CN117210433A - 超速高保真兼并逆转录dna聚合酶和基于该酶的基因扩增、逆转录方法以及试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因蛋白质工程技术领域，涉及聚合酶链反应技术，具体涉及超速高保真兼并逆转录DNA聚合酶和基于该酶的基因扩增、逆转录方法以及试剂。本方案的超速高保真兼并逆转录DNA聚合酶由氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型Tth聚合酶经突变获得。本方案的DNA聚合酶可以显著提升PCR扩增效率、逆转录效率，以及缩短PCR过程对于延伸时长的要求进而缩短反应时间。本技术方案的DNA聚合酶可应用于聚合酶链式反应和/或逆转录反应中，构建聚合酶链式反应试剂或者逆转录反应试剂。本技术方案可以解决现有技术中具有逆转录功能的DNA聚合酶的逆转录活性以及扩增速度不理想的技术问题，具有理想的推广应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因蛋白质工程技术领域，涉及聚合酶链反应技术，具体涉及超速高保真兼并逆转录DNA聚合酶和基于该酶的基因扩增、逆转录方法以及试剂。
背景技术
聚合酶链反应技术(PCR)自1985年诞生以来，已经被广泛用于基因扩增，基因测序，核酸检测分析等领域。PCR的主要原理是在不断的变性，退火，延伸反应的重复循环下，实现目标DNA的扩增。DNA聚合酶以模板DNA为指导，负责合成新的单链DNA互补链。因此，在PCR扩增反应中，DNA聚合酶是一种最为核心的组分。DNA聚合酶的性能直接决定了扩增反应的灵敏度，扩增效率，扩增速度等。来自嗜热古菌如Thermus aquaticus(Taq),Thermusthermophilus(Tth)，Pyrococcus furiosus(Pfu、Vent、DEEP VENT)的DNA聚合酶被广泛应用。
在进行RNA模板的扩增时，通常需要将RNA反转录为cDNA,以便充分发挥模板的作用让DNA聚合酶识别。但在应用过程中，逆转录这一步反应会消耗大量的劳动及时间。此外，逆转录过程涉及单独的逆转录酶系统，该系统需要单独进行反应，这使得检测成本大大增加。在某些病原核酸检测试剂中，通常将逆转录酶与Taq酶共同加入到一个反应体系中。研究显示，逆转录酶能够抑制Taq酶的活性。因此，该反应体系可能不稳定或扩增效率降低。因此，需要一种能够同时具备逆转录及DNA聚合酶活性的酶来解决上述问题。Andreas等人通过在Taq酶中引入突变(L322M,L459M,S515R,I638F,S739G及E733G)，使得Taq酶具备了一定的逆转录酶活性，但其逆转录的性能较逆转录酶还存在较大差距。来源于Thermusthermophilus(Tth)HB8的DNA聚合酶被证明存在逆转录功能，其最适温度为70-74℃，延伸速率为1.5kb/min。其发挥逆转录作用需要Mn离子的参与。但其逆转录功能与MLV等逆转录酶相比，存在差距。尤其是在涉及高灵敏度要求的检测中，在RNA模板数低于一定水平后，TthDNA单酶实现逆转录定量PCR的检测极限达不到传统taq酶与MLV混合体系的水平。因此，改造TthDNA聚合酶使其具备更好的单酶RNA检测的能力，具有重要意义。
发明内容
本发明意在提供一种超速高保真兼并逆转录DNA聚合酶，以解决现有技术中具有逆转录功能的DNA聚合酶的逆转录活性以及扩增速度不理想的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
超速高保真兼并逆转录DNA聚合酶，由氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型Tth聚合酶经突变获得。
氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型Tth聚合酶产生如下突变：187位氨基酸由V突变为I，316位氨基酸由P突变为K,563位氨基酸由H突变为R，542位氨基酸由K突变为L,599位氨基酸由A变为K，667位氨基酸由V突变为H，732位氨基酸由V变M，736位氨基酸由N变为E，经突变获得突变型Tth聚合酶MT-TTH812。
氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型Tth聚合酶产生如下突变：118位的氨基酸由E突变为D，578位的氨基酸由S突变为D,584位的氨基酸由Q突变为E，600位的氨基酸由V突变为L，572位的氨基酸由A突变为E，423位的氨基酸由E变为H，343位的氨基酸由G突变为E，经突变获得突变型Tth聚合酶MT-TTH537。
氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型Tth聚合酶产生如下突变：316位的氨基酸由P突变为K，325位的氨基酸由A突变为P，406位的氨基酸由H突变为R，441位的氨基酸由R突变为Q，710位的氨基酸由E突变L，786位的氨基酸由H突变为Q，613位的氨基酸由Y变为H，409位的氨基酸由L变为W，经突变获得突变型Tth聚合酶MT-TTH161。
进一步，突变型Tth聚合酶MT-TTH812、突变型Tth聚合酶MT-TTH537或突变型Tth聚合酶MT-TTH161的N端、中间位置或C端经过引入结构域的改造；所述结构域为用于提高酶稳定性或者酶性能的DNA结合结构域或者RNA结合结构域。
本技术方案还提供了一种超速高保真兼并逆转录DNA聚合酶的制备方法，构建表达载体，再使用表达载体转化感受态细胞，获得工程菌；诱导工程菌表达氨基酸序列如SEQID NO.4所示或者如SEQ ID NO.5所示或者如SEQ ID NO.6所示的蛋白。
本技术方案还提供了一种超速高保真兼并逆转录DNA聚合酶在聚合酶链式反应和/或逆转录反应中的应用。
本技术方案还提供了一种超速高保真兼并逆转录DNA聚合酶的基因扩增和/或逆转录的方法，使用突变型Tth聚合酶MT-TTH812、突变型Tth聚合酶MT-TTH537或突变型Tth聚合酶MT-TTH161作为DNA聚合酶，进行聚合酶链式反应扩增目的DNA片段的拷贝数；
或者，使用突变型Tth聚合酶MT-TTH812、突变型Tth聚合酶MT-TTH537或突变型Tth聚合酶MT-TTH161作为逆转录酶，将目的RNA逆转录为cDNA；
或者，使用突变型Tth聚合酶MT-TTH812、突变型Tth聚合酶MT-TTH537或突变型Tth聚合酶MT-TTH161，先作为逆转录酶将目的RNA逆转录为目的cDNA，然后作为DNA聚合酶扩增目的cDNA的拷贝数。
使用本方案的突变型Tth聚合酶MT-TTH812、突变型Tth聚合酶MT-TTH537或突变型Tth聚合酶MT-TTH161，可代替常规聚合酶链式反应(PCR)体系、逆转录(RT)体系、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)体系中的DNA聚合酶和逆转录酶。除了在反应体系加入本方案酶活必须的Mn离子外，其他试剂采用现有技术常规的PCR以及RT-PCR所用试剂，即可实现高效、快速反应，并且同时提升逆转录和DNA扩增两方面的活性。
本技术方案还提供了一种聚合酶链式反应试剂，包括DNA聚合酶、dNTP、上下游引物、含Mn离子的缓冲液；所述DNA聚合酶选自突变型Tth聚合酶MT-TTH812、突变型Tth聚合酶MT-TTH537和突变型Tth聚合酶MT-TTH161中的至少一种。
本技术方案还提供了一种逆转录反应试剂，包括逆转录酶和含Mn离子的缓冲液；所述逆转录酶选自突变型Tth聚合酶MT-TTH812、突变型Tth聚合酶MT-TTH537和突变型Tth聚合酶MT-TTH161中的至少一种。
本技术方案的原理在于：
本方案在原DNA聚合酶的基础上引入突变以提升酶性能。当前，提升PCR反应的速度，提高扩增片段长度，提升扩增产物量，提高保真度是DNA聚合酶改造的主要改造方向。在某些应用场景中，反应体系中的糖分子，蛋白分子等会降低扩增效率，导致信号减弱或消失。因此，实现更好的单酶RNA模板的DNA扩增，可实现体系的抗逆性能，实现更快的扩增速度将极大的促进RNA扩增的效率，提高RNA的检出速度。
发明人在突变筛选阶段，通过易错PCR，获得了2543个克隆，其中只有1237个出现扩增信号，并且大部分出现扩增信号的克隆其信号强度(通过CT值体现)不及野生型。经初步验证，其中仅有32个克隆的CT值明显小于野生型。在PCR反应中,CT值是指在反应过程中,荧光信号达到设定阈值所需的循环数，CT值越小就说明酶的催化效率越高。再经过复核，其中仅有MT-TTH812克隆、MT-TTH537克隆及MT-TTH161克隆的CT值不但明显小于野生型，而且在多次实验中显示出了更高的稳定性。因此，本发明提供的DNA聚合酶，较野生型DNA聚合酶，具有更快的延伸速率及更优异的逆转录功能，其能够缩短RT-PCR反应的时间，更好的实现单酶的RNA扩增检测或DNA扩增。
本方案所达到的有益效果在于：
本方案通过易错PCR筛选出的DNA聚合酶除具备较好的DNA聚合酶能力外，还具有显著的逆转录酶功能。该DNA聚合酶具有一定抗逆能力，能够直接从血液中扩增目的基因。本方案获得的DNA聚合酶具有更快速的扩增能力，能够实现1-3秒扩增0.5kb长度DNA的能力。本方案的三种突变体，均可以提升PCR扩增效率，其中，MT-TTH537针对于各类型的待扩增基因效果更为优异。通过突变酶的逆转录活性提升，特别是MT-TTH161具有优良的单酶实现一步法检测RNA的能力，其效果由于现有技术常用的MLV+Taq酶的组合。并且在快速PCR的测试中，MT-TTH537及MT-TTH161可以显著提升扩增速度。
附图说明
图1为本发明实施例4的PCR测试电泳图(肌动蛋白)。
图2为本发明实施例4的PCR测试电泳图(CCR5)。
图3为本发明实验例5的RT-PCR测试的实时荧光信号检测结果图。
图4为本发明实验例6的快速PCR测试电泳图(60s)。
图5为本发明实验例6的快速PCR测试电泳图(30s)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的分子克隆技术(参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
在方案中，氨基酸用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示：甘氨酸用G或Gly表示，丙氨酸用A或Ala表示，缬氨酸用Val或V表示，亮氨酸用Leu或L表示，异亮氨酸用Ile或I表示，脯氨酸用Pro或P表示，苯丙氨酸用Phe或F表示，酪氨酸用Tyr或Y表示，色氨酸用Trp或W表示，丝氨酸用Ser或S表示，苏氨酸用Thr或T表示，半胱氨酸用Cys或C表示，蛋氨酸用Met或M表示，天冬酰胺用Asn或N表示，谷氨酰胺用Gln或Q表示，天冬氨酸用Asp或D表示，谷氨酸用Glu或E表示，赖氨酸用Lys或K表示，精氨酸用Arg或R表示，组氨酸用His或H表示。碱基也用本领域公知的单字母来表示：腺嘌呤用A表示，鸟嘌呤用G表示，胞嘧啶用C表示，胸腺嘧啶用T表示，尿嘧啶用U表示。
实施例1：定向突变体的筛选
为获得突变体，应用在pet20b载体NdeI和XhoI位点插入的SEQ ID NO.1(pet20b-TTH，对应的氨基酸序列参见SEQ ID NO.2)为模板，应用易错PCR试剂盒对编码酶的DNA进行了PCR扩增，序列情况具体如下：
野生型Tth聚合酶的基因序列(SEQ ID NO.1)：
ATGGAAGCAATGCTGCCGCTGTTTGAACCGAAAGGTCGTGTTCTGCTGGTTGATGGTCATCATCTGGCATATCGTACCTTTTTTGCACTGAAAGGTCTGACCACCAGCCGTGGTGAACCGGTTCAAGCAGTTTATGGTTTTGCAAAAAGCCTGCTGAAAGCCCTGAAAGAAGATGGTTATAAAGCCGTGTTTGTGGTGTTCGATGCAAAGGCACCGAGCTTTCGTCATGAAGCCTATGAAGCATATAAGGCCGGTCGTGCACCGACCCCGGAAGATTTTCCTCGTCAGCTGGCACTGATTAAAGAACTGGTTGATCTGCTGGGTTTTACCCGTCTGGAAGTTCCGGGTTATGAAGCAGATGATGTTCTGGCAACCCTGGCAAAAAAAGCAGAAAAAGAAGGTTATGAGGTGCGCATCCTGACCGCAGATCGTGATCTGTATCAGCTGGTTAGCGATCGTGTTGCAGTTCTGCATCCGGAAGGTCATCTGATTACCCCGGAATGGCTGTGGGAAAAATATGGTCTGCGTCCGGAACAGTGGGTTGATTTTCGTGCACTGGTTGGTGATCCGAGCGATAATCTGCCGGGTGTTAAAGGTATTGGTGAAAAAACCGCACTGAAACTGCTGAAAGAATGGGGTAGCCTGGAAAATCTGCTGAAAAATCTGGATCGTGTTAAGCCGGAAAATGTGCGCGAAAAAATTAAGGCCCATCTGGAGGATCTGCGCCTGAGCTTAGAACTGAGCCGTGTTCGTACAGATCTGCCGCTGGAAGTTGATCTGGCACAGGGTCGTGAACCGGATCGTGAAGGTCTGCGTGCATTTCTGGAACGTCTGGAATTTGGTAGCCTGCTGCATGAATTTGGTCTGCTGGAAGCACCGGCACCGCTGGAAGAAGCACCTTGGCCTCCTCCTGAAGGTGCATTTGTTGGTTTTGTTCTGAGCCGTCCGGAACCGATGTGGGCAGAATTAAAAGCACTGGCAGCATGTCGTGATGGTCGTGTTCATCGTGCAGCAGATCCGCTGGCAGGTCTGAAAGATCTGAAAGAAGTTCGTGGTCTGCTGGCAAAAGATCTGGCAGTTCTGGCAAGCCGTGAAGGTCTGGATCTGGTTCCGGGTGATGATCCGATGCTGCTGGCATATCTGCTGGATCCGAGCAATACCACCCCGGAAGGTGTTGCACGTCGTTATGGTGGTGAATGGACCGAAGATGCAGCACATCGTGCACTGCTGAGCGAACGTCTGCATCGTAATCTGCTGAAACGTCTGGAAGGTGAAGAAAAACTGCTGTGGCTGTATCATGAAGTTGAAAAACCGCTGAGCCGTGTTCTGGCACACATGGAAGCAACCGGTGTTCGTCTGGATGTTGCATATCTGCAGGCACTGAGCCTGGAACTGGCAGAAGAAATTCGTCGTCTGGAAGAAGAAGTTTTTCGCCTGGCAGGTCATCCGTTTAATCTGAATAGCCGTGATCAGCTGGAACGTGTTCTGTTTGATGAACTGCGTCTGCCGGCACTGGGTAAAACCCAGAAAACCGGTAAACGTAGCACCAGCGCAGCAGTTCTGGAAGCACTGCGTGAAGCACATCCGATTGTTGAAAAAATTCTGCAGCATCGCGAACTGACCAAACTGAAAAATACCTATGTGGACCCGCTGCCGAGCCTGGTTCATCCGCGTACAGGTCGTTTACATACCCGTTTTAATCAGACCGCAACCGCAACCGGTCGTCTGAGCAGTAGTGATCCGAATCTGCAGAATATTCCGGTTCGTACCCCGCTGGGTCAGCGTATTCGTCGTGCATTTGTTGCAGAAGCAGGTTGGGCACTGGTTGCACTGGATTATAGCCAGATTGAACTGCGTGTTCTGGCACATCTGAGCGGTGATGAAAATCTGATTCGTGTTTTTCAGGAGGGCAAAGACATTCACACCCAGACCGCAAGCTGGATGTTTGGTGTTCCGCCGGAAGCAGTTGATCCGCTGATGCGTCGTGCAGCAAAAACCGTTAATTTTGGTGTTCTGTATGGCATGAGCGCACATCGTCTGAGCCAGGAACTGGCAATTCCGTATGAAGAAGCAGTTGCATTTATTGAGCGTTACTTCCAGAGCTTTCCGAAAGTGCGCGCATGGATTGAAAAAACCCTGGAAGAAGGTCGTAAACGCGGTTATGTTGAAACCCTGTTTGGTCGTCGTCGTTATGTTCCGGATCTGAATGCACGTGTTAAAAGCGTTCGTGAAGCAGCAGAACGTATGGCATTTAATATGCCGGTTCAGGGTACCGCAGCAGATCTGATGAAACTGGCAATGGTTAAACTGTTTCCGCGTCTGCGTGAAATGGGTGCACGTATGCTGCTGCAGGTTCATGATGAACTGCTGCTGGAAGCACCGCAGGCACGTGCAGAAGAAGTTGCAGCACTGGCAAAAGAAGCAATGGAAAAAGCATATCCGCTGGCAGTTCCGCTGGAAGTTGAAGTTGGTATGGGTGAAGATTGGCTGAGCGCAAAAGG；
野生型Tth聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)：
MEAMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGYKAVFVVFDAKAPSFRHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGFTRLEVPGYEADDVLATLAKKAEKEGYEVRILTADRDLYQLVSDRVAVLHPEGHLITPEWLWEKYGLRPEQWVDFRALVGDPSDNLPGVKGIGEKTALKLLKEWGSLENLLKNLDRVKPENVREKIKAHLEDLRLSLELSRVRTDLPLEVDLAQGREPDREGLRAFLERLEFGSLLHEFGLLEAPAPLEEAPWPPPEGAFVGFVLSRPEPMWAELKALAACRDGRVHRAADPLAGLKDLKEVRGLLAKDLAVLASREGLDLVPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEDAAHRALLSERLHRNLLKRLEGEEKLLWLYHEVEKPLSRVLAHMEATGVRLDVAYLQALSLELAEEIRRLEEEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELRLPALGKTQKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQHRELTKLKNTYVDPLPSLVHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFVAEAGWALVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGKDIHTQTASWMFGVPPEAVDPLMRRAAKTVNFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAVAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRKRGYVETLFGRRRYVPDLNARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLREMGARMLLQVHDELLLEAPQARAEEVAALAKEAMEKAYPLAVPLEVEVGMGEDWLSAK。
易错PCR试剂盒理论上能够在1kb的DNA序列中，引入7-8个碱基的突变。首先将模板pet20b-TTH进行线性化，以DNA内切酶NdeI和NcoI酶切3小时，进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的片段。Nanodrop测定回收DNA的浓度。以50000拷贝的线性化质粒为模板，进行PCR反应。反应条件如下：94℃变性60s，94℃15s，60℃15s，72℃2min，从第二步起35循环。将PCR产物进行1万倍稀释，继续进行第二轮，第三轮,第四轮PCR扩增，方法同上。对最后一步PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收。用NcoI和XhoI酶切的PCR产物与Bam H1和Xho I酶切的Pet21a空质粒以2:1的比例用T4 DNA连接酶连接。10μL连接产物加入到100μL BL21Rocetta感受态中，42℃热激60s后，加入700μL LB培养基，37μL活化1小时，涂布氨苄抗性平板，每个平板涂布100μL菌液，共涂布8个平板。37μL培养12h，以每个平板长出200-300个菌落为合适的涂布稀释度。
待菌落长出后，挑取单菌落至锥底96孔培养板，每个孔中有150μL LB培养基。共挑取26个96孔板。30℃培养过夜。以排枪吸取1微升菌液至新的96孔板中，剩余的菌液中加入终浓度10％的甘油，至-20℃冻存。总计有2534个单克隆被挑取至含有100μL LB培养基的96孔板中，37℃摇床，220rpm培养培养过夜，加入150℃含有1mM IPTG的LB培养基。震荡均匀后，20℃继续培养12小时。离心，去除上清，加入裂解缓冲液。
转化未经过易错PCR的原始TTH表达质粒至BL21 Rocetta表达菌株。得到表达菌株单克隆，按照上述步骤扩增后加入裂解液，缓冲液的配比为：Tris(pH8.0)50mM、EDTA 1mM、MgCl2 6mM、吐温20 0.5％(v/v)、溶菌酶(粉末状)1mg/mL、DNase I 0.05U/μL。
菌体37℃裂解20min，放入-20℃，重复上述步骤1次。平板放置于75℃水浴锅，热处理30min，注意密封，3000rpm离心30min。上清转移至新的96孔板中。在96孔定量PCR板中加入23μL PCR预混合液(20mM Tris-HCl,pH8.0,100mM KCl,2.5mM Mn(OAc)2,0.2％吐温20，人肌动蛋白上游引物0.5μL、下游引物0.5μL,人总RNA 0.5μL，10mM dNTP 1μL，1×SYBRGreen I 0.5μL)，加入2微升上述离心后得到的上清。设置不加模板阴性对照，阳性对照(TAKARA SYBR Green I定量检测试剂盒)。
以上述混合液离心封板后，进行荧光定量PCR扩增。以总RNA为模板，人肌动蛋白上游引物:AGAAAATCTGGCACCACC(SEQ ID NO.9)；下游引物：AGAGGCGTACAGGGATAGCA(SEQ IDNO.10)设置程序如下：95℃变性2min，94℃15s，60℃15s，从第二步起40个循环，收集荧光信号。在所检测的2543个克隆中，有1237个出现扩增信号，其中CT值明显小于未突变组(1＜)的克隆数为32个(CT值较野生型减少)，其中MT-TTH812克隆、MT-TTH537克隆及MT-TTH161克隆的CT值最小,较未突变组减少3个CT值以上。其中，在PCR反应中,CT值是指在反应过程中,荧光信号达到设定阈值所需的循环数。
对上述32个克隆进行第二轮确认，方法同上。此次确认其中29个克隆存在扩增信号增强的现象。第二轮确认重复实验三次，选取其中重复性较好的MT-TTH812克隆(CT值较野生型Tth平均减少4.65，三次重复的标准方差SD为0.69)、MT-TTH537克隆(CT值较野生型Tth平减少4.17，三次重复的标准方差SD为0.48)及MT-TTH161克隆(CT值较野生型Tth平减少5.26，三次重复的标准方差SD为0.54)进行单克隆测序，得到突变后序列。而采用其他26个克隆均存在CT值减少量过小(＜2)的问题，并且26个克隆的部分克隆存在三次重复的标准方差SD过大(准方差SD值＞1)的问题。通过突变的方式筛选获得正向效果的基因突变体的几率有限，仅从2543个克隆中筛选出3个效果理想的候选基因突变型克隆，筛选率仅为千分之一，获得这三个候选的突变体是来之不易的。
较WT Tth比较，突变位点如下：
(1)MT-TTH812克隆中的突变型Tth聚合酶(简称：MT-TTH812)基因存在的突变位点：
V187I,P316K,H563R,K542L,A599K,V667H,V732M,N736E；
氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型Tth聚合酶产生如下突变：187位氨基酸由V突变为I，316位氨基酸由P突变为K,563位氨基酸由H突变为R，542位氨基酸由K突变为L,599位氨基酸由A变为K，667位氨基酸由V突变为H，732位氨基酸由V变M，736位氨基酸由N变为E，经突变获得突变型Tth聚合酶MT-TTH812。
(2)MT-TTH537克隆中的突变型Tth聚合酶(简称：MT-TTH537)基因存在的突变位点：
E118D,S578D,Q584E,F600L,A572E,E423H,G343E；
氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型Tth聚合酶产生如下突变：118位的氨基酸由E突变为D，578位的氨基酸由S突变为D,584位的氨基酸由Q突变为E，600位的氨基酸由V突变为L，572位的氨基酸由A突变为E，423位的氨基酸由E变为H，343位的氨基酸由G突变为E，经突变获得突变型Tth聚合酶MT-TTH537。
(3)MT-TTH161克隆中的突变型Tth聚合酶(简称：MT-TTH161)基因存在的突变位点：
P316K,A325P,H406R,L409W,R441Q,E710L,H786Q,Y613H；
氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型Tth聚合酶产生如下突变：316位的氨基酸由P突变为K，325位的氨基酸由A突变为P，406位的氨基酸由H突变为R，441位的氨基酸由R突变为Q，710位的氨基酸由E突变L，786位的氨基酸由H突变为Q，613位的氨基酸由Y变为H，409位的氨基酸由L变为W，经突变获得突变型Tth聚合酶MT-TTH161。
实施例2：重组聚合酶设计及载体构建
将含有或者不含有突变的Tth DNA聚合酶(来自Thermus thermophiles HB8；)的1至833aa片段N端加入MGHHHHHH序列，在Tth与标签序列间加入GGGGSGGGGS的接头，形成6×His-Tth WT重组体。野生型Tth聚合酶的氨基酸序列，经加标签改造后如SEQ ID NO.3所示；MT-TTH812的氨基酸序列，经加标签改造后如SEQ ID NO.5所示；MT-TTH537的氨基酸序列，经加标签改造后如SEQ ID NO.6所示；MT-TTH161的氨基酸序列，经加标签改造后如SEQ IDNO.4所示。将上述蛋白对应的核苷酸片段通过PCR扩增，扩增拷贝数以及加入酶切位点，并按照常规方式克隆至pet20b载体的NdeI和XhoI之间，形成质粒，以供后续作为质粒DNA模板。加入His标签为现有技术的常规手段，可实现蛋白纯化。在本技术方案中，突变型Tth聚合酶MT-TTH812、突变型Tth聚合酶MT-TTH537或突变型Tth聚合酶MT-TTH161的N端、中间位置或C端经过引入结构域的改造；所述结构域为用于提高酶稳定性或者酶性能的DNA结合结构域或者RNA结合结构域。
加标签改造后的MT-TTH537、MT-TTH537、MT-TTH161进行PCR扩增，扩增体系为：25μL 2×高保真PCR master Mix(默唐生物)，1μL上游引物(SEQ ID NO.7，10mM)，1μL下游引物(SEQ ID NO.8，10mM)，1μL质粒DNA模板。以下列条件进行PCR扩增：95℃3min；95℃15s；60℃2min(此步与上一步循环35次)；72℃5min；4℃10min。PCR产物以OMIGA胶回收试剂盒回收片段，以NdeI和XhoI双酶切后，插入到pet21a的相应酶切位点，完成表达载体的构建。
其中，具体的序列情况如下：
加标签改造后的野生型Tth聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)：
MGHHHHHHGGGGSGGGGSMEAMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGYKAVFVVFDAKAPSFRHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGFTRLEVPGYEADDVLATLAKKAEKEGYEVRILTADRDLYQLVSDRVAVLHPEGHLITPEWLWEKYGLRPEQWVDFRALVGDPSDNLPGVKGIGEKTALKLLKEWGSLENLLKNLDRVKPENVREKIKAHLEDLRLSLELSRVRTDLPLEVDLAQGREPDREGLRAFLERLEFGSLLHEFGLLEAPAPLEEAPWPPPEGAFVGFVLSRPEPMWAELKALAACRDGRVHRAADPLAGLKDLKEVRGLLAKDLAVLASREGLDLVPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEDAAHRALLSERLHRNLLKRLEGEEKLLWLYHEVEKPLSRVLAHMEATGVRLDVAYLQALSLELAEEIRRLEEEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELRLPALGKTQKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQHRELTKLKNTYVDPLPSLVHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFVAEAGWALVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGKDIHTQTASWMFGVPPEAVDPLMRRAAKTVNFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAVAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRKRGYVETLFGRRRYVPDLNARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLREMGARMLLQVHDELLLEAPQARAEEVAALAKEAMEKAYPLAVPLEVEVGMGEDWLSAK；
加标签改造后的MT-TTH161的氨基酸序列(SEQ ID NO.4，下划线表示突变位点，括号中的文字表示突变方式)：
加标签改造后的MT-TTH812的氨基酸序列(SEQ ID NO.5，下划线表示突变位点，括号中的文字表示突变方式)：
加标签改造后的MT-TTH537的氨基酸序列(SEQ ID NO.6，下划线表示突变位点，括号中的文字表示突变方式)：
Tth聚合酶上游引物(SEQ ID NO.7)：
TCACATATGGGCCACCACCACCACCACCATGGTGGCGGTGGCTCTGGTGGTGGTGGTTCTATGATGGAAGCAATGCTGC C；
Tth聚合酶下游引物(SEQ ID NO.8)：
GTGCTCGAGTTACCTTTTGCGCTCAGCCAATCTT。
实施例3：重组聚合酶的表达纯化
吸取1μL重组质粒(约0.01μL)，加入到预冷的BL21表达感受态细胞中，混匀后。冰上放置10min，之后42℃热激90s。加入500μL LB培养基后(1％蛋白胨,0.5％酵母提取物,1％氯化钠，37℃活化30min，涂布氨苄抗性培养板。37℃培养过夜。
挑取单菌落，至100ml LB培养基。37℃200rpm摇菌过夜。1：100接种LB培养基，加入100μg/ml的氨苄青霉素。摇菌至OD＝0.3.加入IPTG至终浓度1mM，诱导目的基因表达。4h后，收集菌体，加入重悬缓冲液(30mM Tris-HCl缓冲液、pH 8.0,30mM NaCl,0.1mM EDTA)。超声破碎40min。离心，取上清放入80℃水浴15min。再次离心后，取上清。上清上镍柱，结合的蛋白以200Mm咪唑充分洗脱。洗脱后的DNA聚合酶浓缩后，上肝素柱，肝素柱以20mM Tris-HClpH7.9(含0.1％ NP40和100mM KCl)平衡。以20mM Tris-HCl pH7.9(含0.1％ NP40、100mMKCl，500Mm NaCl)洗脱。洗脱液经浓缩后，以浓缩管置换为50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0，含100mM NaCl)。置换3次后，浓缩到体积为1ml左右时，加入到冻存缓冲液中(50mM Tris-HCl，pH 8.0,50mM KCl,1mM DTT,0.1％吐温20,0.1％ NP40,50％甘油)，冻存。酶的表达和纯化涉及的感受态细胞转化、IPTG诱导表达、菌体破碎取目的蛋白、镍柱纯化肝素柱纯化、蛋白浓缩、纯化后的蛋白冻存等，均为现有技术常规方法。
将Tth及MT-TTH537，MT-TTH161及MT-TTH812的蛋白浓度以酶冻存缓冲液调整至1μg/μL,-20℃冻存。
实施例4：PCR测试
以人基因组DNA(来自293T细胞)为模板，肌动蛋白引物扩增600bp片段，PCR测试用的引物分别为：CCTCGCCTTTGCCGATCC(SEQ ID NO.13)；GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC(SEQ IDNO.14)。
PCR反应体系为：
5μL 10×PCR缓冲液，2μL dNTPs(10mM母液)，1μL PCR引物(SEQ ID NO.13和SEQID NO.14各0.5μL，10mM母液)，50ng人基因组DNA，1μL DNA聚合酶(约0.2μg/μL，1U，用实施例3中所获得的含1μg/μL酶的冻存液进行稀释)，加去离子水至50μL总体系。PCR缓冲液经稀释后为1×PCR缓冲液，成分为：10mM Tris HCl、pH8.8、50mM KCl、2.5mM Mn(OAc)2。在使用本方案的酶进行反应的体系中(PCR或者逆转录)，将Mn离子在反应体系中的浓度维持在1.5mM-3.5mM即可。
PCR反应参数为：95℃2min；94℃15s，55℃10s，72℃1min，循环数35；之后72℃10min。PCR反应结束后，加入10×上样缓冲液，混匀后进行琼脂糖凝胶电泳，对扩增结果进行检测。结果显示，野生型Tth，MT-TTH537，MT-TTH161及MT-TTH812均能够扩增出条带，而Taq酶(对照组，NEB公司M0496S，酶的用量与野生型Tth，MT-TTH537，MT-TTH161及MT-TTH812一致)并没有扩增信号，显示出MT-TTH537，MT-TTH161及MT-TTH812扩增能力显著增强。MT-TTH161的扩增效果最好，显著优于MT-TTH537及MT-TTH812。实验结果具体参见图1，其中，1为DNA marker，2为使用M0496S Taq酶扩增出的DNA的电泳条带，3为使用野生型Tth扩增出的DNA的电泳条带，4为使用MT-TTH812扩增出的DNA的电泳条带，5为使用MT-TTH537扩增出的DNA的电泳条带，6为使用MT-TTH161扩增出的DNA的电泳条带。
参照对肌动蛋白600bp片段的扩增方式，将引物换成表面趋化因子受体5(CCR5)PCR引物，扩增1.1kb的片段。PCR测试用的引物分别为：TGGAACAAGATGGATTATCAAGTGTCAAGTCCA(SEQ ID NO.11)；AGGCTGTGTATGAAAACTAAGCCATGTGCACAA(SEQ ID NO.12)。
实验结果参见图2。其中，1为DNA marker，2为阴性对照(没有加酶)，3为使用M0496S Taq酶扩增出的DNA的电泳条带，4为使用野生型Tth扩增出的DNA的电泳条带，5为使用MT-TTH812扩增出的DNA的电泳条带，6为使用MT-TTH537扩增出的DNA的电泳条带，7为使用MT-TTH161扩增出的DNA的电泳条带。野生型Tth及MT-TTH537，MT-TTH161及MT-TTH812均扩增出目的条带。MT-TTH537，MT-TTH161及MT-TTH812扩增的条带亮度明显高于野生型Tth。显示出MT-TTH537，MT-TTH161及MT-TTH812具有显著的提升扩增效率的功能。
实施例5：RT-PCR测试
由于Tth酶同时具有逆转录酶活性及DNA聚合酶活性，我们进一步检测了其在单酶体系时进行RNA荧光定量检测的功能,比对了双酶体系(MLV+Taq)体系与单酶体系检测人GAPDH RNA的能力。双酶体系选用NEB公司荧光定量检测试剂盒(E3007E,其用量为20微升加入1微升酶，相当于一个酶活力单位)。应用GAPDH引物来直接扩增293T细胞的总RNA，将0.1ng 293T总细胞RNA加入到20μL反应体系中，进行一步法RT-PCR。
一步法RT-PCR操作如下：0.01ng 293T总细胞RNA(1μL)加入到20μL反应体系中，在体系中还同时加入了2μL 10×PCR缓冲液(同实施例4)，0.5μL上游引物引物(10mM母液)，0.5μL下游引物引物(10mM母液)，探针0.25μL(10mM母液)，dNTP 1μL(8mM母液)，1μL DNA聚合酶(约0.2μg/μL，1U)，无RNA酶水补齐至20μL。其中，人GAPDH上游引物为：CGAGATCCCTCCAAAATCAA(SEQ ID NO.15)，人GAPDH下游引物为：TTCACACCCATGACGAACAT(SEQID NO.16)，探针为：FAM-TGGAGAAGGCTGGGGCTCAT-BHQ(SEQ ID NO.17)。
反应体系在90℃加热30s后，60℃反应20min，之后进入扩增循环，循环数为40：95℃10s，60℃60s。图3显示，MT-TTH537，MT-TTH161及MT-TTH812均能表现出较好的荧光定量检测信号，MT-TTH161的CT值低于MLV+Taq体系，意味着MT-TTH161具有优良的单酶实现一步法检测RNA的能力。实验结果参见图3。
实施例6：快速PCR测试
为检测聚合酶是否具有更高的扩增速度，进行了如下实验：PCR反应以人基因组DNA(来自293T细胞)为模板，使用CCR5引物来扩增1.1kb的片段(同实施例4)。
构建25μL PCR反应体系，该体系中含有1×PCR缓冲液(使用前述缓冲液配制，1×PCR缓冲液的各溶质浓度为：10mM Tris-HCl、pH 8.8,50mM KCl,2.5mM Mn(OAc)2),0.2mMdNTPs,0.4μM引物(上下游各0.2μM)，50ng人基因组DNA,1μL DNA聚合酶(约0.2μg/μL，1U)。配置过程中使用去离子水补齐总反应体系。PCR反应参数为：94℃3min；94℃15s，60℃30或者60秒,循环数35；之后72℃10min。PCR反应结束后，加入10×上样缓冲液(预染)，混匀后进行琼脂糖凝胶电泳。对扩增结果进行检测。
图4结果显示：在延伸时间为60s时，MT-TTH537，MT-TTH161及MT-TTH812均能检测到清晰的扩增条带，但Tth无明显条带。图5结果显示：当延伸时间为30s时，只有MT-TTH537，MT-TTH161出现明显扩增条带。以上实验说明，使用MT-TTH537及MT-TTH161的扩增速度得到提升。在图4和图5中，1为DNA marker，2为阴性对照(不加入酶)，3为使用野生型Tth扩增出的DNA的电泳条带，4为使用MT-TTH812扩增出的DNA的电泳条带，5为使用MT-TTH537扩增出的DNA的电泳条带，6为使用MT-TTH161扩增出的DNA的电泳条带。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.超速高保真兼并逆转录DNA聚合酶，其特征在于：由氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型Tth聚合酶经突变获得。
2.根据权利要求1所述的超速高保真兼并逆转录DNA聚合酶，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型Tth聚合酶产生如下突变：187位氨基酸由V突变为I，316位氨基酸由P突变为K,563位氨基酸由H突变为R，542位氨基酸由K突变为L,599位氨基酸由A变为K，667位氨基酸由V突变为H，732位氨基酸由V变M，736位氨基酸由N变为E，经突变获得突变型Tth聚合酶MT-TTH812。
3.根据权利要求1所述的超速高保真兼并逆转录DNA聚合酶，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型Tth聚合酶产生如下突变：118位的氨基酸由E突变为D，578位的氨基酸由S突变为D,584位的氨基酸由Q突变为E，600位的氨基酸由V突变为L，572位的氨基酸由A突变为E，423位的氨基酸由E变为H，343位的氨基酸由G突变为E，经突变获得突变型Tth聚合酶MT-TTH537。
4.根据权利要求1所述的超速高保真兼并逆转录DNA聚合酶，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型Tth聚合酶产生如下突变：316位的氨基酸由P突变为K，325位的氨基酸由A突变为P，406位的氨基酸由H突变为R，441位的氨基酸由R突变为Q，710位的氨基酸由E突变L，786位的氨基酸由H突变为Q，613位的氨基酸由Y变为H，409位的氨基酸由L变为W，经突变获得突变型Tth聚合酶MT-TTH161。
5.根据权利要求1-4任一项所述的超速高保真兼并逆转录DNA聚合酶，其特征在于：突变型Tth聚合酶MT-TTH812、突变型Tth聚合酶MT-TTH537或突变型Tth聚合酶MT-TTH161的N端、中间位置或C端经过引入结构域的改造；所述结构域为用于提高酶稳定性或者酶性能的DNA结合结构域或者RNA结合结构域。
6.根据权利要求1-4任一项所述的超速高保真兼并逆转录DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，构建表达载体，再使用表达载体转化感受态细胞，获得工程菌；诱导工程菌表达氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或者如SEQ ID NO.5所示或者如SEQ ID NO.6所示的蛋白。
7.根据权利要求1-4任一项所述的超速高保真兼并逆转录DNA聚合酶在聚合酶链式反应和/或逆转录反应中的应用。
8.基于权利要求1-4任一项所述的超速高保真兼并逆转录DNA聚合酶的基因扩增和/或逆转录的方法，其特征在于，使用突变型Tth聚合酶MT-TTH812、突变型Tth聚合酶MT-TTH537或突变型Tth聚合酶MT-TTH161作为DNA聚合酶，进行聚合酶链式反应扩增目的DNA片段的拷贝数；
或者，使用突变型Tth聚合酶MT-TTH812、突变型Tth聚合酶MT-TTH537或突变型Tth聚合酶MT-TTH161作为逆转录酶，将目的RNA逆转录为cDNA；
或者，使用突变型Tth聚合酶MT-TTH812、突变型Tth聚合酶MT-TTH537或突变型Tth聚合酶MT-TTH161，先作为逆转录酶将目的RNA逆转录为目的cDNA，然后作为DNA聚合酶扩增目的cDNA的拷贝数。
9.一种聚合酶链式反应试剂，其特征在于，包括DNA聚合酶、dNTP、上下游引物、含Mn离子的缓冲液；所述DNA聚合酶选自突变型Tth聚合酶MT-TTH812、突变型Tth聚合酶MT-TTH537和突变型Tth聚合酶MT-TTH161中的至少一种。
10.一种逆转录反应试剂，其特征在于，包括逆转录酶和含Mn离子的缓冲液；所述逆转录酶选自突变型Tth聚合酶MT-TTH812、突变型Tth聚合酶MT-TTH537和突变型Tth聚合酶MT-TTH161中的至少一种。
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