CN117209782A - 一种用于检测肾脏疾病的超分子荧光探针及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测肾脏疾病的超分子荧光探针及其制备和应用。所述超分子荧光探针是以八元瓜环和1,1',1”,1”‑(乙烯‑1,1,2,2‑四基四(苯‑4,1‑二基))四(3‑甲基‑1H‑咪唑‑3‑鎓)为原料制备而成。本发明的超分子荧光探针是一种新型的荧光探针，能够对生物样本中的3‑硝基酪氨酸进行检测识别，从而对肾脏疾病进行检测判断，具有制备简单，且检测过程操作简单、省时省材、灵敏度搞、选择性好。

Description

一种用于检测肾脏疾病的超分子荧光探针及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种超分子荧光探针及其制备和应用，特别是一种用于检测肾脏疾病的超分子荧光探针及其制备和应用。

背景技术

肾脏是完成新陈代谢和体液调节的重要器官，其功能受损会影响机体内环境稳态。肾功能不全依据肾功恶化的速度及病因可分为急性肾损伤(acutekidneyinjury,AKI)和慢性肾脏病(chronickidneydisease,CKD)。

其中，AKI控制不及时可以迁延发展为CKD，肾脏功能受损并最终发展为终末期肾病(endstagerenaldisease，ESRD)，患者需依赖透析和肾移植等肾脏替代治疗才能维持生存，严重影响生活质量，因此，肾功能损伤的早期诊断和干预十分重要。

既往研究已明确氧化应激是导致肾脏损伤的重要因素，氧化应激损伤的主要特点是大量活性氧自由基的产生，它们与蛋白质作用导致酪氨酸残基硝基化，在体内形成3-硝基酪氨酸(3-NT)。

由于3-NT的结构比较稳定，被认为是一种可评估机体氧化应激损伤的生物学标志物。目前生物样本中3-NT的检测方法包括基于抗原抗体结合原理的酶联免疫吸附、免疫印迹、免疫组化等以及基于物理化学性质特征的液相色谱、色谱-质谱联用法等。这些方法都有自己的特点和优势，但也存在一些局限性，如操作复杂、耗时耗材、灵敏度低、选择性差等。因此，开发新型的3-NT检测方法是迫切需要的。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种用于检测肾脏疾病的超分子荧光探针及其制备和应用。本发明的超分子荧光探针是一种新型的荧光探针，能够对生物样本中的3-硝基酪氨酸进行检测识别，从而对肾脏疾病进行检测判断，具有制备简单，且检测过程操作简单、省时省材、灵敏度搞、选择性好。

本发明的技术方案：一种用于检测肾脏疾病的超分子荧光探针，其化学结构图如下：

其中，为八元瓜环；

为/>

一种前述的用于检测肾脏疾病的超分子荧光探针的制备方法，是以八元瓜环和1,1',1”,1”-(乙烯-1,1,2,2-四基四(苯-4,1-二基))四(3-甲基-1H-咪唑-3-鎓)为原料制备而成，其中1,1',1”,1”-(乙烯-1,1,2,2-四基四(苯-4,1-二基))四(3-甲基-1H-咪唑-3-鎓)的化学结构式如下：

作为优选，前述的用于检测肾脏疾病的超分子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

(1)取八元瓜环，加水配制成溶液A；

(2)取1,1',1”,1”-(乙烯-1,1,2,2-四基四(苯-4,1-二基))四(3-甲基-1H-咪唑-3-鎓)，加水配制成溶液B；

(3)将溶液A和溶液B混合，即可获得所述的超分子荧光探针。

作为优选，前述的用于检测肾脏疾病的超分子荧光探针的制备方法，所述溶液A的浓度为0.5×10^-4mol/L-1.5×10^-4mol/L。

作为优选，前述的用于检测肾脏疾病的超分子荧光探针的制备方法，所述溶液B的浓度为0.5×10^-3mol/L-1.5×10^-3mol/L。

作为优选，前述的用于检测肾脏疾病的超分子荧光探针的制备方法，所述溶液A和溶液B混合时，八元瓜环和1,1',1”,1”-(乙烯-1,1,2,2-四基四(苯-4,1-二基))四(3-甲基-1H-咪唑-3-鎓)的摩尔比为1:1-1:3。

作为优选，前述的用于检测肾脏疾病的超分子荧光探针的制备方法，所述溶液A和溶液B混合后，常温超声处理10-20min。

一种前述的超分子荧光探针在制备检测肾脏疾病药物中的应用。

一种前述的超分子荧光探针在检测3-硝基酪氨酸中的应用。

作为优选，前述的超分子荧光探针在检测3-硝基酪氨酸中的应用，具体检测方法是：

(1)取所述超分子荧光探针，用pH＝7的二次水进行稀释，得到浓度为1×10^-5mol/L探针标准溶液；

(2)向上述探针标准溶液中加入含有不同浓度的3-硝基酪氨酸血清/血浆缓冲液，混合均匀后以固定激发波长为297nm，进行荧光发射光谱测定，绘制发射波长为528nm处的荧光强度变化曲线；

(3)根据步骤(2)的曲线计算加入前后荧光发射光谱在528nm处的强度变化值ΔI，当加入待测样品缓冲液后若发射波长为528nm处的荧光强度明显降低，则表明检测溶液中含有3-硝基酪氨酸，若未发生明显变化则表明水中未含有3-硝基酪氨酸或含量低于该探针检出限。

本发明的有益效果

1、本发明的超分子荧光探针是一种新型的荧光探针，能够对生物样本中的3-硝基酪氨酸进行检测识别，从而对肾脏疾病进行检测判断。

2、本发明的荧光探针的制备方法简单，易于实施。

3、本发明的荧光探针在检测3-硝基酪氨酸时，具有检测过程操作简单、省时省材、灵敏度搞、选择性好的优点。

附图说明

附图1为本发明的超分子荧光探针的化学结构式图；

附图2为1,1',1”,1”-(乙烯-1,1,2,2-四基四(苯-4,1-二基))四(3-甲基-1H-咪唑-3-鎓)(简写TIPE-MI)的化学结构式图；

附图3为3-硝基酪氨酸化学结构式图；

附图4为TIPE-MI溶剂效应图及八元瓜环与TIPE-MI的荧光光谱图。其中：(a)和(b)是TIPE-MI在水与甲醇混合溶液不同比例的荧光曲线图及拟合曲线；(c)是由摩尔比法配制的一系列溶液荧光变化趋势图；(d)是TIPE-MI与八元瓜环的摩尔比法并通过origin软件处理的图；

附图5为八元瓜环与TIPE-MI的可能相互作用以及八元瓜环@TIPE-MI(0.5mM)与不同摩尔当量的TIPE-MI从(a)0.00；(b)0.50；(c)1.00；(d)1.50；(e)2.00的¹HNMR滴定光谱；

附图6(a)和(b)为探针对氨基酸类及潜在干扰物特异性选择荧光对比图；(c)和(d)为探针对3-硝基酪氨酸酚滴定荧光图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

本发明的实施例

实施例1：

本发明分析方法中各试剂的配制方法是：

(1)准确称取适量的八元瓜环，用二次水溶解，超声，转移并定容至100mL的容量瓶中，得到浓度为1.0×10^-4mol/L八元瓜环溶液；

(2)准确称取适量的化合物TIPE-MI，用二次水溶解，转移并定容至10mL的容量瓶中得到浓度为1.0×10^-3mol/L化合物TIPE-MI溶液；

(3)3-硝基酪氨酸标准溶液的配制：

准确称取所需的3-硝基酪氨酸的分析纯标准品，用pH＝7.2的PBS缓冲溶液溶液溶解，得到浓度为1.0×10^-5mol/L的3-硝基酪氨酸标准溶液；

(4)提取市售人血清/血浆，用pH＝7.2的PBS缓冲溶液溶液稀释，向其中加入(3)中制备好的3-硝基酪氨酸标准溶液，得到含有不同浓度3-硝基酪氨酸的人血清/血浆缓冲液。

实施例2：

一种所述超分子荧光探针制备方法如下：

(1)取八元瓜环，配制得到浓度为1.0×10^-4mol/L的八元瓜环溶液；

(2)取化合物TIPE-MI，配制得到浓度为1.0×10^-3mol/L的G溶液；

(3)将八元瓜环和化合物TIPE-MI的溶液按照摩尔比1：2混合，并常温超声反应15min即可获得所述超分子荧光探针标准溶液。

实施例3：

一种所述超分子荧光探针制备方法如下：

(1)取八元瓜环，配制得到浓度为0.5×10^-4mol/L的八元瓜环溶液；

(2)取化合物TIPE-MI，配制得到浓度为0.5×10^-3mol/L的G溶液；

(3)将八元瓜环和化合物TIPE-MI的溶液按照摩尔比1：1混合，并常温超声反应10min即可获得所述超分子荧光探针标准溶液。

实施例4：

一种所述超分子荧光探针制备方法如下：

(1)取八元瓜环，配制得到浓度为1.5×10^-4mol/L的八元瓜环溶液；

(2)取化合物TIPE-MI，配制得到浓度为1.5×10^-3mol/L的G溶液；

(3)将八元瓜环和化合物TIPE-MI的溶液按照摩尔比1：3混合，并常温超声反应20min即可获得所述超分子荧光探针标准溶液。

实施例5：

本发明分析方法中一种测定具体操作是：

(1)标准曲线的测定：

取10mL容量瓶8个，每瓶加入200μL浓度为1.0×10^-3mol/L的化合物TIPE-MI溶液及2000μL浓度为1.0×10^-4mol/L八元瓜环溶液混合均匀形成探针，再分别加入1.0×10^-3mol/L的3-硝基酪氨酸标准溶液0μL、40.0μL、80.0μL、100.0μL、150.0μL、200.0μL、250μL、300.0μL，用pH＝7.2的PBS缓冲溶液溶液定容摇匀后备用。固定激发波长为297nm进行荧光发射光谱测定，以3-硝基酪氨酸的浓度为横坐标，528nm处探针荧光发射强度(I₀)与加入不同浓度3-硝基酪氨酸荧光发射强度(I)的差值(I₀-I)为纵坐标，绘制标准曲线。由标准曲线的斜率s以及测定11次空白值的标准偏差σ，计算荧光探针检测3-硝基酪氨酸的检出限，公式为3σ/s。

(2)样品检测：

取含有3-硝基酪氨酸，但浓度未知的人血清/血浆缓冲液，将配置好的荧光探针标准溶液加入其中，并在激发波长297nm下，观察528nm处有荧光强度明显减弱的现象出现，则说明该水样中含有3-硝基酪氨酸。

取不含3-硝基酪氨酸的PBS缓冲液溶液，将配置好的荧光探针标准溶液加入其中，并在激发波长297nm下，观察528nm处没有出现荧光强度的明显变化，则说明该水样中不含3-硝基酪氨酸。

实施例6：

本发明分析方法中一种测定具体操作是：

(1)标准曲线的测定：

取一个石英荧光比色皿，加入浓度为1.0×10^-5mol/L的荧光探针溶液3000μL后，再准确加入1.0×10^-3mol/L的3-硝基酪氨酸标准溶液6.0μL，混合均匀，固定激发波长为297nm进行荧光发射光谱测定。按照上述操作，不断地向上述3000μL探针溶液加入定量6.0μL3-硝基酪氨酸标准溶液，并在528nm的激发波长下，测得一系列的荧光曲线，直至荧光曲线纵坐标数值变化缓慢，即可停止该滴定操作。然后以3-硝基酪氨酸浓度为横坐标，以528nm处探针荧光发射强度与加入不同浓度3-硝基酪氨酸后荧光发射强度的差值为纵坐标，得到标准曲线，由标准曲线的斜率s以及测定11次空白值的标准偏差σ，计算荧光探针检测3-硝基酪氨酸的检出限，公式为3σ/s。

(2)样品检测：

取含有3-硝基酪氨酸浓度未知的水溶液，将配置好的荧光探针标准溶液加入其中，并在激发波长297nm下，观察528nm处有荧光强度明显减弱的现象出现，则说明该水样中含有3-硝基酪氨酸，观察528nm处没有出现荧光强度的明显变化，则说明该水样中不含3-硝基酪氨酸或含量低于该探针检出限。

以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造揭露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测肾脏疾病的超分子荧光探针，其特征在于，其化学结构式如下：

其中，为八元瓜环；

为/>

2.一种根据权利要求1所述的用于检测肾脏疾病的超分子荧光探针的制备方法，其特征在于：是以八元瓜环和1,1',1”,1”-(乙烯-1,1,2,2-四基四(苯-4,1-二基))四(3-甲基-1H-咪唑-3-鎓)为原料制备而成，其中1,1',1”,1”-(乙烯-1,1,2,2-四基四(苯-4,1-二基))四(3-甲基-1H-咪唑-3-鎓)的化学结构式如下：

3.根据权利要求2所述的用于检测肾脏疾病的超分子荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取八元瓜环，加水配制成溶液A；

(2)取1,1',1”,1”-(乙烯-1,1,2,2-四基四(苯-4,1-二基))四(3-甲基-1H-咪唑-3-鎓)，加水配制成溶液B；

(3)将溶液A和溶液B混合，即可获得所述的超分子荧光探针。

4.根据权利要求3所述的用于检测肾脏疾病的超分子荧光探针的制备方法，其特征在于：所述溶液A的浓度为0.5×10^-4mol/L-1.5×10^-4mol/L。

5.根据权利要求3所述的用于检测肾脏疾病的超分子荧光探针的制备方法，其特征在于：所述溶液B的浓度为0.5×10^-3mol/L-1.5×10^-3mol/L。

6.根据权利要求3所述的用于检测肾脏疾病的超分子荧光探针的制备方法，其特征在于：所述溶液A和溶液B混合时，八元瓜环和1,1',1”,1”-(乙烯-1,1,2,2-四基四(苯-4,1-二基))四(3-甲基-1H-咪唑-3-鎓)的摩尔比为1:1-1:3。

7.根据权利要求3所述的用于检测肾脏疾病的超分子荧光探针的制备方法，其特征在于：所述溶液A和溶液B混合后，常温超声处理10-20min。

8.一种根据权利要求1所述的超分子荧光探针在制备检测肾脏疾病药物中的应用。

9.一种根据权利要求1所述的超分子荧光探针在检测3-硝基酪氨酸中的应用。

10.根据权利要求9所述的超分子荧光探针在检测3-硝基酪氨酸中的应用，其特征在于，具体检测方法是：

(1)取所述超分子荧光探针，用pH＝7的二次水进行稀释，得到浓度为1×10^-5mol/L探针标准溶液；

(2)向上述探针标准溶液中加入含有不同浓度的3-硝基酪氨酸血清/血浆缓冲液，混合均匀后以固定激发波长为297nm，进行荧光发射光谱测定，绘制发射波长为528nm处的荧光强度变化曲线；

(3)根据步骤(2)的曲线计算加入前后荧光发射光谱在528nm处的强度变化值ΔI，当加入待测样品缓冲液后若发射波长为528nm处的荧光强度明显降低，则表明检测溶液中含有3-硝基酪氨酸，若未发生明显变化则表明水中未含有3-硝基酪氨酸或含量低于该探针检出限。