CN108094202A

CN108094202A - 一种红花木莲外植体消毒方法、外植体及其应用

Info

Publication number: CN108094202A
Application number: CN201711384456.2A
Authority: CN
Inventors: 高宇琼; 郭春喜; 张福星; 田鹏; 付素静
Original assignee: Tongren University
Current assignee: Tongren University
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2017-12-20
Publication date: 2018-06-01

Abstract

本发明涉及一种红花木莲外植体消毒方法、外植体及其应用。所述消毒方法包括：使用质量分数为0.1～0.3％的HgCl₂溶液对经过预处理的外植体进行消毒，消毒时间为8～10min。本发明所述方法不但杀灭红花木莲外植体表面细菌的效果好，外植体污染率低，同时还兼顾保持外植体的活力，使外植体的杀伤率维持在较低水平，从而在整体上提高外植体的存活率。

Description

一种红花木莲外植体消毒方法、外植体及其应用

技术领域

本发明涉及组培领域，具体而言，涉及一种红花木莲外植体消毒方法、外植体及其应用。

背景技术

红花木莲(Manglietia insignis(Wall.)Bl.)为木兰科木莲属植物，被列为国家三级保护珍稀树种，属常绿阔叶乔木。红花木莲不仅是名贵稀有的园林观赏树种，而且具有很高的经济价值和药用价值。其花色鲜艳夺目；其果实为深红色，悬挂枝头，颇为美观，成为秋天一大景观；其树干通直，木材纹理通直，结构细密，有光泽、香味，心材耐腐，不翘不裂，加工容易，是优良的装饰用材和胶合板材树种；其树皮和枝皮具有行气醒脾、消积导滞的功效，用于脾湿所致纳呆少食、腹胀、脘腹不舒等症；治食积胃脘而腹痛、腹泻、嗳腐吞酸、舌苔厚腻等症。

红花木莲在自然界以零星分布为主，产于湖南西南部、广西、四川西南部、贵州(雷公山、梵净山、安龙)、云南(景东、无量山、红河、文山)、西藏东南部。生于海拔900-2600m常绿阔叶林或常绿落叶阔叶混交林中。尼泊尔、印度东北部、缅甸北部也有分布。在中国，至今全国尚未发现成片的红花木莲纯林，仅在云南发现一片混交林，是全国迄今发现最大的自然群落。

红花木莲分布区域广但分布零星，又由于红花木莲成熟胚囊的卵细胞败育率高和人为采伐利用等种种原因，成年植株数量逐渐减少，到濒危的境地。组织培养技术是保护濒危植物的有效途径之一。

利用组织培养技术，外植体的选取、预处理、消毒方法是组织培养技术成功的关键，也是保证成活率的关键。红花木莲腋芽比较鲜嫩，同时外带菌类较多，消毒较难。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种红花木莲外植体消毒方法，所述方法能够有效杀灭外植体表面的细菌，减少污染率，从而提高外植体在组培过程中的存活率。

本发明的第二目的在于提供一种根据上述方法获得的外植体，所述外植体具有消毒彻底、存活率高的优点。

本发明的第三目的在于提供一种上述外植体在制备红花木莲组培苗中的应用，上述应用具有显著提高组培的成功率。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种红花木莲外植体消毒方法，所述方法包括：使用质量分数为0.1～0.3％的HgCl₂溶液对经过预处理的外植体进行消毒，消毒时间为8～10min。

本发明考察不同浓度的HgCl₂、NaClO和Ca(ClO)₂溶液以及HgCl₂溶液的不同消毒时间对红花木莲外植体的消毒效果和成活率的影响，最终确定采用本发明上述方法对红花木莲进行消毒，该消毒方式不但杀灭红花木莲外植体表面细菌的效果好，与其他消毒剂或消毒时间相比，显著降低外植体的污染率，同时还兼顾保持外植体的活力，使外植体的杀伤率维持在较低水平，从而在整体上提高外植体的存活率。

在一些实施方式中，所述消毒的具体方式包括：(1)使用乙醇溶液浸润外植体；(2)使用无菌水洗涤所述外植体；(3)使用HgCl₂溶液浸润所述外植体，之后，使用无菌水洗涤并去除表面水分，置于无菌条件下备用，即得经过消毒的外植体。

在一些实施方式中，步骤(1)中所述乙醇溶液为体积分数为60～95％的乙醇溶液，优选为体积分数为75％的乙醇溶液，浸润时间为1～3min，优选为1min，2min或3min。

在一些实施方式中，步骤(3)中所述HgCl₂溶液的质量分数为0.1％，0.2％或0.3％，浸润时间为8min，9min，或10min。

在一些实施方式中，所述预处理包括：选择优良的红花木莲作为外植体母株，取外植体，经清洗和无菌水洗涤后备用。

在一些实施方式中，所述外植体母株为品种典型特性明显、无病虫害且长势强的优良红花木莲植株。

在一些实施方式中，所述清洗包括：将外植体放入烧杯中，加入洗衣粉，轻刷外植体表面，然后换水，再加入洗衣粉，并用纱布封住烧杯口，放在流水下冲洗30～90min，优选60min。

在一些实施方式中，所述外植体为腋芽、叶片或幼嫩的茎段；优选地，所述外植体为腋芽；更优选地，所述腋芽为表面无物理伤害、无病害、未有腐烂和形状完好的腋芽。

本发明还涉及根据上述方法获得的外植体，所述外植体在充分灭菌的同时还保持较高的活力，从而在整体上提升外植体的存活率。

本发明还涉及所述外植体在制备红花木莲组培苗中的应用，。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明所述外植体消毒方法不但杀灭红花木莲外植体表面细菌的效果好，与其他消毒剂或消毒时间相比，显著降低外植体的污染率，同时还兼顾保持外植体的活力，使外植体的杀伤率维持在较低水平，从而在整体上提高外植体的存活率。因此，由本发明所述方法获得的外植体具有污染率低、存活率高的特点，相应地，红花木莲组培的成功率也高。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

采用以下方法对用于组织培养的红花木莲外植体进行消毒：

(1)、选择具有品种典型特性明显、无病虫害、生长势强的优良红花木莲植株作为外植体母株，选取腋芽作为外植体；

(2)、取材后将腋芽置于盛有清水的烧杯中，利用毛刷轻刷腋芽表面，自来水冲洗2个小时，备用；

(3)、把腋芽放入烧杯中，加入洗衣粉，用细毛刷轻刷腋芽表面，然后换水，再加入洗衣粉，并用纱布封住烧杯口，放在自来水流水下冲洗60min，移到超净工作台；

(4)、用无菌水冲洗3次外植体材料，先在75％乙醇下浸润1min，再用无菌水冲洗3次；

(5)、以质量分数为0.1％的HgCl2对腋芽进行消毒，消毒时间为8min。

实施例2

采用以下方法对用于组织培养的红花木莲外植体进行消毒：

(5)、以质量分数为0.2％的HgCl2对腋芽进行消毒，消毒时间为8min。

实施例3

采用以下方法对用于组织培养的红花木莲外植体进行消毒：

(5)、以质量分数为0.3％的HgCl2对腋芽进行消毒，消毒时间为8min。

实施例4

采用以下方法对用于组织培养的红花木莲外植体进行消毒：

(1)选择具有品种典型特性明显、无病虫害、生长势强的优良红花木莲植株作为外植体母株，选取腋芽作为外植体；

(2)取材后将腋芽置于盛有清水的烧杯中，利用毛刷轻刷腋芽表面，自来水冲洗2个小时，备用；

(5)、以质量分数为0.1％的HgCl2对腋芽进行消毒，消毒时间为10min。

对比例1

(5)、以质量分数为3％的NaClO对腋芽进行消毒，消毒时间为8min。

对比例2

(5)、以质量分数为4％的NaClO对腋芽进行消毒，消毒时间为8min。

对比例3

(5)、以质量分数为9％的Ca(ClO)₂对腋芽进行消毒，消毒时间为8min。

对比例4

(5)、以质量分数为10％的Ca(ClO)₂对腋芽进行消毒，消毒时间为8min。

对比例5

参照实施例1所述方法对红花木莲的腋芽进行消毒，区别仅在于，消毒时间为2min。

对比例6

参照实施例1所述方法对红花木莲的腋芽进行消毒，区别仅在于，消毒时间为4min。

对比例7

参照实施例1所述方法对红花木莲的腋芽进行消毒，区别仅在于，消毒时间为6min。

对比例8

参照实施例1所述方法对红花木莲的腋芽进行消毒，区别仅在于，消毒时间为12min。

实验例1

将实施例1～3以及对比例1～4所述消毒后的腋芽移植到培养基中，进行无菌培养，并统计腋芽在组培过程中的污染率、杀伤率和存活率。具体检测结果参见表1。

表1的检测结果表明：HgCl2比NaClO、Ca(ClO)2的存活率都高，污染率也较其他消毒剂低，经HgCl2处理后的红花木莲腋芽外植体，存活数相对高、污染程度小，但是杀伤数比其他消毒剂大。不同浓度的NaClO、Ca(ClO)2的存活率相差不大，但污染率相差较大。不同浓度的相同消毒剂相比，均是高浓度的消毒效果比低浓度的好，但杀伤率也随之增大。总体来说，三种消毒剂之间HgCl2与NaClO、Ca(ClO)2存在显著差异，消毒效果为HgCl2＞Ca(ClO)2＞NaClO。在HgCl2两个浓度处理时，随着浓度的增大，污染率随之下降，但杀伤率也提高，存活率反而降低。因此，综合考虑污染率、杀伤率及存活率三者因素，本试验最适宜的消毒处理为处理①即0.1％HgCl2消毒8min的外植体存活率最高，达到81.1％。

表1不同消毒方式对红花木莲腋芽的消毒效果

处理编号	消毒剂	接种总数量/个	污染率/％	杀伤率/％	存活率/％
						实施例1	0.1％HgCl₂	90	12.2	6.7	81.1
实施例2	0.2％HgCl₂	90	8.9	15.6	75.6
						实施例3	0.3％HgCl₂	90	5.1	20.3	74.6
对比例1	3％NaClO	90	43.3	3.3	53.3
						对比例2	4％NaClO	90	33.3	6.7	60.0
对比例3	9％Ca(ClO)₂	90	35.6	5.5	58.9
						对比例4	10％Ca(ClO)₂	90	22.2	8.9	68.9

实验例2

将实施例1、5以及对比例5～8所述消毒后的腋芽移植到培养基中，进行无菌培养，并统计腋芽在组培过程中的污染率、杀伤率和存活率。具体检测结果参见表2。

表2的实验结果表明：随着消毒时间的增加，红花木莲腋芽外植体的存活率越来越高，在10min时红花木莲腋芽的成活率最高，达到84.4％。消毒时间太短，外植体的杀伤度较轻但其污染个数较多，而消毒时间太长，外植体的杀伤度较重但其污染个数较少。因此选用污染个数较少，杀伤率中等的，成活率相对较高时间，作为红花木莲腋芽外植体消毒时间的适宜时间。

表2不同消毒时间对红花木莲腋芽的消毒效果

	消毒时间	接种总数量/个	污染率/％	杀伤率/％	存活率/％
						对比例5	2min	90	53.3	0	46.7
对比例6	4min	90	38.9	2.2	58.9
						对比例7	6min	90	26.7	5.6	67.8
实施例1	8min	90	12.2	6.7	81.1
						实施例5	10min	90	4.4	11.1	84.4
对比例8	12min	90	0	37.8	62.2

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种对红花木莲外植体进行消毒的方法，其特征在于，所述方法包括：使用质量分数为0.1～0.3％的HgCl₂溶液对经过预处理的外植体进行消毒，消毒时间为8～10min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消毒的具体方式包括：(1)使用乙醇溶液浸润外植体；(2)使用无菌水洗涤所述外植体；(3)使用HgCl₂溶液浸润所述外植体，之后，使用无菌水洗涤并去除表面水分，置于无菌条件下备用，即得经过消毒的外植体。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述乙醇溶液为体积分数为60～95％的乙醇溶液，优选为体积分数为75％的乙醇溶液，浸润时间为1～3min，优选为1min，2min或3min。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述HgCl₂溶液的质量分数为0.1％，0.2％或0.3％，浸润时间为8min，9min，或10min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理包括：选择优良的红花木莲作为外植体母株，取外植体，经清洗和无菌水洗涤后备用。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述外植体母株为品种典型特性明显、无病虫害且长势强的优良红花木莲植株。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述清洗包括：将外植体放入烧杯中，加入洗衣粉，轻刷外植体表面，然后换水，再加入洗衣粉，并用纱布封住烧杯口，放在流水下冲洗30～90min，优选60min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外植体为腋芽、叶片或幼嫩的茎段；优选地，所述外植体为腋芽；更优选地，所述腋芽为表面无物理伤害、无病害、未有腐烂和形状完好的腋芽。

9.根据权利要求1～8任一项所述方法获得的外植体。

10.权利要求9所述外植体在制备红花木莲组培苗中的应用。