CN117233133A - 一种牛外周血cd4+、cd8+ t淋巴细胞流式检测试剂盒（间接荧光法） - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种牛外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞流式检测试剂盒(间接荧光法)。在圈定的淋巴细胞群中，筛选CD3、CD4均为阳性或CD3、CD8均为阳性的细胞亚群，并计算出双阳细胞的细胞数量或比例。
Description
技术领域
本发明涉及动物医学领域，具体为一种牛外周血CD4+、CD8+ T淋巴细胞流式检测试剂盒(间接荧光法)。
背景技术
CD3分子是T细胞重要的表面标志，CD3+淋巴细胞代表全T淋巴细胞。CD4+ T淋巴细胞是CD3和CD4双阳细胞，同样CD8+ T淋巴细胞是CD3和CD8双阳细胞。研究认为，淋巴细胞亚群的比例是奶牛免疫能力的重要指标，奶牛血液中CD4+/CD8+ T淋巴细胞比值与牛奶体细胞分呈显著负相关，对奶牛乳房炎的诊断具有重要意义；CD8+T淋巴细胞比例与繁殖力显著相关，可作为提高奶牛繁殖性能的有用标记。
目前检测CD4+ T、CD8+ T淋巴细胞主要有流式细胞术检测法和磁珠分选方法。
流式细胞术是利用单克隆抗体对样本中存在的特定细胞类型进行定量分析，可以实现一个样本的多参数高通量筛选。牛外周血CD4或CD8细胞不会自然发出荧光，使用荧光染料标记的单克隆抗体与细胞表面特异性抗原结合，当细胞通过流式细胞仪的激光束时，将出现荧光信号，通过测定荧光信号强度计算细胞数量。应用流式细胞术对人(或小鼠)进行T淋巴细胞分析，均是在CD3荧光抗体鉴定到的细胞群中识别CD4+、CD8+ T淋巴细胞亚群。而在牛上，仅使用CD4或CD8特异性单克隆荧光抗体通过流式细胞术检测出的阳性细胞，除了目标细胞外还包括其他细胞型别的非T淋巴细胞，比如CD3阴性的CD3-CD4+细胞或CD3-CD8+，准确性不高。
磁珠分选(MACS)方法，将特定单克隆抗体的免疫球蛋白的两条特异性F(ab)段的一条标记磁珠，另一条与细胞表面抗原的抗原决定簇特异性结合。这样，标记单抗后的CD4+、CD8+ T淋巴细胞经过MACS后，有磁性的细胞被吸附而得以分选。MACS每次只能根据一个参数分选，且纯度低于流式细胞仪方法，使用该方法对CD3+CD4+、CD3+CD8+双阳性T细胞进行鉴定是不可行的。
导致这些问题和缺点的原因：选择不同的荧光染料常用于识别不同的细胞亚群，同时检测CD3+CD4+、CD3+CD8+双阳性的细胞，则要求CD3、CD4和CD8抗体的荧光标记不同，且对应流式细胞仪不同的接收通道。目前市场上可用的牛CD4和CD8荧光标记抗体有限，CD3标记抗体种类更少，有BIO-RAD公司的Mouse anti Bovine CD3(MCA6080)、Invitrogen公司的MA5-28343等，抗原号均是MM1A，且不带荧光标记，需要选择合适的荧光标记二抗进行流式分析。人和小鼠的CD3抗体较多，但是不同物种间T细胞表面抗原表达差异较大，交叉反应性低，荧光标记的抗人(或小鼠)的CD3抗体不能应用于牛CD3+ T淋巴细胞的检测，如使用BIO-RAD公司的RAT ANTI HUMAN CD3(MCA1477)对牛外周血进行检测，未检测到CD3+阳性。此外，同时进行CD3、CD4和CD8多参数的综合分选，对抗体用量、孵育时间等预处理条件也提出了更高的要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞流式检测方法。一方面解决牛CD3阳性细胞流式细胞术检测的问题。根据一抗的物种来源和抗体亚型选择相应的荧光标记二抗，优化流式上机前预处理和检测条件，确保CD3阳性细胞的检出率。
另一方面解决CD3+CD4+和CD3+CD8+双阳性细胞的检测，在圈定的T淋巴细胞群中，筛选CD3、CD4均为阳性或CD3、CD8均为阳性的细胞亚群，计算出双阳细胞的含量。
本发明解决方案如下：一种牛外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞流式检测试剂盒(间接荧光法)，包含有如下步骤：
(1)使用EDTA抗凝采血管分别采集所需检测牛的全血，设置样品管、空白对照管、单阳对照管，所述单阳对照管包括CD3单阳管、CD4单阳管和CD8单阳管，也称单染管和同型对照管，所述同型对照管包括CD4同型对照管和CD8同型对照管；
(2)在样品管和对照管加入相应抗体后混匀，4℃避光孵育30min，孵育过程中每5min再混匀一次；
(3)孵育染色完成后，加入红细胞裂解液裂解，然后再经过离心弃上清、弹散细胞、清洗细胞、重悬细胞，空白对照管、除CD3单阳管外的单阳对照管和同型对照管等待上机检测；
(4)在样品管和CD3单阳管加入30μl 1:100荧光二抗，4℃避光孵育30min，所述荧光二抗是10μl Goat anti Mouse IgG1:FITC(STAR132F)溶于990μl staining buffer配制而成；
(5)孵育完成再次经过离心弃上清、弹散细胞、清洗细胞、重悬细胞，CD3单阳管等待上机检测；
(6)在样品管加5μl Mouse anti Bovine CD4:Alexa Fluor 647和5μl Mouseanti Bovine CD8:RPE，4℃避光孵育0.5h后上机检测。
进一步的，样品管中第二步加入的抗体是Mouse anti Bovine CD3，加入量为2.5μl。
进一步的，所述空白对照管、单阳对照管和同型对照管为全部待检血样的混合血。
进一步的，所述对照管包含有空白对照管、CD3单阳管、CD4单阳管、CD8单阳管、CD4同型对照、CD8同型对照，在第二步中放入的抗体分别为：staining buffer、Mouse antiBovine CD3、Mouse anti Bovine CD4:Alexa Fluor 647、Mouse anti Bovine CD8:RPE、Mouse IgG2a Negative Control:Alexa Fluor、Mouse IgG2a Negative Control:RPE。
进一步的，所述离心弃上清具体操作为，在4℃500g的条件下离心5min，离心完成后弃去上清，弹散细胞。
进一步的，所述清洗细胞具体操作为：加入1ml Flow Cytometry StainingBuffer洗涤一次，4℃500g离心5min，弃去上清，弹散细胞
进一步的，所述重悬细胞具体操作为：加入300μl Flow Cytometry StainingBuffer重悬细胞。
进一步的，所述空白对照管、CD3单阳管、CD4单阳管、CD8单阳管、CD4同型对照管和CD8同型对照管在第二步中放入抗体的量分别为：5μl、2.5μl、5μl、5μl、5μl、5μl。
本发明对CD3单阳管、CD4单阳管和CD8单阳管进行检测时，设置不同浓度梯度的抗体，推荐100μl抗凝血检测时，Mouse anti Bovine CD3、Mouse anti Bovine CD4:AlexaFluor 647、Mouse anti Bovine CD8:RPE三种抗体的最佳用量分别是2.5μl、5μl和5μl。
对CD3单阳管进行检测时，在一抗(Mouse anti Bovine CD3)孵育后的细胞悬液中添加荧光素标记二抗(Goat anti Mouse IgG1:FITC)时，设置不同的浓度梯度，推荐先将荧光二抗进行1:100稀释，再吸取30μl荧光二抗稀释液加入到300μl的悬浮细胞液中。
本发明的有益效果：
根据一抗(Mouse anti Bovine CD3)的抗体亚型(IgG1)和物种来源(小鼠)，选择相应的抗小鼠IgG1的荧光二抗，优化抗体稀释度、抗体用量等，组装了一种牛外周血CD4+、CD8+ T淋巴细胞流式检测试剂盒(间接荧光法)。选择对应不同检测通道的荧光染料标记的CD4单克隆抗体和CD8单克隆抗体，进而检测到CD3+CD4+和CD3+CD8+双阳细胞。
CD4+:CD8+比值是一种细胞介导的适应性免疫相关性状，与奶牛乳房健康、繁殖性能和生产性能存在相关性。本发明建立了利用间接荧光流式细胞术检测牛外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞的方法，一方面有利于对牛只健康状况进行评估，另一方面大量数据的积累可以实现牛CD3+CD4+、CD3+CD8+或CD4+:CD8+性状的遗传选择，可能成为改善动物健康、适应性和繁殖力的有用工具。
本发明设置了空白对照，选择和试验样品相同的抗凝血，除了使用stainingbuffer代替荧光抗体，其他处理都一致。一般用空白对照作为电压调节的参考，上机调电压的时候先要用空白管上机，调整电压参数使细胞信号出现在图FSC和SSC通道的合适位置。同时也可以看到细胞的本底信号，确保空白管不能出现染色样本预期的信号，或者在圈门时直接排除。
设置了单阳对照，做单染调节补偿，也就是扣除该荧光在其他检测通道中溢漏的信号。多色流式实验容易发生荧光渗漏，单染对照可以显示出不同荧光团之间光谱重叠的水平，并据此去除或补偿它们之间的重叠。
设置了同型对照，消除由于抗体非特异性结合到细胞表面Fc受体及静电结合而产生的背景染色。一方面可以准确地排除假阳性，另一方面也能帮助验证抗体的特异性。一般选择相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记由未免疫动物血清纯化而来的抗体。
以上空白对照、单阳对照和同型对照的设置，保证了检测结果的特异性。本发明首先检测CD3圈定总T淋巴细胞，再分别用CD4抗体和CD8抗体区分CD4+和CD8+ T淋巴细胞，与仅使用CD4或CD8抗体进行检测相比，提高了CD3+CD4+或CD3+CD8+双阳细胞的准确性。测试过程中选取10份不同的血样进行两次重复检测，CD3+CD4+双阳T细胞重复测定的变异系数2.41％，CD3+CD8+双阳T细胞的变异系数9.02％。综上，本试剂盒具有较好的特异性、准确性和可重复性，在牛免疫功能分析和健康牛只选育方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1所示是散射光信号区分裂解后的牛外周血细胞群；
图2所示是CD3单染管在各荧光通道下的细胞分布情况；
图3所示是CD4单染管在各荧光通道下的细胞分布情况；
图4所示是CD8单染管在各荧光通道下的细胞分布情况；
图5所示是CD4同型对照管在APC荧光通道下的细胞分布情况；；
图6所示是CD8同型对照管在PE荧光通道下的细胞分布情况；
图7所示是流式检测外周血样品1CD3/CD4、CD3/CD8双阳性细胞；
图8所示是流式检测外周血样品2CD3/CD4、CD3/CD8双阳性细胞；
图9所示是流式检测外周血样品3CD3/CD4、CD3/CD8双阳性细胞。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述：
本发明所用流式细胞检测仪是型号Cytoflex S，来源Beckman公司。
实施例1
1试验材料准备
耗材：EDTA采血管，冰袋，泡沫盒，EP管(1.5mL规格)，红细胞裂解液，FlowCytometry Staining Buffer(流式细胞术染色缓冲液)，移液枪三把(1ml，20-200μl，0.5-20μl)、枪头两盒，离心机，流式管，200目滤网。
抗体试剂：①Mouse anti Bovine CD3(鼠抗牛)，②Mouse anti Bovine CD4:Alexa Fluor 647，③Mouse
anti Bovine CD8:RPE，④Mouse IgG2a Negative Control:Alexa Fluor，⑤Mouse IgG2a Negative Control:RPE，⑥Goat anti Mouse IgG1:FITC
2试剂配制
1:100二抗：10μl Goat anti Mouse IgG1:FITC(STAR132F)溶于990μl stainingbuffer
Flow Cytometry Staining Buffer：1×无钙镁PBS+1％ BSA+2mM EDTA+0.1％叠氮化钠(NaN3)
FlowClean溶液：2％的次氯酸钠溶液5～6倍稀释，并用0.2μm过滤膜过滤。
3流式上机前处理
(1)使用5ml EDTA抗凝采血管分别采集3头牛的全血作为三份待检血样，上下摇匀，确保抗凝剂与血液充分结合，置于冰盒里，运回实验室。
(2)在上一步采回的3份待检血样中，每份取400μl于1.5ml EP管中混合均匀(样本量多时也可选取任一血样)，然后在上述EP管中分别取100μl混合抗凝血于6个EP管中，分别标记Blank(空白对照)、CD3单染管、CD4单染管、CD8单染管、CD4同型对照、CD8同型对照。
(3)每份待检血样取100μl于3个不同的EP管中，分别标记为样品1、2、3。
(4)在2、3步产生的各管中分别加入相应的抗体后混匀，加入抗体的种类和用量见表一，混匀的方法建议使用弹管子的方法，尽量不要用枪头吹打，混匀后4℃避光孵育30min，在此过程中细胞与抗体结合，孵育过程中再每5min混匀一次，使结合更充分。
表一各管加入的抗体名称和抗体用量
| EP管标记 | 添加抗体 | 抗体用量 |
| Blank | Staining buffer | 5μl |
| CD3单染管 | Mouse anti Bovine CD3 | 2.5μl |
| CD4单染管 | Mouse anti Bovine CD4:Alexa Fluor 647 | 5μl |
| CD8单染管 | Mouse anti Bovine CD8:RPE | 5μl |
| CD4同型对照 | Mouse IgG2a Negative Control:Alexa Fluor | 5μl |
| CD8同型对照 | Mouse IgG2a Negative Control:RPE | 5μl |
| 样品1、2、3 | Mouse anti Bovine CD3 | 2.5μl |
(5)在各管中加入1ml红细胞裂解液冰上裂解5min，裂解过程要混匀细胞，确保充分溶解，使裂解更充分。
(6)将裂解完成的各管在4℃500g的条件下离心5min，离心完成后弃去上清，弹散细胞。
(7)清洗细胞，在各管中加入1ml Flow Cytometry Staining Buffer洗涤一次，4℃500g离心5min，弃去上清，弹散细胞。
(8)然后再各管中加入300μl Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞。
(9)将Blank、CD4单染管、CD8单染管、CD4同型对照、CD8同型对照管，4℃避光存放，待上机检测。
(10)在CD3单染管和样品管1、2、3中，分别加入30μl 1:100荧光二抗，4℃避光孵育30min。
(11)将上一步孵育完成的四个管，4℃500g离心5min，弃去上清，弹散细胞。然后按照(7)、
(8)步骤清洗细胞。
(12)CD3单染管4℃避光存放，待上机检测。
(13)在样品管1、2、3中加5μl Mouse anti Bovine CD4:Alexa Fluor 647和5μlMouse anti Bovine CD8:RPE，4℃避光孵育30min。
(14)样品处理期间，应检查鞘液桶确认有足量的鞘液且不超过指示上限，同时清空废液桶，打开仪器电源，打开CytExpert软件，确保联机工作正常。
(15)将2mL FlowClean溶液添加至未使用的样品试管中，将试管插入样品托架中，并选择运行5min。拆下流动清洁试管。
(16)将2mL去离子水添加至未使用的样品试管，将试管插入样品托架中，并选择运行5min。
(17)检测样品管流式上机检测。
流式检测图谱分析
(1)先将Blank管上机检测，圈定目的细胞群(淋巴细胞)，如图1所示。
(2)各单染管和同型对照依次上机检测，
CD3单染管流式图如图2所示；左图，圈定的P1门里，FITC荧光通道下淋巴细胞明显分群，右侧为CD3阳性淋巴细胞；中间图，圈定的P1门里，FITC荧光通道下淋巴细胞明显分群，而APC荧光通道没有阳性细胞；右图：圈定的P1门里，FITC荧光通道下淋巴细胞明显分群，而PE荧光通道没有阳性细胞。
CD4单染管流式图如图3所示；左图，圈定的P1门里，APC荧光通道下淋巴细胞明显分群，右侧为CD4阳性淋巴细胞；中间图，圈定的P1门里，APC荧光通道下淋巴细胞明显分群，而FITC荧光通道没有阳性细胞；右图：圈定的P1门里，APC荧光通道下淋巴细胞明显分群，而PE荧光通道没有阳性细胞。
CD8单染管流式图如图4所示；左图，圈定的P1门里，PE荧光通道下淋巴细胞明显分群，右侧为CD8阳性淋巴细胞；中间图，圈定的P1门里，PE荧光通道下淋巴细胞明显分群，而FITC荧光通道没有阳性细胞；右图：圈定的P1门里，PE荧光通道下淋巴细胞明显分群，而FITC荧光通道没有阳性细胞。
CD4同型对照管流式图如图5所示；在APC荧光通道下几乎没有阳性细胞；
CD8同型对照管流式图如图6所示；在PE荧光通道下几乎没有阳性细胞；
(3)样品管上机检测，样品1流式图如图7所示：左图：第一象限为CD3/CD4双阳性细胞，是真正的CD4+T淋巴细胞，代表辅助型T(Th)细胞亚群，占比22.3％；第二象限为CD3+CD4-淋巴细胞；第三象限是CD3-CD4-淋巴细胞；第四象限是CD3-CD4+淋巴细胞，非Th细胞。
右图：第一象限为CD3/CD8双阳性细胞，是真正的CD8+T淋巴细胞，代表抑制型T(Ts)细胞亚群，占比2.38％。第二象限为CD3+CD8-淋巴细胞；第三象限是CD3-CD8-淋巴细胞；第四象限是CD3-CD8+淋巴细胞，非Ts细胞。
样品2流式图如图8所示：左图：第一象限为CD3/CD4双阳性细胞，是真正的CD4+T淋巴细胞，代表辅助型T(Th)细胞亚群，占比18.34％；第二象限为CD3+CD4-淋巴细胞；第三象限是CD3-CD4-淋巴细胞；第四象限是CD3-CD4+淋巴细胞，非Th细胞。
右图：第一象限为CD3/CD8双阳性细胞，是真正的CD8+T淋巴细胞，代表抑制型T(Ts)细胞亚群，占比2.37％；第二象限为CD3+CD8-淋巴细胞；第三象限是CD3-CD8-淋巴细胞；第四象限是CD3-CD8+淋巴细胞，非Ts细胞。
样品3流式图如图9所示：左图：第一象限为CD3/CD4双阳性细胞，是真正的CD4+T淋巴细胞，代表辅助型T(Th)细胞亚群，占比20.49％；右图：第一象限为CD3/CD8双阳性细胞，是真正的CD8+T淋巴细胞，代表抑制型T(Ts)细胞亚群，占比2.57％。第二象限为CD3+CD8-淋巴细胞；第三象限是CD3-CD8-淋巴细胞；第四象限是CD3-CD8+淋巴细胞，非Ts细胞。第二象限为CD3+CD4-淋巴细胞；第三象限是CD3-CD4-淋巴细胞；第四象限是CD3-CD4+淋巴细胞，非Th细胞。
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种牛外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞流式检测试剂盒(间接荧光法)，其特征在于，包含有如下步骤：
(1)使用EDTA抗凝管采集待检牛只全血，设置样品管、空白对照管、单阳对照管，所述单阳对照管包括CD3单阳管、CD4单阳管和CD8单阳管，也称单染管和同型对照管，所述同型对照管包括CD4同型对照管和CD8同型对照管；
(2)在样品管和对照管加入相应抗体后混匀，4℃避光孵育或染色30min，孵育过程中再每5min混匀一次；
(3)孵育完成后，加入红细胞裂解液裂解，然后再经过离心弃上清、弹散细胞、清洗细胞、重悬细胞，空白对照管、除CD3单阳管外的单阳对照管和同型对照管等待上机检测；
(4)在样品管和CD3单阳管加入30μl 1:100荧光二抗，4℃避光孵育30min，所述荧光二抗是10μl Goat anti Mouse IgG1:FITC，STAR132F；溶于990μlstaining buffer配制而成；
(5)孵育完成再次经过离心弃上清、弹散细胞、清洗细胞、重悬细胞，CD3单阳管等待上机检测；
(6)在样品管加5μl Mouse anti Bovine CD4:Alexa Fluor 647和5μl Mouse antiBovine CD8:RPE，4℃避光孵育30min后上机检测。
2.根据权利要求1所述的牛外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞流式检测试剂盒(间接荧光法)，其特征在于，样品管中第二步加入的抗体是Mouse anti Bovine CD3，加入量为2.5μl。
3.根据权利要求1所述的牛外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞流式检测试剂盒(间接荧光法)，其特征在于，所述空白对照管、单阳对照管和同型对照管为全部待检血样的混合血。
4.根据权利要求1所述的牛外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞流式检测试剂盒(间接荧光法)，其特征在于，所述空白对照管、CD3单阳管、CD4单阳管、CD8单阳管、CD4同型对照管和CD8同型对照管在第二步中放入的抗体分别为：staining buffer、Mouse anti BovineCD3，Mouse anti Bovine CD4:Alexa Fluor，Mouse anti Bovine CD8:RPE，Mouse IgG2aNegative Control:Alexa Fluor、Mouse IgG2a Negative Control:RPE。
5.根据权利要求1所述的牛外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞流式检测试剂盒(间接荧光法)，其特征在于，所述离心弃上清具体操作为，在4℃500g的条件下离心5min，离心完成后弃去上清，弹散细胞。
6.根据权利要求1所述的牛外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞流式检测试剂盒(间接荧光法)，其特征在于，所述清洗细胞具体操作为：加入1ml Flow Cytometry Staining Buffer洗涤一次，4℃500g离心5min，弃去上清，弹散细胞。
7.根据权利要求1所述的牛外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞流式检测试剂盒(间接荧光法)，其特征在于，所述重悬细胞具体操作为：加入300μl Flow Cytometry StainingBuffer重悬细胞。
8.根据权利要求4所述的牛外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞流式检测试剂盒(间接荧光法)，其特征在于，所述空白对照管、CD3单阳管、CD4单阳管、CD8单阳管、CD4同型对照管和CD8同型对照管在第二步中放入抗体的量分别为：5μl、2.5μl、5μl、5μl、5μl、5μl。
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| CN202311203495.3A CN117233133A (zh) | 2023-09-19 | 2023-09-19 | 一种牛外周血cd4+、cd8+ t淋巴细胞流式检测试剂盒（间接荧光法） |
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