CN109734647A

CN109734647A - 一种检测半胱氨酸的荧光探针及其制备方法与使用方法

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Publication number: CN109734647A
Application number: CN201910150746.3A
Authority: CN
Inventors: 韩益丰; 杨斌英
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-02-28
Filing date: 2019-02-28
Publication date: 2019-05-10
Anticipated expiration: 2039-02-28
Also published as: CN109734647B

Abstract

本发明公开了一种检测半胱氨酸的荧光探针及其制备方法与使用方法。本发明利用邻苯二甲酰亚胺构筑经典的分子内电荷转移(ICT)体系，并在苯环的剩余位置引入四个氟原子，使其更具生物和光学稳定性。探针本身的ICT效应被氟原子抑制而无荧光发射，但当存在半胱氨酸的条件下，氟原子被半胱氨酸取代，进而使其抑制作用消失，探针分子发射出强荧光。本发明提供的N‑正丁基四氟邻苯二甲酰亚胺染料的“开‑关”型半胱氨酸探针对半胱氨酸溶液具有良好的响应，能够实现对样品内微量半胱氨酸的灵敏定量检测，具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广和应用等优点。

Description

一种检测半胱氨酸的荧光探针及其制备方法与使用方法

技术领域

本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种作为半胱氨酸荧光探针使用的四氟邻苯二甲酰亚胺衍生物及其制备方法与使用方法。

背景技术

巯基化合物是生物体中许多蛋白质和分子的重要组成部分，在细胞抗氧化系统中具有重要的生物学作用。半胱氨酸(Cys)作为人体必须的氨基酸之一，参与了生物体内蛋白质的合成，同时也是构建谷胱甘肽的三个重要的氨基酸之一。研究表明，半胱氨酸在生物体内含量的变化与一些重要疾病的发生、发展密切相关。通过检测半胱氨酸在生物体内含量的变化，可以为体内某些疾病的诊断提供正确的依据。因此，定量检测生物体系中Cys含量的变化在化学、生物以及临床医学等领域都具有重要的意义。

荧光检测法由于其优秀的检测灵敏度和选择性，并能实现对生物样品的实时、在线检测而受到研究者的广泛关注。

目前已开发的用于检测半胱氨酸的小分子荧光探针主要基于半胱氨酸与丙烯酸酯之间的特异性化学反应而设计的。当存在半胱氨酸的条件下，探针分子中的丙烯酸酯官能团被半胱氨酸选择性地水解断裂为原来的羟基(如醇和酚等)，导致探针分子的荧光性质发生变化，从而实现对半胱氨酸的特异性识别。

然而，基于丙烯酸酯为探针报告基团的探针(参见Han,C.；Yang,H.；Chen,M.；Su,Q.；Feng,W.；Li,F.ACS Appl.Mater.Interfaces,2015,7,27968-27975；Niu,W.；Guo,L.；Li,Y.；Shuang,S.；Dong,C.；Wong,M.S.Anal.Chem.,2016,88,1908-1914.)易受到生物体中酯水解酶以及较高pH值的影响，不利于其在复杂的生物体内进行准确检测。此外，目前的半胱氨酸荧光探针的检测限相对较高，难以对微量甚至极微量的半胱氨酸样品进行定量检测。

发明内容

为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明提出了一种定量检测半胱氨酸的荧光探针(Cys518)。利用本发明可对样品中极微量的半胱氨酸进行定量检测。

本发明的核心在于利用邻苯二甲酰亚胺构筑经典的分子内电荷转移(ICT)体系，并在苯环的剩余位置引入四个氟原子，使其更具生物和光学稳定性。探针本身的ICT效应被氟原子抑制而无荧光发射，但当存在半胱氨酸的条件下，氟原子被半胱氨酸取代，进而使其抑制作用消失，探针分子发射出强荧光，通过上述方案，获得了“开-关”型的荧光响应，实现了对半胱氨酸的高灵敏、特异性检测。

本发明所述半胱氨酸荧光探针命名为N-正丁基四氟邻苯二甲酰亚胺，结构式如式(I)所示：

上述半胱氨酸荧光探针的制备方法如下：将一定量的四氟邻苯二甲酸酐(1)和正丁胺(2)溶于一定量的乙酸中，回流一定时间，有固体析出，减压过滤，用乙酸洗涤，干燥得化合物N-正丁基四氟邻苯二甲酰亚胺(3)，即：Cys518。

上述制备方法中所示四氟邻苯二甲酸酐(1)和正丁胺(2)的摩尔比为0.1～1:1；乙酸为5～500毫升；反应时间为0.5～5小时；

作为优选该步骤四氟邻苯二甲酸酐(1)和正丁胺(2)的摩尔比为0.5:1；乙酸为100毫升；反应时间为2小时；

上述探针的制备反应式如下：

上述半胱氨酸荧光探针的使用方法如下：

步骤1：向不同浓度半胱氨酸的缓冲溶液中加入相同浓度的式(I)所示化合物，配置至少5种不同半胱氨酸含量的含有式(I)所示化合物的标准溶液；

所示缓冲溶液可以是磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、HEPES缓冲溶液或硼酸-硼酸钠缓冲溶液；

所示标准溶液的pH值为5～11；

所示标准溶液中式(I)所示化合物的浓度为1nM～10μM；

所示标准溶液中半胱氨酸的含量为0.1nM～1mM；

步骤2：分别测定所述标准溶液的荧光发射光谱，激发波长为395nm，以半胱氨酸浓度为横坐标，以I₅₁₈为纵坐标，建立标准曲线；

I₅₁₈表示所述标准溶液在波长为518nm处的荧光发射峰强度值；

步骤3：向待测样品中加入式(I)所示化合物，控制其浓度与所述标准溶液中式(I)所示化合物的浓度相等；测定其在激发波长为395nm的激发光下的荧光发射谱，即根据标准曲线计算得出待测样品的半胱氨酸含量。

本发明具有如下特点：

1)本发明提供的荧光探针是黄色固体粉末，分子结构光学稳定性。

2)本发明提供的荧光探针，其溶液对半胱氨酸的浓度敏感，随着半胱氨酸浓度的增加，紫外灯下观察到其水溶液的荧光由无色变为黄色。

3)本发明提供的荧光探针，其发射波长为518nm，为荧光“开-关”型响应，能大大消除检测时检测条件差异对结果的影响，提高检测的灵敏度。

4)本发明提供的荧光探针对半胱氨酸浓度呈线性关系，可用于半胱氨酸精确测量。

本发明提供的N-正丁基四氟邻苯二甲酰亚胺染料的“开-关”型半胱氨酸探针对半胱氨酸溶液具有良好的响应，能够实现对样品内半胱氨酸的灵敏定量检测，具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广和应用等优点。

附图说明

图1：荧光探针CYS518的核磁共振氢谱。

图2：荧光探针CYS518对半胱氨酸水溶液的颜色响应图。

图3：荧光探针CYS518对半胱氨酸水溶液的荧光响应图。

图4：荧光探针CYS518在缓冲液中半胱氨酸的紫外滴定曲线，其中探针浓度为1.0μM。

图5：荧光探针CYS518在缓冲液中半胱氨酸的荧光滴定曲线，其中激发波长为395nm，探针浓度为1.0μM。

图6：荧光探针CYS518对常见共存离子或生物小分子的荧光响应图，其中激发波长为395nm，探针浓度为1.0μM，离子浓度为100.0μM。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。

实施例中的化合物号码对应上述化合物中的号码。

实施例1、化合物CYS518的合成

将0.2g四氟邻苯二甲酰亚胺(1)(908.77μmol)和898.2mmL正丁胺(2)(9.08mmol)溶于5mL乙酸中，回流搅拌0.5小时后，有固体析出、减压过滤，用乙酸洗涤、干燥得化合物N-正丁基四氟邻苯二甲酰亚胺(3)，即：CYS518，产率38％。核磁共振图谱如图1。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ3.67(t,J＝7.2Hz,2H),1.64(quintet,J＝7.5Hz,2H),1.35(sextet,J＝7.4Hz,2H),0.94(t,J＝7.3Hz,3H)。

实施例2、化合物CYS518的合成

将1.0g四氟邻苯二甲酰亚胺(1)(4.54mmol)和1.8mL正丁胺(2)(18.18mmol)溶于50mL乙酸中，回流搅拌1小时后，有固体析出、减压过滤，用乙酸洗涤、干燥得化合物N-正丁基四氟邻苯二甲酰亚胺(3)，即：CYS518，产率49％。核磁共振图谱如图1。

实施例3、化合物CYS518的合成

将5g四氟邻苯二甲酰亚胺(1)(22.72mmol)和4.49mL正丁胺(2)(45.44mmol)溶于100mL乙酸中，回流搅拌2小时后，有固体析出、减压过滤，用乙酸洗涤、干燥得化合物N-正丁基四氟邻苯二甲酰亚胺(3)，即：CYS518，产率78％。核磁共振图谱如图1。

实施例4、化合物CYS518的合成

将10g四氟邻苯二甲酰亚胺(1)(45.44mmol)和5.97mL正丁胺(2)(60.43mmol)溶于250mL乙酸中，回流搅拌2小时后有固体析出、减压过滤，用乙酸洗涤、干燥得化合物N-正丁基四氟邻苯二甲酰亚胺(3)，即：CYS518，产率61％。核磁共振图谱如图1。

实施例5、化合物CYS518的合成

将20g四氟邻苯二甲酰亚胺(1)(0.09mol)和8.98mL正丁胺(2)(0.09mol)溶于500mL乙酸中，回流搅拌5小时后，有固体析出、减压过滤，用乙酸洗涤、干燥得化合物N-正丁基四氟邻苯二甲酰亚胺(3)，即：CYS518，产率65％。核磁共振图谱如图1。

实施例6、化合物CYS518对半胱氨酸的颜色响应

配制浓度为1mM的本发明所述检测半胱氨酸的荧光探针CYS518的二甲基亚砜(DMSO)的测试母液溶液待用。量取10μL的此母液滴加到一定浓度半胱氨酸的磷酸盐缓冲液中，并用相应的磷酸盐缓冲液定容到10mL，使得测试液中，探针的浓度为1.0μM，半胱氨酸浓度为10.0μM进行颜色响应测试。如图2和3所示，加入半胱氨酸水溶液后，肉眼观察到溶液的颜色由无色变为浅黄色，同时溶液的荧光也由几乎无荧光变为亮黄色荧光，表明探针CYS518对半胱氨酸具有直观的显色响应。

实施例7、不同浓度半胱氨酸对化合物CYS518的紫外滴定检测

配制浓度为1mM的本发明所述检测半胱氨酸的荧光探针CYS518的二甲基亚砜(DMSO)的测试母液溶液待用。量取10μL的此母液分别滴加到不同浓度半胱氨酸的磷酸盐缓冲液中，并用相应的磷酸盐缓冲液定容到10mL，使得测试液中，探针的浓度为1.0μM，半胱氨酸浓度为0-40.0μM进行吸收光谱测试。得各体系中紫外吸收曲线，建立吸光度与半胱氨酸浓度标准曲线。如图4所示，随着半胱氨酸浓度的增加，518nm处吸光度逐渐增加，并与半胱氨酸浓度(0-40.0μM)呈良好的线性关系。

实施例8、不同浓度半胱氨酸对化合物CYS518的荧光滴定检测

配制浓度为1mM的本发明所述检测半胱氨酸的荧光探针CYS518的二甲基亚砜(DMSO)的测试母液溶液待用。量取10μL的此母液分别滴加到不同浓度半胱氨酸的磷酸盐缓冲液中，并用相应的磷酸盐缓冲液定容到10mL，使得测试液中，探针的浓度为1.0μM，半胱氨酸浓度为0-40.0μM进行荧光检测(λex＝395nm,λem＝518nm)。得各体系中荧光强度，建立荧光强度与半胱氨酸浓度标准曲线。如图5所示，随着半胱氨酸浓度的增加，518nm处荧光强度逐渐增加，当半胱氨酸浓度达到100.0μM时，反应体系荧光强度达到饱和状态。此外，在低浓度下，荧光强度和半胱氨酸的浓度(0-40.0μM)之间呈现良好的线性关系(R²＝0.98)，探针CYS518对半胱氨酸的检测限可达89nM。

实施例9、化合物CYS518对不同常见氨基酸的选择性

配制浓度为1mM的本发明所述检测半胱氨酸的荧光探针CYS518的二甲基亚砜(DMSO)的测试母液溶液待用。配制浓度为10mM的各种不同离子，小分子的溶液作为备用。量取10μL的此母液分别滴加到不同待测离子或小分子的磷酸盐缓冲液中，并用相应的磷酸盐缓冲液定容到10mL，使得测试液中，探针的浓度为1.0μM，待测离子或小分子的浓度为10.0μM进行荧光检测(λex＝395nm,λem＝518nm)。得各体系中荧光强度，建立荧光强度与各离子的柱状图。如图6所示，其他离子(或小分子)对探针CYS518的荧光几乎没有影响。

Claims

1.一种检测半胱氨酸的荧光探针,其特征在于：其分子式为C₁₂H₉F₄NO₂，简称Cys518，结构式为式(I)；

2.根据权利要求1所述的一种检测半胱氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，合成步骤如下：

将四氟邻苯二甲酰亚胺和正丁胺溶于乙酸中，回流搅拌一定时间后，有固体析出、减压过滤，用乙酸洗涤、干燥得化合物N-正丁基四氟邻苯二甲酰亚胺，即：Cys518。

3.一种检测半胱氨酸的荧光探针的使用方法；其特征在于：

1)向不同浓度半胱氨酸的缓冲溶液中加入相同浓度的式(I)所示化合物，配置至少5种不同半胱氨酸含量的含有式(I)所示化合物的标准溶液；

所示缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、HEPES缓冲溶液或硼酸-硼酸钠缓冲溶液；

所示标准溶液的pH值为5～11；

所示标准溶液中式(I)所示化合物的浓度为1nM～1μM；

所示标准溶液中半胱氨酸的含量为0.1nM～1mM；

2)分别测定所述标准溶液的荧光发射光谱，激发波长为395nm，以半胱氨酸浓度为横坐标，以I₅₁₈为纵坐标，建立标准曲线；

3)向待测样品中加入式(I)所示化合物，控制其浓度与所述标准溶液中式(I)所示化合物的浓度相等；测定其在激发波长为395nm的激发光下的荧光发射谱，即根据标准曲线计算得出待测样品的半胱氨酸含量。

4.根据权利要求1所述的一种检测半胱氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述的四氟邻苯二甲酸酐和正丁胺的摩尔比为0.1～1:1；乙酸为5～500毫升；反应时间为0.5～5小时。

5.根据权利要求1所述的一种检测半胱氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于：四氟邻苯二甲酸酐和正丁胺的摩尔比为0.5:1；乙酸为100毫升。