CN109632736A - 一种检测马兜铃酸a荧光传感器的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测马兜铃酸A荧光传感器的制备方法，该方法首先合成碳量子点(CQDs)，然后合成卵白蛋白稳定的金纳米簇(OVA@AuNCs)，将碳量子点和卵白蛋白稳定的金纳米簇分别用超纯水溶解后，混合均匀，即制得检测马兜铃酸A荧光传感器；检测时，以碳量子点为主体，利用OVA@AuNCs增强碳量子点的荧光，然后通过加入马兜铃酸A将CQDs‑OVA@AuNCs的荧光猝灭；以CQDs‑OVA@AuNCs作为荧光传感平台，利用荧光猝灭的方式来定量检测马兜铃酸A；本发明方法克服了现有检测马兜铃酸A的技术方法过于复杂、检测速度慢及对马兜铃酸A识别性较低的缺陷；本发明方法简单、方便、快速、可控性高、高效，适于工业化生产及具有广阔的市场应用前景。

Description

一种检测马兜铃酸A荧光传感器的制备方法
技术领域
本发明属于荧光传感器领域，具体涉及了一种检测马兜铃酸A荧光传感器的制备方法。
背景技术
肾毒性马兜铃酸是一种硝基菲啰啉羧酸衍生物，其来源于马兜铃科植物，例如马兜铃属和细辛属，大多数成分已被证实是肾毒性、致癌和诱变。其中，马兜铃酸A(AAs)毒性最大，并且引起了人们广泛关注。这些含AAs的草药已被广泛用作治疗肿瘤、蛇咬伤、小痘、风湿病和肺炎，直到AAs被证实是严重危害人体肾毒素的致癌物和致突变物。虽然，在世界范围内已经禁止使用含有AAs的草药。但这些草药目前仍然通过互联网销售，并且滥用含AAs的草药现象也屡禁不止。因此，高效准确的检测出马兜铃酸A对肾脏疾病的诊断和治疗具有重大的意义。
目前检测含AAs草药中的AAs及其类似物，主要有薄层色谱(TLC)、高效液相色谱和紫外检测(HPLC-UV)、高效液相色谱质谱(HPLC-MS)、毛细管电泳与电化学检测(CE-ECD)和酶联免疫吸附试验(ELISA)；但是现有这些检测方法存在检测步骤复杂，检测速度慢及对马兜铃酸A检出限较高的问题。
发明内容
本发明旨在解决现有马兜铃酸A检测方法过于复杂、检测速度慢及对马兜铃酸A识别性较低的问题，而提供一种检测马兜铃酸A荧光传感器的制备方法。
本发明首先合成碳量子点(CQDs)，然后用卵白蛋白稳定金纳米簇，构建荧光传感CQDs-OVA@AuNCs；使用时，利用随着马兜铃酸A(AAs)的浓度逐渐增加，荧光传感器的荧光逐渐猝灭，根据荧光强度变化与马兜铃酸A加入浓度的线性关系来定量检测马兜铃酸A。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
本发明荧光传感器的制备方法如下：
(1)将活性炭与混酸混合后，置于80-90℃下回流反应，冷却至室温，在反应产物中添加混酸体积2-3倍的水，然后用氢氧化钠调节pH至12-14后放入水热反应釜中反应13-15小时，再调节pH至中性，最后将中性产物用超纯水透析2-3天，将透析袋内产物干燥后得到碳量子点，其中活性炭与混酸的质量体积比mg:mL为8-12:1；
(2)在浓度为8-12mg/mL卵白蛋白(OVA)液体中加入氯金酸溶液，超声5-10min后搅拌15-30min；用0.5-1mol/L氢氧化钠调pH至12-13；然后在30-45℃水浴反应10-12小时，反应产物干燥后得到卵白蛋白稳定的金纳米簇(OVA@AuNPs)，其中卵白蛋白液体与氯金酸溶液的体积比为4-6:1；
(3)将碳量子点和卵白蛋白稳定的金纳米簇分别用超纯水溶解后，混合均匀，即制得检测马兜铃酸A荧光传感器(CQDs-OVA@AuNCs)，其中碳量子点和卵白蛋白稳定的金纳米簇的质量比为1300-1500:1。
所述混酸为是浓硫酸和浓硝酸按体积比2-3.5:1组合而得，浓硫酸和浓硝酸均为市购产品。
所述步骤(1)中氢氧化钠浓度为5～6mol/L；用1mol/L的硫酸调节pH至中性。
所述制备碳量子点时，在水热反应釜中的反应温度为150-170℃。
所述氯金酸溶液浓度为8-12mmol/L。
本发明马兜铃酸A荧光传感器灵敏度高；检测时，以碳量子点为主体，利用OVA@AuNCs增强碳量子点荧光，然后加入马兜铃酸A，随着AAs的浓度逐渐增加，荧光传感器的荧光逐渐猝灭，根据荧光强度变化与马兜铃酸A加入浓度的线性关系来定量检测马兜铃酸A；以CQDs-OVA@AuNCs作为荧光传感平台，利用荧光猝灭的方式来定量检测马兜铃酸A；这种基于CQDs-OVA@AuNCs的复合传感界面，比普通的复合传感界面，灵敏度更高、稳定性更好；本发明方法在常温常压下进行、简单、快速、可控性高，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1的碳量子点(CQDs)的透射电镜图(5nm)；
图2为本发明实施例1的碳量子点(CQDs)的透射电镜图(10nm)；
图3为本发明实施例1的卵白蛋白稳定的金纳米簇(OVA@AuNCs)的透射电镜图(5nm)；
图4为本发明实施例1的卵白蛋白稳定的金纳米簇(OVA@AuNCs)的透射电镜图(10nm)；
图5为本发明实施例1的卵白蛋白稳定的金纳米簇(OVA@AuNCs)和碳量子点(CQDs)混合的透射电镜图(5nm)；
图6为本发明实施例1的卵白蛋白稳定的金纳米簇(OVA@AuNCs)和碳量子点(CQDs)混合的透射电镜图(20nm)；
图7为基于CQDs-OVA@AuNCs构建的荧光传感器检测马兜铃酸A的示意图；
图8为OVA、CQDs、OVA@AuNC的红外谱图；
图9为本发明实施例3OVA@AuNCs对CQDs的荧光增强图，横坐标为OVA@AuNCs浓度，纵坐标为荧光强度；
图10为本发明实施例4中OVA@AuNCs对CQDs的荧光增强(MEF)机理验证图；
图11为本发明实施例5中CQDs-OVA@AuNCs体系荧光强度猝灭的程度；
图12为本发明实施例5中CQDs-OVA@AuNCs体系荧光强度与马兜铃酸A浓度的线性关系示意图；
图13为马兜铃酸A对CQDs-OVA@AuNCs因荧光内滤作用(IEF)而猝灭的机理验证图；
图14为CQDs-OVA@AuNCs传感器对AAs识别的抗干扰性能。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不限于所述内容，实施例中如无特殊说明，均为常规方法，实施例中所使用的化学试剂和溶剂均为分析纯；使用试剂如无特殊说明，均为常规试剂或按常规方法配制的试剂；所述搅拌采用磁力搅拌器搅拌方式；所述的荧光光谱测定条件均为发射波长467-700nm，激发波长为447nm，狭缝宽度为10nm。
实施例1：本检测马兜铃酸A荧光传感器的制备方法如下：
(1)将250mg活性炭粉末、22.5mL浓硫酸、7.5mL浓硝酸依次加入到圆底烧瓶中80℃下回流5小时，冷却至室温后，在反应产物中添加混酸体积2倍的加超纯水，用6mol/L氢氧化钠调节pH至13后放入水热反应釜中，在160℃下反应14小时后，用1mol/L的硫酸调节pH至7.0，将中性产物用1000分子量的透析袋透析2天，将透析袋内产物冷冻干燥得到碳量子点(CQDs)，碳量子点的透射电镜图(图1、2)；
(2)将5mL、10mg/mL卵白蛋白(OVA)液体以及1mL、10mmol/L氯金酸溶液放入烧杯中，超声5min后室温搅拌15min，用1mol/L NaOH调节溶液pH至13后，在37℃水浴条件下搅拌12小时，反应产物冷冻干燥后得到卵白蛋白稳定的金纳米簇(OVA@AuNCs)，卵白蛋白稳定的金纳米簇的透射电镜图(图3、4)；
(3)将2mL、0.2mg/mL的CQDs水溶液和30μL、0.01mg/mL的OVA@AuNCs水溶液混匀后得到CQDs-OVA@AuNCs；冷冻干燥用于CQDs-OVA@AuNCs的透射电镜，结果见图5、6。
实施例2：本检测马兜铃酸A荧光传感器的制备方法如下：
(1)将250mg活性炭粉末、19.4mL浓硫酸、5.6mL浓硝酸依次加入到圆底烧瓶中90℃回流6小时，冷却至室温后，在反应产物中添加混酸体积3倍的加超纯水，用5mol/L氢氧化钠调节溶液pH至12后放入水热反应釜中，在170℃反应13小时后，用1mol/L硫酸调节pH至7.0，将中性产物用1000分子量的透析袋透析3天，将透析袋内产物冷冻干燥得到碳量子点粉末(CQDs)；
(2)将20mL、8mg/mL卵白蛋白(OVA)溶液以及5mL、8mmol/L氯金酸溶液放入烧杯中，超声10min后室温搅拌25min，用0.5mol/L NaOH调节溶液pH至12后，在43℃下搅拌10小时，反应产物冷冻干燥后得到卵白蛋白稳定的金纳米簇粉末(OVA@AuNCs)；
(3)将10mL、0.21mg/mL的CQDs水溶液和150μL、0.01mg/mL的OVA@AuNCs水溶液混合后冷冻干燥，得到CQDs-OVA@AuNCs粉末(图7为CQDs-OVA@AuNCs荧光传感器的制备及使用原理)；图8为OVA、CQDs、OVA@AuNC的红外谱图，结果显示3420cm-1为O-H键的伸缩振动，3440cm-1为N-H键的平面变角震动；2930cm-1为CH2的伸缩振动，1615cm-1为O＝C-O的伸缩振动，1590cm-1为酰胺键的I带峰；1883cm-1为C-H的弯曲震动，1374cm-1为C-N的伸缩振动，1143cm-1为S-O的伸缩振动；1445cm-1为C＝C的拉伸震动。
实施例3：OVA@AuNCs增强CQDs荧光的实验
向2mL 0.2mg/mL CQDs溶液中逐步加入10μL 0.01mg/mL OVA@AuNCs溶液，每次加10μL，可见CQDs溶液的荧光强度在加入至30μL OVA@AuNCs溶液时达到最高值，之后逐渐降低(图9)。
实施例4：验证OVA@AuNCs增强CQDs荧光的实验
向紫外比色皿中，加入1mL超纯水后，再加入1mL、1mg/mL的CQDs溶液，用紫外分光光度计测量其对紫外光的吸收值；同样，向紫外比色皿中，加入2mL、1mg/mL的OVA@AuNCs溶液，用紫外分光光度计测量其对紫外光的吸收值；可以看到，CQDs和OVA@AuNCs溶液的紫外吸收值在225nm处的峰有重叠部分；即可证明CQDs和OVA@AuNCs之间有金属增强CQDs荧光的作用(MEF)(图10)。
实施例5：AAs对CQDs-OVA@AuNCs荧光传感器荧光的淬灭机理的验证
在紫外比色皿中加入1.96mL超纯水，然后取40μL 25μmol/L的AAs，测定其紫外吸收值；在荧光比色皿中，取1.875mL超纯水，然后取125μL实施例1的CQDs-OVA@AuNCs液体，分别测定CQDs-OVA@AuNCs液体的荧光发射光谱和荧光激发光谱；图13中a为马兜铃酸A紫外吸收谱图，b为CQDs-OVA@AuNCs的荧光激发谱图，c为CQDs-OVA@AuNCs的荧光发射谱图；由图13可以看出马兜铃酸A的紫外吸收光谱与CQDs-OVA@AuNCs的荧光激发光谱有部分的重叠，所以可以将马兜铃酸A猝灭CQDs-OVA@AuNCs的荧光的作用，归为荧光内滤效应(IEF)；
由于马兜铃酸A(AAs)溶液能通过荧光内滤作用猝灭CQDs-OVA@AuNCs传感器的荧光，导致CQDs-OVA@AuNCs传感器的荧光强度降低；因此在实施例1制得的CQDs-OVA@AuNCs传感器液体中加入马兜铃酸A(AAs)，直至荧光强度猝灭达到饱和(图11)；获得荧光强度与马兜铃酸A浓度的线性关系(图12)，用于后期测定样品中的AAs；在本实施例中检测马兜铃酸A的线性范围为0.002-1000μmol/L，检出限为50nmol/L，线性回归方程为：(F0－F)/F0＝9.81944×10-4C(μM)+4.66474、(F0－F)/F0＝1.47831C(μM)+0.05927和(F0－F)/F0＝7.01326×10-4C(μM)+0.34625，相关系数为0.99217、0.96226、0.98445(图8)。
实施例6：CQDs-OVA@AuNCs传感器对AAs识别的抗干扰性能
选取马兜铃酸A类似物马兜铃对酮(Arist)进行干扰试验，同时也选取一些常规干扰物进行干扰试验，如KBr、葡萄糖(Glucose)、蔗糖(Sucrose)、KCl、Na3PO4、CH3COONa、K2CO3；将上述干扰物分别与马兜铃酸A混合并加入到实施例1的CQDs-OVA@AuNCs溶液中，测定其荧光猝灭程度，作出其相对应的荧光强度(F-F0)/F0的图像，见图14，从图中看出，对比同时添加干扰物和马兜铃酸A的溶液检测结果与单独添加马兜铃酸A的检测结果，可以说明CQDs-OVA@AuNCs传感器对AAs识别具有良好的抗干扰性能。
实施例7：CQDs-OVA@AuNCs传感器的应用
以人工血清为实际样品，采用加标回收的方式进行实际样品中马兜铃酸A含量的检测；取稀释50倍的血清样品500μL，在血清样品中分别各加入500μL，0.02μmol/L、20μmol/L、100μmol/L的马兜铃酸A溶液，配制得到加标量分别为0.01μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、的待测样品，将待测样品中加入到2mL、实施例1的CQDs-OVA@AuNCs溶液中，测定每个样品的荧光吸收值，每个样品平行测定3次，将每个样品的荧光吸收值代入实施例5获得的荧光强度恢复与马兜铃酸A浓度的线性关系中，计算出每个样品的实际测量浓度，并进一步计算回收率及标准偏差，结果见表1，实验结果显示回收率在94％-99.8％之间，相对标准偏差为0.67-4.0％之间，说明本发明感器可用于检测实际血清样品中的马兜铃酸A含量，在生物医学和临床检测中有着很大的应用潜力。
表1血清实际样品中马兜铃酸A加标回收实验结果

Claims (6)

1.一种检测马兜铃酸A荧光传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将活性炭与混酸混合后，置于80-90℃下回流反应，冷却至室温，在反应产物中添加混酸体积2-3倍的水，然后用氢氧化钠调节pH至12-14后放入水热反应釜中反应13-15小时，再调节pH至中性，最后将中性产物用超纯水透析2-3天，将透析袋内产物干燥后得到碳量子点，其中活性炭与混酸的质量体积比mg:mL为8-12:1；
(2)在浓度为8-12mg/mL卵白蛋白液体中加入氯金酸溶液，超声5-10min后搅拌15-30min；用0.5-1mol/L氢氧化钠调pH至12-13；然后在30-45℃水浴反应10-12小时，反应产物干燥后得到卵白蛋白稳定的金纳米簇，其中卵白蛋白液体与氯金酸溶液的体积比为4-6:1；
(3)将碳量子点和卵白蛋白稳定的金纳米簇分别用超纯水溶解后，混合均匀，即制得检测马兜铃酸A荧光传感器，其中碳量子点和卵白蛋白稳定的金纳米簇的质量比为1300-1500:1。
2.根据权利要求1所述的检测马兜铃酸A荧光传感器的制备方法，其特征在于：混酸为是浓硫酸和浓硝酸按体积比2-3.5:1组合而得。
3.根据权利要求1所述的检测马兜铃酸A荧光传感器的制备方法，其特征在于：步骤(1)中氢氧化钠浓度为5-6mol/L。
4.根据权利要求1所述的检测马兜铃酸A荧光传感器的制备方法，其特征在于：用1mol/L的硫酸调节pH至中性。
5.根据权利要求1所述的检测马兜铃酸A荧光传感器的制备方法，其特征在于：制备碳量子点时，在水热反应釜中的反应温度为150-170℃。
6.根据权利要求1所述的检测马兜铃酸A荧光传感器的制备方法，其特征在于：氯金酸溶液浓度为8-12mmol/L。
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