包括如下步骤：
(1)将采集的海岸松球果自然晾晒，获取海岸松种子。挑选大小一致、颗粒饱满的种子放置于4℃冰箱储存21天；种子清洗干净，备用；
(2)将种子用55℃水浸泡10min，等待自然冷却至30℃后置于30℃恒温水浴锅中浸泡24h，取下层饱满、成熟、均匀的种子；种子揉搓清洗后吸干水分备用；
(3)将所述步骤(2)的海岸松种子装入三角瓶，倒入0.2％KMnO4溶液，置于振荡机上30min，振荡条件为，100rpm，1511M，30℃，冲洗干净后用滤纸吸干表面水分。
(4)将所述步骤(3)中的海岸松种子用解剖刀轻轻刮去种子外种皮黑色蜡质层。
(5)将所述步骤(4)中得到的海岸松种子置于超净工作台上，进行第一次消毒，先用无菌蒸馏水清洗后用无菌滤纸吸取表面水分，倒入70％乙醇浸泡30s，期间每隔6s翻动一次，无需清洗直接倒入10％次氯酸钠溶液浸泡8min，期间不断搅动，最后用无菌水冲洗3次。
(6)将步骤(5)中处理好的海岸松种子继续置于30℃恒温水浴锅中浸泡24h，期间每隔8h换等温水一次。
(7)将步骤(6)中的海岸松种子置于超净工作台上，进行第二次消毒，先用无菌蒸馏水清洗后用无菌滤纸吸取表面水分，倒入70％乙醇浸泡30s，期间每隔6s翻动一次，无需清洗直接倒入0.1％HgCl2浸泡3min，期间不断搅动，最后用无菌水冲洗4次。
试验一、不同水温不同浸泡时间对海岸松种子萌发率的影响
试验材料：将晾晒好的海岸松种子存放于4℃冰箱，通过贮存7-63天(每隔14天算一个周期)后进行发芽试验，发现种子发芽率与贮存时间发芽关系不大，因此本试验采用的种子为同一批但是不同冰箱贮存时间的种子。
试验方法：设置不同水温分别为45℃、50℃、55℃、60℃，不同水温下的种子的浸泡时间分别为5min、10min、15min，等待自然冷却后，置于30℃，45℃恒温水浴锅中两次均浸泡24h，每个处理50粒种子，设置3次重复，除了上述参数的替换外，其余消毒方法步骤均同实施例1，所有处理30d后调查种子萌发率。
表1不同水温不同浸泡时间对海岸松种子萌发率的影响
试验结果：如表1所示，在浸泡时间相同的情况下，以50-55℃水温处理海岸松种子萌发率较高，其中以55℃水温浸泡10min情况下种子萌发率最高，但随着水温升高至60℃，种子萌发率降到最低，由于水温过高，种子内各种酶活性降低导致活力变差。在相同水温但不同时间上来看，种子浸泡时间以10-15min最为合适，适当的温度刺激可以活化各种酶，增强氧化和呼吸作用，但是温度过高时间过长都会降低酶的催化作用，时间太短刺激作用不明显，也会导致种子萌发率不高。不同水温不同浸泡时间对海岸松种子萌发率最佳组合是：55℃水浸泡10min+30℃水浸泡24h(两次浸泡)。
试验二、消毒剂组合对海岸松种子消毒和萌发效果的影响
试验方法：该方法主要探讨消毒剂浓度和消毒时间对种子污染率的影响，以不同浓度次氯酸钠和0.1％HgCl2为消毒剂，观察两种消毒剂组合对海岸松种子污染率及萌发率的影响。为减少试验次数，提高试验效率，采用三因素多水平正交实验设计，如表2所示，本试验共设置了16个处理，以次氯酸钠不同浓度和不同时间组合为第一次消毒，以0.1％HgCl2不同种子消毒时间为第二次消毒，每次使用消毒剂消毒前种子先用70％酒精浸泡30s，其余消毒方法步骤均同实施例1，对两次消毒后种子污染率进行统计，其中次氯酸钠的浓度设置为4％、8％、10％、12％，消毒时间设置为8min、10min、15min，0.1％HgCl2消毒时间设置为3min、5min、8min，每个处理50粒种子，设置3个重复，15d后统计种子平均污染率，30d后统计种子平均萌发率。
表2不同消毒剂组合处理海岸松种子污染率及萌发率
试验结果：如表2所示，不同消毒剂组合进行两次消毒后种子污染率都得到下降，二次消毒的协同增效明显，但是不同组合之间效果不同，种子萌发率相差也较大。通过比较，4％次氯酸钠和0.1HgCl2组合消毒后种子萌发率较低，8-10％次氯酸钠经过8-10min浸泡后配合HgCl2消毒，种子污染率降低明显且可以保持较高的萌发率，其中10％次氯酸钠消毒8min配合0.1％HgCl28min污染率降为0，但是种子萌发率比该组合种子萌发率降低，为45.24％，而10％次氯酸钠消毒8min配合第二次0.1％HgCl2消毒时间3min，种子污染率降到1.56％的同时，种子还可以保持90％以上的出芽率。随着次氯酸钠浓度的升高，污染率虽然比4-10％降低很多，但是种子的萌发率降低明显，综合比较次氯酸钠浓度、消毒时间配合HgCl2进行第二次消毒保持较低污染率但是萌发率比较高最佳选择为次氯酸钠浓度8-10％消毒时间8-10min，配合0.1％HgCl2消毒时间3-5min。
通过R值计算，影响海岸松种子污染率和萌发率的各因素影响次序均为A>B>C，即次氯酸钠浓度>次氯酸钠消毒时间>0.1％HgCl2消毒时间。
试验三、刮种皮+消毒剂组合对海岸松种子消毒和萌发效果的影响
试验方法：该方法主要探讨海岸松种皮刮取蜡质层处理和消毒剂组合对种子污染率的影响，以刮取或不刮取海岸松种子外种皮蜡质层，不同消毒剂组合(包括消毒步骤)。观察不同处理组合对海岸松种子污染率及萌发率的影响。具体的实验设计如表3所示，每个处理50粒种子，设置3个重复，分别以不同消毒剂组合为第一次和第二次消毒，每次使用消毒剂消毒前种子先用70％酒精浸泡30s，其余消毒方法步骤均同实施例1。15d后统计种子污染率，30d后统计种子萌发率。
表3刮种皮+消毒剂组合处理海岸松种子污染率及萌发率
| 试验号 | 去外种皮蜡质层 | 第一次消毒 | 第二次消毒 | 污染率(％) | 萌发率(％) |
| 1 | 去蜡质层 | 10％次氯酸钠 | 0.1％HgCl2消毒 | 1.56 | 91.85 |
| 2 | 不去 | 10％次氯酸钠 | 0.1％HgCl2消毒 | 100 | 0 |
| 3 | 去蜡质层 | 10％次氯酸钠 | — | 45.83 | 50.36 |
| 4 | 去蜡质层 | — | 0.1％HgCl2消毒 | 68.63 | 21.71 |
| 5 | 去蜡质层 | 0.1％HgCl2消毒 | 10％次氯酸钠 | 36.39 | 42.34 |
试验结果：如表3所示，在试验过程中我们研究发现，海岸松种子在不剥去蜡质层的情况下采用实施例1中的方法进行消毒，最后通过对比发现所有的海岸松种子全部污染，且种子都没有萌发，说明剥去外种皮蜡质层对于海岸松种子消毒成功也是至关重要的。通过对照刮种皮+消毒剂组合处理海岸松种子的不同处理方法，我们还得出，通过刮种皮+本发明的二次消毒处理组合后(第一次消毒：70％乙醇+10％次氯酸钠，第二次消毒：70％乙醇+0.1％HgCl2)的效果优于单独使用两种消毒处理组合试验，且效果优于单独使用其中一种消毒剂处理组合，说明本发明的消毒组合具有协同增效的技术效果。
以上所述的实施例，对于本领域的技术人员来说能够实现或使用本发明。在不脱离本文所述发明原理和特点的前提下，还可以作出改进，因此本发明将不被限制所述实施例，而是要符合本发明所述原理和特点相符的视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种组培用海岸松种子消毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将采集的海岸松(Pinus pinasterAit)球果自然晾晒，获取海岸松种子，挑选大小一致、颗粒饱满的种子放置于4℃冰箱储存21-42天；
(2)将种子用50-55℃水浸泡10-15min，等待自然冷却至30℃后，置于30℃恒温水浴锅中浸泡24h，取下层饱满、成熟、均匀的种子；
(3)将种子装入三角瓶，倒入0.2％KMnO4溶液，置于振荡机上15-30min，冲洗干净后备用；
(4)将所述步骤3)所得到的海岸松种子刮去种子外种皮蜡质层；
(5)将所述步骤4)中的种子置于超净工作台上，进行第一次消毒，消毒剂先后采用70％乙醇和8-10％次氯酸钠溶液，消毒时间为乙醇首先浸泡30-45s，次氯酸钠再浸泡8-10min，最后用无菌水清洗3-4次；
(6)将处理好的种子置于30℃恒温水浴锅中浸泡24h；
(7)将所述步骤6)中得到种子置于超净工作台上，进行第二次消毒，消毒剂先后采用70％乙醇和0.1％HgCl2，消毒时间为乙醇首先浸泡30-45s，0.1％HgCl2再浸泡3-5min。
2.根据权利要求1所述的组培用海岸松种子消毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，海岸松种子取自蓬莱海防林过渡区。
3.根据权利要求1所述的组培用海岸松种子消毒的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，海岸松种子在55℃水中浸泡10min。
4.根据权利要求1所述的组培用海岸松种子消毒的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，0.2％KMnO4振荡时间为30min，振荡条件为：100rpm，1511M，30℃。
5.根据权利要求1所述的组培用海岸松种子消毒的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，用解剖刀刮去种子外种皮蜡质层。
6.根据权利要求1所述的组培用海岸松种子消毒的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，种子第一次消毒先后采用70％乙醇和次氯酸钠溶液，具体过程为：先用70％乙醇漂洗30s，再利用10％次氯酸钠浸泡8min，最后再用无菌水冲洗3次。
7.根据权利要求1所述的组培用海岸松种子消毒的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，种子经第一次消毒后继续在30℃恒温下浸泡24h，期间每隔8h换等温水一次。
8.根据权利要求1所述的组培用海岸松种子消毒的方法，其特征在于，所述步骤(7)中，种子第二次消毒先后采用70％乙醇和0.1％HgCl2消毒，具体过程为：先用70％乙醇漂洗30s，再利用0.1％HgCl2消毒3min，最后再用无菌水冲洗4次。
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| JP2009240193A (ja) * | 2008-03-31 | 2009-10-22 | Shimizu Shoko Kaigisho | 光照射によるフラボノイド類合成系遺伝子の発現増強 |
| CN108887065A (zh) * | 2018-07-16 | 2018-11-27 | 安徽省强家庄生态农业有限公司 | 一种松树营林树种育苗及种植技术 |
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