CN117203236A - 包含4-1bb和ox40结合蛋白的组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了包含结合4‑1BB和OX40的双特异性抗体及其抗原结合片段的药物组合物。还提供了使用此类组合物治疗病症诸如癌症的方法。

Description

包含4-1BB和OX40结合蛋白的组合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本国际申请要求2021年2月17日提交的美国临时申请号63/150,475的优先权权益，该临时申请全文以引用方式并入本文。
以电子方式提交的序列表参考
以电子方式提交的序列表(名称：4897_0060000_Seqlisting_ST25.txt；大小：18,030字节；以及创建日期：2022年2月16日)全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及包含特异性结合4-1BB和OX40的双特异性抗体及其抗原结合片段的药物组合物。该组合物可用于治疗病症，包括实体瘤癌症。还提供了使用此类组合物治疗病症诸如癌症的方法。
背景技术
4-1BB(CD137)和OX40是TNF受体(TNFR)家族的成员(Bremer，ISRN Oncol.:371854(2013))。这些受体不组成型地存在于天然T或NK细胞上：通过T细胞受体(TCR)或NK细胞中的其他刺激物刺激T细胞来触发它们的表达。4-1BB主要在CD8 T细胞和NK细胞中上调，而OX40主要在CD4 T细胞中上调。这些受体的功能是向T细胞和NK细胞提供共刺激信号。这些受体的激活是通过与4-1BB配体(4-1BBL)或OX40配体(OX40L)三聚体相互作用而实现的三聚反应自然触发的，导致信号转导和特定细胞功能的起始。4-1BB通过增加IFN-γ、颗粒酶和抗凋亡基因的表达来增强CD8 T细胞和NK细胞的效应子功能，导致生成更多和更好的效应子CD8 T和NK细胞。OX40通过增强CD4 T细胞产生IL-2的能力和记忆CD4 T细胞的克隆扩增的能力来增强其效应子功能。
4-1BB和OX40通常在肿瘤浸润性淋巴细胞上表达，并且它们的表达已被用于鉴定肿瘤特异性T细胞。人实体瘤通常被淋巴细胞浸润，主要是CD8+和CD4+T细胞。肿瘤浸润性淋巴细胞的积累通常与受各种恶性肿瘤影响的患者的改善的生存率相关。(Ye等人，OncoImmunology 2:e27184(2013)；Montler等人，Clin Transl Immunology 5:e70(2016))。
多种诱导和自发肿瘤模型中的临床前结果表明，用激动剂抗体靶向4-1BB可导致肿瘤清除和持久的抗肿瘤免疫。乌瑞芦单抗和乌托鲁单抗是激动剂抗4-1BB单克隆抗体，正在进行包括实体瘤治疗在内的适应症临床试验。尽管有最初的功效迹象，但在高于1mg/kg的剂量下，乌瑞芦单抗的临床研发受到炎性肝毒性的阻碍。乌托鲁单抗不如乌瑞芦单抗有效，但与乌瑞芦单抗相比，它具有改善的安全特性(Chester等人，Blood 131:39-57(2018))。需要靶向4-1BB的有效治疗剂，其不会引起如用乌瑞芦单抗观察到的肝毒性或其他全身性损伤。
OX40激动剂已被报道能够增加T-细胞在肿瘤中的浸润。OX40信号传导可以阻止Treg介导的对抗肿瘤免疫应答的抑制。在若干个临床前小鼠癌症模型中，包括4T-1乳腺癌、B16黑素瘤、Lewis肺癌和若干种化学诱导的肉瘤，OX40激动剂的注射引起治疗反应。(Ohsima等人，J.Immunology 159:3838-3848(1997)；Imura等人，J.Exp.Med.183:2185-2195(1996)；Maxwell等人，J.Immunology164:107-112(2000)；Gough等人，J.Immunotherapy 33(8):798-809(2010))。
在一些情况下，研究人员已生成包含针对4-1BB或OX40的多个结合结构域(>2)，或多个OX40L和4-1BBL细胞外结构域的融合物以诱导激动作用的蛋白构建体。在其他示例中，存在包含针对4-1BB或OX40的结合结构域和针对肿瘤特异性抗原的结合结构域的双特异性蛋白质。经由肿瘤抗原结合的结合和聚集会诱导4-1BB和OX40的聚集和信号传导。然而，预期这些构建体均不能刺激肿瘤浸润性淋巴细胞(即，CD8+T细胞、CD4 T+细胞和NK细胞)的功能，并且在效应细胞的脱靶活化(即，通过结合FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIa和FcγRIIIb进行的活化)很小至没有脱靶活化的情况下如此。因此，需要选择性地支持肿瘤浸润性淋巴细胞的活性(对循环淋巴细胞的影响很小或没有影响)的治疗选择，例如包含结合并刺激4-1BB和OX40的双特异性抗体的药物组合物。
发明内容
本公开的一些方面提供了一种药物组合物，该药物组合物包含：(a)特异性结合4-1BB和OX40的双特异性抗体或其抗原结合片段；(b)约5mM至约15mM的稳定性促进缓冲液；(c)约25mM至约50mM的稳定氨基酸；(d)约2％至约8％w/v的糖；以及(e)约0.01％至约-0.03％的表面活性剂。
在本公开的一些方面，稳定性促进缓冲液选自由琥珀酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和谷氨酸盐组成的组。在一些方面，稳定性促进缓冲液以约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM或约15mM的量存在于组合物中。在一些方面，稳定性促进缓冲液是谷氨酸盐。在一些方面，谷氨酸盐以约5mM的浓度存在于组合物中。
在本公开的一些方面，稳定氨基酸选自由精氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和甘氨酸组成的组。在一些方面，稳定氨基酸以约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM、约31mM、约32mM、约33mM、约34mM、约35mM、约36mM、约37mM、约38mM、约39mM、约40mM、约41mM、约42mM、约43mM、约44mM、约45mM、约46mM、约47mM、约48mM、约49mM或约50mM的浓度存在于组合物中。在一些方面，稳定氨基酸是亮氨酸。在一些方面，亮氨酸以约40mM的浓度存在于组合物中。
在本公开的一些方面，糖选自由以下项组成的组：蔗糖、海藻糖和山梨糖醇。在一些方面，糖以约2％w/v至约8％w/v的浓度存在于组合物中。在一些方面，糖以约2％w/v、约3％w/v、约4％w/v、约5％w/v、约6％w/v、约7％w/v或约8％w/v的浓度存在于组合物中。在一些方面，糖是蔗糖。在一些方面，蔗糖以约3％w/v的浓度存在于组合物中。
在本公开的一些方面，药物组合物还包含表面活性剂。在一些方面，表面活性剂以约0.01％w/v至约0.03％w/v的浓度存在于组合物中。在一些方面，表面活性剂是聚山梨酯-80。在一些方面，聚山梨酯-80以约3％w/v的浓度存在于组合物中。
在本公开的一些方面，组合物的pH在约4.3至约4.7的范围内。在一些方面，组合物的pH为约4.5。
在本公开的一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段以约10mg/mL-50mg/mL的浓度存在于组合物中。
在本公开的一些方面，药物组合物不含氯化钠(NaCl)。
在本公开的一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段具有约>90％的纯度。
在本公开的一些方面，本文所提供的药物组合物包含：(a)浓度为约10mg/mL的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段；(b)约10mM谷氨酸盐；(c)约40mM亮氨酸；(d)约3％w/v蔗糖；以及(e)约0.02％聚山梨酯-80；其中所述组合物的pH为约4.3至约4.7。
在本公开的一些方面，本文所提供的药物组合物包含：(a)浓度为10mg/mL的4-1BBx OX40双特异性抗体或其抗原结合片段；(b)10mM谷氨酸盐；(c)40mM亮氨酸；(d)3％w/v蔗糖；以及(e)0.02％聚山梨酯-80；其中所述组合物的pH为4.5。
在本公开的一些方面，本文所提供的药物组合物包含4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含单链Fv(scFv)。
在本公开的一些方面，本文所提供的药物组合物包含：4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、二硫键连接的Fv或scFv-Fc。
在本公开的一些方面，本文所提供的药物组合物包含4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含人4-1BB抗原结合结构域和人OX40抗原结合结构域，其中：(a)4-1BB抗原结合结构域包含(i)含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH-CDR1；(ii)含有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的VH-CDR2；(iii)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH-CDR3；(iv)含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)-CDR1；(v)含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL-CDR2；以及(vi)含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VL-CDR3；并且(b)OX40抗原结合结构域包含(i)含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH-CDR1；(ii)含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VH-CDR2；(iii)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH-CDR3；(iv)含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL-CDR1；(v)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VL-CDR2；以及(vi)含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL-CDR3。
在一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段包含人4-1BB抗原结合结构域和人OX40抗原结合结构域，其中：(a)4-1BB抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区；并且(b)OX40抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO:18的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段包含人4-1BB抗原结合结构域和人OX40抗原结合结构域，其中：(a)4-1BB抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的scFv；并且(b)OX40抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的scFv。
在一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
在本公开的一些方面，本文所提供的药物组合物包含：(a)10mg/mL的4-1BB xOX40双特异性抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：(i)4-1BB抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH-CDR1；含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH-CDR2；含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH-CDR3；含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)-CDR1；含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL-CDR2；以及含有SEQID NO:6的氨基酸序列的VL-CDR3；以及OX40抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH-CDR1；含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VH-CDR2；含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH-CDR3；含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL-CDR1；含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VL-CDR2；以及含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL-CDR3；(ii)4-1BB抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区；以及OX40抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区；(iii)4-1BB抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的scFv；以及OX40抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的scFv；或者(iv)SEQ ID NO:13的氨基酸序列；(b)约5mM至约15mM谷氨酸盐；(c)约25mM至约50mM亮氨酸；(d)约2％至约8％w/v蔗糖；以及(e)约0.01％至约-0.03％聚山梨酯-80；其中所述组合物的pH为约4.3至约4.7。
在本公开的一些方面，本文所提供的药物组合物包含：(a)10mg/mL的4-1BB xOX40双特异性抗体或其抗原结合片段；其中该抗体或其抗原结合片段包含：(i)4-1BB抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH-CDR1；含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH-CDR2；含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH-CDR3；含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)-CDR1；含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL-CDR2；以及含有SEQID NO:7的氨基酸序列的VL-CDR3；以及(ii)OX40抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH-CDR1；含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VH-CDR2；含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH-CDR3；含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL-CDR1；含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VL-CDR2；以及含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL-CDR3；(b)10mM谷氨酸盐；(c)40mM亮氨酸；(d)3％w/v蔗糖；以及(e)0.02％聚山梨酯-80；其中所述组合物的pH为4.5。
在一些方面，所述药物组合物包含：(a)4-1BB抗原结合结构域包含含有SEQ IDNO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区；并且(b)OX40抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO:18的氨基酸序列的轻链可变区。
在本公开的一些方面，本文所提供的药物组合物是液体。
在本文所提供的药物组合物的一些方面，人4-1BB结合结构域和人OX40结合结构域位于同一多肽上。在一些方面，人4-1BB结合结构域位于人OX40结合结构域的N-末端。在一些方面，人4-1BB结合结构域位于人OX40结合结构域的C-末端。
在本文所提供的药物组合物的一些方面，抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白恒定区。在一些方面，免疫球蛋白恒定区包括IgG1的免疫球蛋白CH2和CH3结构域。在一些方面，抗体不含CH1结构域。在一些方面，根据EU编号系统，免疫球蛋白恒定区包括人IgG1CH2结构域，其包含E233P、L234A、L235A、G237A和K322A取代以及G236缺失。
在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白恒定区与人4-1BB结合结构域之间和/或免疫球蛋白恒定区与人OX40结合结构域之间的接头。在一些方面，免疫球蛋白恒定区与人4-1BB结合结构域之间和/或免疫球蛋白恒定区与人OX40结合结构域之间的接头含有10-30个氨基酸、15-30个氨基酸或20-30个氨基酸。在一些方面，免疫球蛋白恒定区与人4-1BB结合结构域之间或免疫球蛋白恒定区与人OX40结合结构域之间的接头含有氨基酸序列(Gly4Ser)n，其中n＝1-5(SEQ ID NO:21)，任选地其中n＝1。在一些方面，抗体包含两种多肽的二聚体，每种多肽从氨基末端到羧基末端依次包含第一scFv、铰链区、免疫球蛋白恒定区和第二scFv，其中(a)第一scFv包含人4-1BB抗原结合结构域，并且第二scFv包含人OX40抗原结合结构域，或者(b)第一scFv包含人OX40抗原结合结构域，并且第二scFv包含人4-1BB抗原结合结构域。在一些方面，二聚体是同二聚体。
在本公开的一些方面，本文所提供的药物组合物可储存在-20℃下。在一些方面，本文所提供的药物组合物在-20下℃储存后，在约3周、约6周、约3个月、约6个月和约7个月后，pH没有显著变化。在一些方面，本文所提供的药物组合物在-20℃下储存后，在约3周、约6周、约3个月、约6个月或约7个月后，高分子量含量百分比(HMW％)没有显著变化。在一些方面，在-20℃下储存后，在约3周、约6周、约3个月、约6个月或约7个月后，HMW％的变化小于5％。
在本公开的一些方面，本文所提供的药物组合物在一个、两个或三个冷冻/解冻循环后HMW％没有显著变化。在一些方面，在一个、两个或三个冷冻/解冻循环后，HMW％的变化小于5％。在一些方面，HMW％通过尺寸排阻超高压液相色谱法(SE-UPLC)来测量。
在本公开的一些方面，本文所提供的药物组合物在-20℃下储存后，在约3周、约6周、约3个月、约6个月或约7个月后聚集体形成没有显著变化，如通过尺寸排阻超高压液相色谱法(SE-UPLC)所测量。
本文还提供了治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文所公开的药物组合物。在一些方面，癌症是实体瘤癌症。在一些方面，癌症是肉瘤、癌或淋巴瘤。在一些方面，癌症选自由黑素瘤、肾癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌/肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、脑癌或血液癌症组成的组。在一些方面，受试者是人。在一些方面，受试者在肿瘤浸润性淋巴细胞上表达4-1BB和OX40。
在本公开的一些方面，本文所提供的药物组合物用于治疗癌症。在一些方面，本文所提供的药物组合物用于治疗实体瘤癌症。在一些方面，实体瘤癌症是肉瘤、癌或淋巴瘤。在一些方面，癌症选自由黑素瘤、肾癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌/肠癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、脑癌或血液癌症组成的组。
附图说明
图1A和图1B示出了不同蛋白质制剂中FXX01102的Tagg分析。
(参见实施例2。)
图2示出了对以10mg/mL配制在10mM谷氨酸盐、8％w/v蔗糖、0.02％w/v聚山梨酯-80中并且含有或不含100mM氯化钠的FXX01102进行的B22分析的结果。(参见实施例3。)
图3示出了对比精氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸对配制在10mM谷氨酸盐、4％w/v蔗糖中(pH 4.5)的10mg/mL FXX01102的影响的B22分析结果。(参见实施例4。)
图4示出了测定亮氨酸对配制在10mM谷氨酸盐、4％w/v蔗糖中(pH 4.5)的FXX01102的影响的B22实验的结果。(参见实施例4。)
图5示出了在添加或不添加25mM MgSO4、赖氨酸或亮氨酸的情况下配制在10mM谷氨酸盐、4％w/v蔗糖中(pH 4.5)的10mg/mL FXX01102的Tagg图的对比(参见实施例5)。
具体实施方式
为了便于理解本公开，下面定义了许多术语和短语。
I.术语
如本文所用，术语“4-1BB”是指哺乳动物4-1BB多肽，包括但不限于天然4-1BB多肽和4-1BB多肽的同种型。“4-1BB”包括全长、未加工的4-1BB多肽以及由细胞内加工产生的4-1BB多肽形式。如本文所用，术语“CD137”应理解为可与术语“4-1BB”互换。如本文所用，术语“人4-1BB”是指含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽。如本文所用，术语“食蟹猴4-1BB”是指含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽。“4-1BB多核苷酸”、“4-1BB核苷酸”或“4-1BB核酸”是指编码4-1BB的多核苷酸。
如本文所用，术语“OX40”是指哺乳动物OX40多肽，包括但不限于天然OX40多肽和OX40多肽的同种型。“OX40”包括全长、未加工的OX40多肽以及由细胞内加工产生的OX40多肽形式。如本文所用，术语“人OX40”是指含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽。如本文所用，术语“食蟹猴OX40”是指含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽。“OX40多核苷酸”、“OX40核苷酸”或“OX40核酸”是指编码OX40的多核苷酸。
如本文所用，术语“肿瘤浸润性淋巴细胞”或“TIL”是指直接与肿瘤细胞竞争和/或围绕肿瘤细胞的淋巴细胞。肿瘤浸润性淋巴细胞通常是非循环淋巴细胞，并且包括CD8+T细胞、CD4+T细胞和NK细胞。肿瘤浸润性淋巴细胞可表达OX40和4-1BB。
如本文所用，术语“抗体”是本领域的术语，并且可在本文中互换使用，并且是指具有至少一个特异性结合抗原的抗原结合位点的分子或分子复合物。
抗体可包括例如单克隆抗体、重组产生的抗体、人抗体、人源化抗体、表面重建抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、含有两个重链分子和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、内抗体、异缀合(heteroconjugate)抗体、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fvs(scFv)、骆驼化抗体、亲和体、Fab片段、F(ab’)2片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)、抗独特型(抗id)抗体(包括例如抗抗Id抗体)、双特异性抗体和多特异性抗体。在一些方面，本文所述的抗体是指多克隆抗体群体。抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a或IgG2b)。在一些方面，本文所述的抗体是IgG抗体，或其类别(例如，人IgG1、IgG2或IgG4)或亚类。在一个具体方面，抗体是人源化单克隆抗体。在另一个具体方面，抗体是人单克隆抗体，例如免疫球蛋白。在一些方面，本文所述的抗体是IgG1、IgG2或IgG4抗体。
“双特异性”抗体是具有结合两种不同抗原的两个不同抗原结合位点(Fc区除外)的抗体。双特异性抗体可包括例如重组产生的抗体、人抗体、人源化抗体、表面重建抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、含有两个重链分子和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、异缀合抗体、连接的单链抗体或连接的单链Fv(scFv)、骆驼化抗体、亲和体、连接的Fab片段、F(ab’)2片段、化学连接的Fv和二硫键连接的Fv(sdFv)。双特异性抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a或IgG2b)。在一些方面，本文所述的双特异性抗体是IgG抗体，或其类别(例如，人IgG1、IgG2或IgG4)或亚类。在一些方面，本文所述的双特异性抗体包含两种多肽，任选地相同的多肽，每种多肽从氨基末端到羧基末端依次包含第一scFv抗原结合结构域、接头(任选地其中接头是铰链区)、免疫球蛋白恒定区和第二scFv抗原结合结构域。这种特定类型的抗体通过ADAPTIRTM技术来例示。示例性分子在本公开中通篇称为FXX01102。双特异性抗体可以例如对于每个靶标是单价的(例如，一个臂靶向一个抗原并且另一个臂靶向第二抗原的IgG分子)或者对于每个靶标是二价的(例如，双重可变结构域抗体、IgG-scFv、scFv-Fc-scFv或含有二聚体的ADAPTIRTM抗体，其中二聚体的每个多肽含有两个不同的抗原结合结构域)。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”、“抗原结合区”、“抗原结合位点”和类似术语是指抗体分子的包含赋予抗体分子对抗原的特异性的氨基酸残基(例如，互补决定区(CDR))的部分。抗原结合区可以来源于任何动物物种，诸如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠或仓鼠)和人。结合4-1BB的抗原结合结构域在本文中可称为例如“4-1BB结合结构域”。结合OX40的抗原结合结构域在本文中可称为例如“OX40结合结构域”。如本文所用，“人4-1BB结合结构域”或“人4-1BB抗原结合结构域”是指特异性结合人4-1BB的抗原结合结构域，但其也可结合非人4-1BB(例如，鼠、啮齿动物或非人灵长类动物4-1BB)。同样，“人OX40结合结构域”或“人OX40抗原结合结构域”是指特异性结合人OX40的抗原结合结构域。
如本文所用，术语“4-1BB/OX40抗体”、“抗4-1BB/OX40抗体”或“4-1BB x OX40抗体”是指包含结合4-1BB(例如，人4-1BB)的抗原结合结构域和结合OX40(例如，人OX40)的抗原结合结构域的双特异性抗体。
“单克隆”抗体是指参与单个抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合的同质抗体群体。这与通常包含针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体不同。术语“单克隆”抗体包括完整和全长免疫球蛋白分子以及Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、单链(scFv)、包含抗体部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其他经修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆”抗体是指以多种方式制备的此类抗体，包括但不限于通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物。
术语“嵌合”抗体是指其中氨基酸序列来源于两个或更多个物种的抗体。通常，轻链和重链的可变区都对应于来源于一种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔等)的具有期望特异性、亲和力和能力的抗体的可变区，而恒定区与来源于另一种哺乳动物(通常是人)的抗体中的序列同源以避免在该物种中引起免疫应答。
术语“人源化”抗体是指含有最小非人(例如，鼠)序列的非人(例如，鼠)抗体形式。通常，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中来自互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(例如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠)的CDR的具有期望特异性、亲和力和能力的(“CDR移植的”)残基替代(Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature332:323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science 239:1534-1536(1988))。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被来自非人物种的具有期望特异性、亲和力和能力的抗体中的对应残基替代。其人源化抗体可通过在Fv框架区中和/或在替代的非人残基内替换另外的残基来进一步修饰，以改进和优化抗体特异性、亲和力和/或能力。一般来讲，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个或三个可变结构域，所述可变结构域含有对应于非人免疫球蛋白的所有或基本上所有的CDR区，而所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的那些。用于生成人源化抗体的方法的示例描述于美国专利号5,225,539；Roguska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91(3):969-973(1994)，以及Roguska等人，Protein Eng.9(10):895-904(1996)中。
术语“人”抗体意指具有来源于人免疫球蛋白基因座的氨基酸序列的抗体，其中此类抗体使用本领域已知的任何技术制备。
可变区通常是指抗体的一部分，通常是轻链或重链的一部分，通常是成熟重链的氨基末端的约110至125个氨基酸和成熟轻链的约90至115个氨基酸，它们在抗体之间的序列上有很大不同并且用于特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列的可变性集中在称为互补决定区(CDR)的那些区域中，而可变结构域中更高度保守的区域称为框架区(FR)。不希望受任何特定机制或理论的束缚，据信轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在一些方面，可变区是人可变区。在一些方面，可变区包含啮齿动物或鼠CDR和人框架区(FR)。在具体方面，可变区是灵长类动物(例如，非人灵长类动物)可变区。在一些方面，可变区包含啮齿动物或鼠CDR和灵长类动物(例如，非人灵长类动物)框架区(FR)。
术语“VH”和“VH结构域”可互换使用，指抗体的重链可变区。
术语“VL”和“VL结构域”可互换使用，指抗体的轻链可变区。
术语“Kabat编号”和类似术语是本领域公认的，并且是指对抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中的氨基酸残基进行编号的系统。在一些方面，抗体的CDR可根据Kabat编号系统确定(参见例如Kabat EA&WuTT(1971)Ann NY Acad Sci 190:382-391和Kabat EA等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公布号91-3242)。使用Kabat编号系统，抗体重链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置31至35，其任选地可在35(在Kabat编号方案中称为35A和35B)(CDR1)之后包含一个或两个另外的氨基酸，即氨基酸位置50至65(CDR2)和氨基酸位置95至102(CDR3)。使用Kabat编号系统，抗体轻链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置24至34(CDR1)、氨基酸位置50至56(CDR2)和氨基酸位置89至97(CDR3)。在一个具体的实施方案中，本文所述抗体的CDR根据Kabat编号方案来确定。
Chothia是指结构环的位置(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。当使用Kabat编号惯例进行编号时，Chothia CDR-H1环的端部在H32和H34之间变化，具体取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案将插入置于H35A和H35B；如果35A和35B都不存在，则环在32处结束；如果仅存在35A，则环在33处结束；如果35A和35B都存在，则环在34处结束)。在一个具体的实施方案中，本文所述抗体的CDR根据Chothia编号方案来确定。
AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，并且被OxfordMolecular's AbM抗体建模软件使用。在一个具体的实施方案中，本文所述抗体的CDR根据AbM编号方案来确定。
IMGT编号惯例描述于Brochet,X等人，Nucl.Acids Res.36:W503-508(2008)中。在一个具体的实施方案中，本文所述抗体的CDR根据IMGT编号惯例来确定。如本文所用，除非另有说明，否则免疫球蛋白分子的可变区中氨基酸残基的位置根据IMGT编号惯例来编号。
如本文所用，术语“恒定区”或“恒定结构域”是可互换的并且具有其在本领域中常见的含义。恒定区是抗体部分，例如轻链和/或重链的羧基末端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但可以表现出各种效应子功能，诸如与Fc受体的相互作用。免疫球蛋白分子的恒定区通常具有相对于免疫球蛋白可变结构域更保守的氨基酸序列。免疫球蛋白“恒定区”或“恒定结构域”可含有CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域或这些结构域的子集，例如CH2结构域和CH3结构域。在本文所提供的一些方面，免疫球蛋白恒定区不含CH1结构域。在本文所提供的一些方面，免疫球蛋白恒定区不含铰链。在本文所提供的一些方面，免疫球蛋白恒定区含有CH2结构域和CH3结构域。
“Fc区”或“Fc结构域”是指对应于或来源于源抗体的负责结合细胞上的抗体受体和补体的C1q组分的部分的多肽序列。Fc代表“片段晶体”，是指易于形成蛋白质晶体的抗体片段。最初通过蛋白水解消化描述的不同蛋白质片段可以定义免疫球蛋白的总体结构。“Fc区”或“Fc结构域”含有CH2结构域、CH3结构域和任选地铰链的全部或一部分。“Fc区”或“Fc结构域”可指单个多肽或两个二硫键连接的多肽。关于免疫球蛋白结构和功能的综述，参见Putnam,The Plasma Proteins，第V卷(Academic Press,Inc.,1987)，第49-140页；以及Padlan,Mol.Immunol.31:169-217,1994。如本文所用，术语Fc包括天然存在的序列的变体。
如本文所用的“免疫球蛋白二聚化结构域”或“免疫球蛋白异二聚化结构域”是指优先与第二多肽链的不同免疫球蛋白结构域相互作用或缔合的多肽链的免疫球蛋白结构域，其中不同免疫球蛋白异二聚化结构域的相互作用基本上有助于或有效地促进第一多肽链和第二多肽链的异二聚化(即，在两条不同多肽链之间形成二聚体，其也称为“异二聚体”)。如果在不存在第一多肽链的免疫球蛋白异二聚化结构域和/或第二多肽链的免疫球蛋白异二聚化结构域的情况下第一多肽链与第二多肽链之间的二聚化存在统计学上显著的减少，则免疫球蛋白异二聚化结构域之间的相互作用“基本上有助于或有效地促进”第一多肽链和第二多肽链的异二聚化。在一些方面，当第一多肽链和第二多肽链共表达时，至少60％、至少约60％至约70％、至少约70％至约80％、至少80％至约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的第一多肽链和第二多肽链彼此形成异二聚体。代表性的免疫球蛋白异二聚化结构域包括免疫球蛋白CH1结构域、免疫球蛋白CL结构域(例如，Cκ或Cλ同种型)或其衍生物，包括野生型免疫球蛋白CH1和CL结构域和改变的(或突变的)免疫球蛋白CH1和CL结构域，如其中所提供。
“野生型免疫球蛋白铰链区”是指天然存在的上部和中部铰链氨基酸序列，其插入并连接天然存在的抗体的重链中的CH1和CH2结构域(对于IgG、IgA和IgD)或插入并连接CH1和CH3结构域(对于IgE和IgM)。在一些方面，野生型免疫球蛋白铰链区序列是人的，并且可包含人IgG铰链区。“改变的野生型免疫球蛋白铰链区”或“改变的免疫球蛋白铰链区”是指(a)具有至多30％的氨基酸变化(例如，至多25％、20％、15％、10％、或5％氨基酸取代或缺失)的野生型免疫球蛋白铰链区，或者(b)野生型免疫球蛋白铰链区的具有约5个氨基酸的长度(例如，约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸)至多达约120个氨基酸(例如，具有约10至约40个氨基酸或约15至约30个氨基酸或约15至约20个氨基酸或约20至约25个氨基酸的长度)、具有至多约30％的氨基酸变化(例如，至多约25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的氨基酸取代或缺失或它们的组合)并且具有如US2013/0129723和US 2013/0095097中公开的IgG核心铰链区的一部分。如本文所提供，“铰链区”或“铰链”可位于抗原结合结构域(例如，4-1BB或OX40结合结构域)与免疫球蛋白恒定区之间。
如本文所用，“接头”是指能够连接两个化合物(例如，两个多肽)的部分，例如多肽。接头的非限制性示例包括含有甘氨酸-丝氨酸(例如，(Gly4Ser))重复序列的柔性接头，以及来源于以下的接头：(a)跨膜蛋白(例如，I型跨膜蛋白)的结构域间区域；(b)II型C-凝集素的茎区；或者(c)免疫球蛋白铰链。如本文所提供，接头可指例如(1)单链Fv(scFv)中VH区与VL区之间的多肽区，或者(2)免疫球蛋白恒定区与抗原结合结构域之间的多肽区。在一些方面，接头由5至约35个氨基酸组成，例如约15至约25个氨基酸。在一些方面，接头由至少5个氨基酸、至少7个氨基酸或至少9个氨基酸组成。
如本文所用，术语“重链”在相对于抗体使用时可指基于恒定区的氨基酸序列的任何不同类型，例如alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)，它们分别产生IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类别的抗体，包括IgG亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
如本文所用，术语“轻链”在相当于抗体使用时可指基于恒定区的氨基酸序列的任何不同类型，例如kappa(κ)或lambda(λ)。轻链氨基酸序列是本领域众所周知的。在具体方面，轻链是人轻链。
如本文所用，术语“EU编号系统”是指抗体的恒定区的EU编号惯例，如Edelman,G.M.等人，Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969)以及Kabat等人，Sequences of ProteinsofImmunological Interest,U.S.Dept.Health and Human Services，第5版，1991年所述，所述文献各自全文以引用方式并入本文。如本文所用，除非另有说明，否则免疫球蛋白分子的恒定区中氨基酸残基的位置根据EU命名法来编号(Ward等人，1995Therap.Immunol.2:77-94)。
如本文所用，术语“二聚体”是指由通过一种或多种形式的分子内力(包括共价键(例如，二硫键)和其他相互作用(例如，静电相互作用、盐桥、氢键和疏水相互作用))彼此缔合的两个亚基组成并且在适当条件下(例如，在生理条件下，在适于表达、纯化和/或储存重组蛋白的水溶液中，或在用于非变性和/或非还原电泳的条件下)稳定的生物实体。如本文所用的“异二聚体”或“异二聚体蛋白”是指由两个不同多肽形成的二聚体。如本文所用的“同二聚体”或“同二聚体蛋白”是指由两个相同多肽形成的二聚体。
“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(KD)表示。亲和力可以本领域已知的多种方式测量和/或表达，包括但不限于平衡解离常数(KD)和平衡缔合常数(KA)。KD由koff/kon的商计算，而KA由kon/koff的商计算，kon是指例如抗体与抗原的缔合速率常数，并且koff是指例如抗体与抗原的解离。kon和koff可通过本领域普通技术人员已知的技术确定，诸如或KinExA。
如本文所用，术语“免疫特异性结合”、“免疫特异性识别”、“特异性结合”和“特异性识别”是抗体上下文中的类似术语。这些术语表明抗体经由其抗原结合结构域与表位结合，并且该结合需要抗原结合结构域与表位之间的一些互补性。因此，与人4-1BB和/或OX40“特异性结合”的抗体也可以与不相关的非4-1BB和/或OX40蛋白结合，但其结合程度小于抗体与4-1BB和/或OX40抗体的结合的约10％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)所测量。
结合结构域可分类为“高亲和力”结合结构域和“低亲和力”结合结构域。“高亲和力”结合结构域是指KD值小于10-7M、小于10-8M、小于10-9M、小于10-10M的那些结合结构域。“低亲和力”结合结构域是指KD大于10-7M、大于10-6M或大于10-5M的那些结合结构域。“高亲和力”和“低亲和力”结合结构域结合它们的靶标，而不显著结合测试样品中存在的其他组分。
如本文所用，如果抗体在紧密接近靶标时并且在本领域技术人员认为对于结合必需的条件下将特异性结合其靶标(即，人4-1BB或人OX40)，则抗体是“能够结合的”。“人4-1BB抗原结合结构域”应理解为意指特异性结合人4-1BB的结合结构域。“人OX40抗原结合结构域”应理解为意指特异性结合OX40的结合结构域。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。该术语还包括已天然地或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，诸如与标记组分的缀合。该定义中还包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。应当理解，由于本发明的多肽基于抗体，因此在一些方面，多肽可作为单链或缔合链存在。
术语“药物制剂”和“药物组合物”是指这样的制剂，其形式允许活性成分的生物活性是有效的，并且其不包含对将施用制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。制剂可以是无菌的。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指当使用本领域众所周知的途径施用时通常不产生过敏或其他严重不良反应的分子实体和组合物。由联邦或州政府的管理机构批准的或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于动物、更具体地用于人的分子实体和组合物被认为是“药学上可接受的”。
如本文所用的术语“施用(administer)”、“施用(administering)”、“施用(administration)”等是指可用于使得药物例如4-1BB/OX40抗体或其抗原结合片段能够递送到期望的生物作用位点的方法(例如，静脉内施用)。可与本文所述的药剂和方法一起使用的施用技术可见于例如Goodman和Gilman，The Pharmacological Basis ofTherapeutics，现行版，Pergamon；以及Remington’s,Pharmaceutical Sciences，现行版，Mack Publishing Co.,Easton,Pa。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”可互换使用。受试者可以是动物。在一些方面，受试者是哺乳动物，诸如非人动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠、小鼠、猴或其他灵长类动物等)。在一些方面，受试者是人。如本文所用，术语“有需要的患者”或“有需要的受试者”是指处于疾病、病症或病状的风险或患有疾病、病症或病状的患者，所述疾病、病症或病状适于用例如本文所提供的4-1BB/OX40抗体或其抗原结合片段治疗或改善。有需要的患者可以是例如被诊断患有癌症的患者。
术语“治疗有效量”是指能够有效治疗受试者的疾病或病症的药物(例如，抗4-1BB/OX40抗体)的量。就癌症而言，治疗有效量的药物可以减少癌细胞数量；减小肿瘤大小或负担；抑制(即，在一定程度上减缓并且在特定方面停止)癌细胞浸润到外周器官中；抑制(即，在一定程度上减缓并且在特定方面停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状；和/或导致有利的应答，诸如增加的无进展生存期(PFS)、无疾病生存期(DFS)或总生存期(OS)、完全应答(CR)、部分应答(PR)，或在一些情况下，稳定病情(SD)、进行性疾病(PD)的减少、减少的疾病进展时间(TTP)或它们的任何组合。
诸如“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“治疗(to treat)”或“缓解(alleviating)”或“缓解(to alleviate)”的术语是指治愈、减缓、减轻所诊断的病理状况或病症的症状和/或停止所诊断的病理状况或病症的进展的治疗措施。因此，需要治疗的患者包括已被诊断患有或疑似患有病症的患者。在一些方面，如果患者表现出以下中的一者或多者，则受试者根据本发明的方法成功地“治疗”癌症：癌细胞数量减少或完全不存在；肿瘤大小减小；抑制或不存在癌细胞浸润到外周器官中，包括例如癌症扩散到软组织和骨中；抑制或不存在肿瘤转移；抑制或不存在肿瘤生长；与特定癌症相关的一种或多种症状的缓解；发病率和死亡率降低；生活质量改善；肿瘤的致瘤性、致瘤频率或致瘤能力的降低；肿瘤中癌症干细胞数量或频率的减少；致瘤细胞分化成非致瘤状态；增加的无进展生存期(PFS)、无疾病生存期(DFS)或总生存期(OS)、完全应答(CR)、部分应答(PR)、稳定病情(SD)、进行性疾病(PD)的减少、减少的疾病进展时间(TTP)或它们的任何组合。
术语“癌症”和“癌的”是指或描述哺乳动物中的生理状况，其中细胞群体的特征在于不受调节的细胞生长。癌症的示例包括但不限于黑素瘤、肾癌、胰腺癌、肺癌、肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、脑癌和血液癌症。癌症可以是原发性肿瘤或者可以是晚期或转移性癌症。
癌症可以是实体瘤癌症。术语“实体瘤”是指通常不含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤的示例是肉瘤、癌和淋巴瘤。白血病(血癌)通常不形成实体瘤。实体瘤可含有表达OX40和4-1BB的肿瘤浸润性淋巴细胞。
应当理解，除非另外指明，否则如本文所用的术语“一个”和“一种”是指列举的组分中的“一种或多种”。
除非具体说明或从上下文中显而易见，如本文所用，术语“或”应理解为包含性的。如本文中诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下各方面：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
应当理解，在本文中用语言“包含”描述的任何方面，还提供以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似方面，并且是本申请的公开内容的一部分。在本公开中，“包含”、“包括”、“含有”和“具有”等可具有在美国和欧洲专利法中赋予它们的含义，并且可意指“包括”、“包含”等；“基本上由……组成”或“基本上由……组成”同样具有美国和欧洲专利法中规定的含义。应当理解，就美国专利法而言，该术语是开放式的，允许存在多于所列举的那些，只要所列举的那些的基本或新颖特征不因存在多于所列举的那些而改变，但排除现有技术方面。还应当理解，就欧洲专利法而言，“基本上由……组成”或“基本上包含”的使用意指可存在特定的其他组分，即不实质上影响化合物或组合物的基本特征的那些。
如本文所用，术语“约”和“大约”在用于修饰数值或数值范围时表示高达该数值或范围以上5％或以下5％的偏差保持在所述数值或范围的预期含义内。
本文所提供的任何结构域、组分、组合物和/或方法可与本文所提供的任何其他结构域、组分、组合物和/或方法中的任一者或多者组合。
II.药物组合物
本公开提供了包含4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的新型药物组合物，其相对于已知制剂具有增强的稳定性。本文所提供的新型药物组合物抑制在-20℃储存期间以及在多次冻融循环后随时间推移的聚集体形成。本公开的新型药物组合物包含4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段，其与特定赋形剂(即，稳定性促进缓冲液、稳定氨基酸、糖组分和表面活性剂)一起配制以改善稳定性。有利地，新型药物组合物在一定pH值范围内提供增强的稳定性。
稳定蛋白质的二级和三级结构以使聚集物或降解产物的形成最小化的溶液条件对于治疗制剂是理想的。对于用于治疗疾病的治疗性蛋白质，例如4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段，产物相关污染物可具有不期望的后果，包括效力损失、效力意外增加、免疫原性和其他不期望的副作用。制剂可由若干种组分组成并且通常以水溶液形式提供。此类组分可包括但不限于：保持一定pH并抵抗储存期间pH变化的缓冲液、盐、氨基酸、洗涤剂、聚合物、糖和其他化学赋形剂，诸如表面活性剂，其用于保持药物的稳定性或溶解性，或将其他期望特性掺入溶液中。此类组分可具有正电荷或负电荷，可以是两性离子或者可以是两亲性的、疏水性的或亲水性的。不同组分可基于其化学特性结合、相互作用和/或稳定蛋白质的不同区域。适于向人类患者施用的药物组合物通常被配制用于肠胃外施用，例如在液体载体中，或适于重构为用于静脉内或皮下施用的液体溶液或悬浮液。用于肠胃外施用的液体组合物可被配制用于通过注射或连续输注施用。通过注射或输注施用的途径包括静脉内、腹膜内、肌内、鞘内和皮下。在一些方面，本文所公开的药物制剂在施用前冻干。在一些方面，本文所公开的药物制剂不在施用前冻干。
本公开提供了包含4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的新型药物组合物。在一些方面，本公开提供了(a)特异性结合4-1BB和OX40的双特异性抗体或其抗原结合片段；(b)约5mM至约15mM的稳定性促进缓冲液；(c)约25mM至约50mM的稳定氨基酸；(d)约2％至约8％w/v的糖；以及(e)约0.01％至约-0.03％的表面活性剂。
在一些方面，本文所公开的包含4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物包含稳定性促进缓冲液，该稳定性促进缓冲液选自由琥珀酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和谷氨酸盐组成的组。在一些方面，稳定性促进缓冲液以约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM或约15mM的浓度存在于组合物中。在一些方面，稳定性促进缓冲液是谷氨酸盐。在一些方面，谷氨酸盐以约5mM的浓度存在于组合物中。
在一些方面，本文所公开的包含4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物包含选自由精氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和甘氨酸组成的组的稳定氨基酸。在一些方面，稳定氨基酸以约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM、约31mM、约32mM、约33mM、约34mM、约35mM、约36mM、约37mM、约38mM、约39mM、约40mM、约41mM、约42mM、约43mM、约44mM、约45mM、约46mM、约47mM、约48mM、约49mM或约50mM的浓度存在于组合物中。在一些方面，稳定氨基酸是亮氨酸。在一些方面，亮氨酸以约40mM的浓度存在于组合物中。
在一些方面，本文所公开的包含4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物包含选自由以下项组成的组的糖：蔗糖、海藻糖和山梨糖醇。在一些方面，糖以约2％w/v至约8％w/v的浓度存在于组合物中。在一些方面，糖以约2％w/v、约3％w/v、约4％w/v、约5％w/v、约6％w/v、约7％w/v或约8％w/v的浓度存在于组合物中。在一些方面，糖是蔗糖。在一些方面，蔗糖以约3％w/v的浓度存在于组合物中。
在一些方面，本文所公开的包含4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物包含表面活性剂。在一些方面，表面活性剂以约0.01％w/v至约0.03％w/v的浓度存在于组合物中。在一些方面，表面活性剂是聚山梨酯-80。在一些方面，聚山梨酯-80以约3％w/v的浓度存在于组合物中。
在一些方面，包含本文所公开的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物在一定pH范围内提供增强的稳定性。在一些方面，组合物的pH在约4.3至约4.7的范围内。在一些方面，组合物的pH为约4.5。在一些方面，组合物的pH为4.5。
在本文所公开的药物组合物的一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段以约10-50mg/mL的浓度存在于组合物中。在一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段以约10mg/mL的浓度存在于组合物中。在一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段以约20mg/mL的浓度存在于组合物中。在一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段以约30mg/mL的浓度存在于组合物中。在一些方面，4-1BBx OX40双特异性抗体或其抗原结合片段以约40mg/mL的浓度存在于组合物中。在一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段以约50mg/mL的浓度存在于组合物中。
向包含与谷氨酸盐、蔗糖和聚山梨酯-80一起配制的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物中添加氯化钠(NaCl)可对组合物具有去稳定作用并且可促进可导致蛋白质聚集的蛋白质-蛋白质相互作用。因此，在一些方面，本文所公开的药物组合物不含氯化钠(NaCl)。
在本文所公开的药物组合物的一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段具有约>90％的纯度。在一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段具有约>91％的纯度。在一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段具有约>92％的纯度。在一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段具有约>93％的纯度。在一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段具有约>94％的纯度。在一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段具有约>95％的纯度。
在一些方面，本文提供了药物组合物，该药物组合物包含：(a)浓度为约10mg/mL的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段；(b)约10mM谷氨酸盐；(c)约40mM亮氨酸；(d)约3％w/v蔗糖；以及(e)约0.02％聚山梨酯-80；其中所述组合物的pH为约4.3至约4.7。
在一些方面，本文提供了药物组合物，该药物组合物包含：(a)浓度为10mg/mL的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段；(b)10mM谷氨酸盐；(c)40mM亮氨酸；(d)3％w/v蔗糖；以及(e)0.02％聚山梨酯-80；其中所述组合物的pH为4.5。
一般来讲，此类组合物通常还可包含药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的”意指由政府管理机构批准或在美国药典或另一普遍认可的药典中列出以用于动物，特别是人类。此类药物载体包括但不限于：无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、甘油聚乙二醇蓖麻醇酸酯等。水或水溶液盐水和含水葡萄糖和甘油溶液可用作载体，特别是用于可注射溶液。
III.4-1BB x OX40双特异性抗体
本文提供了包含4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的新型药物组合物，所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含特异性结合人4-1BB的抗原结合结构域(即，人4-1BB抗原结合结构域)和结合人OX40的抗原结合结构域(即，人OX40抗原结合结构域)。本文所述的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段对于两种靶蛋白是二价的，即4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段含有两个4-1BB结合结构域和两个OX40结合结构域。这种4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段通过ADAPTIRTM技术来例示。示例性分子在本公开中通篇称为FXX01102。针对每个靶标为二价的双特异性抗体或其抗原结合片段包括但不限于：双重可变结构域抗体、IgG-scFv、scFv-Fc-scFv或含有二聚体的ADAPTIRTM抗体，其中二聚体的每个多肽含有两个不同的抗原结合结构域。在一些方面，本文所述的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段包含单链Fv(scFv)。在一些方面，本文所述的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段包含Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、二硫键连接的Fv或scFv-Fc。
A.4-1BB结合结构域
本文提供了结合人4-1BB的抗原结合结构域(即，4-1BB结合结构域)，其可用于组装4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段。除了与人4-1BB结合外，4-1BB结合结构域还可与来自其他物种的4-1BB(例如食蟹猴和/或小鼠4-1BB)结合。在一些方面，4-1BB结合结构域结合人4-1BB和食蟹猴4-1BB。
4-1BB结合结构域可包含六个互补决定区(CDR)，即可变重链(VH)CDR1、VH CDR2、VH CDR3、可变轻链(VL)CDR1、VL CDR2和VL CDR3。4-1BB结合结构域可包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)。VH和VL可以是分开的多肽或者可位于同一多肽上(例如，在scFv中)。
在一些方面，本文所述的4-1BB结合结构域包含表A中提供的六个CDR(例如，SEQID NO:1-6)的组合。
表A.4-1BB VH CDR氨基酸序列1
1CDR根据IMGT确定。
表B.4-1BB VL CDR氨基酸序列4
4CDR根据IMGT确定。
对于4-1BB为双价的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段可包含两个4-1BB结合结构域，每个结合结构域包含上面表A和表B中所列的六个CDR。
在本文所述的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的一些方面，4-1BB结合结构域包含表C中提供的VH序列。
表C：4-1BB可变重链(VH)氨基酸序列
本文所述的4-1BB结合结构域可包含VH，该VH包含表C中的VH序列的CDR，例如IMGT定义的CDR、Kabat定义的CDR、Chothia定义的CDR或AbM定义的CDR。
在本文所述的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的一些方面，4-1BB结合结构域包含表D中提供的VL序列。
表D：4-1BB可变轻链(VL)氨基酸序列
本文所述的4-1BB结合结构域可包含VL，该VL包含表D中的VL序列的CDR，例如IMGT定义的CDR、Kabat定义的CDR、Chothia定义的CDR或AbM定义的CDR。
在一些方面，本文所述的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段可包含两个4-1BB结合结构域，每个结合结构域包含表C中提供的VH和表D中提供的VL。表C中提供的VH和表D中提供的VL可位于不同多肽上或者可位于同一多肽上。当VH和VL位于同一多肽上时，它们可处于任一取向(即，VH-VL或VL-VH)，并且它们可通过接头(例如，甘氨酸-丝氨酸接头)连接。在一些方面，VH和VL连接长度为至少15个氨基酸(例如，15-50个氨基酸、15-40个氨基酸、15-30个氨基酸、15-25个氨基酸或15-20个氨基酸)的甘氨酸-丝氨酸接头。在一些方面，VH和VL连接长度为至少20个氨基酸(例如，20-50个氨基酸、20-40个氨基酸、20-30个氨基酸或20-25个氨基酸)的甘氨酸-丝氨酸接头。
在本文所述的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的一些方面，4-1BB结合结构域可包含VH和VL，所述VH包含表C中的VH序列的CDR，例如IMGT定义的CDR、Kabat定义的CDR、Chothia定义的CDR或AbM定义的CDR，所述VL包含表D中的VL序列的CDR，例如IMGT定义的CDR、Kabat定义的CDR、Chothia定义的CDR或AbM定义的CDR。
B.OX40结合结构域
本文提供了结合人OX40的抗原结合结构域(即，OX40结合结构域)，其可用于组装4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段。除了与人OX40结合之外，OX40结合结构域还可与来自其他物种的OX40(例如食蟹猴和/或小鼠OX40)结合。在一些方面，OX40结合结构域结合人OX40和食蟹猴OX40。
OX40结合结构域可包含六个互补决定区(CDR)，即可变重链(VH)CDR1、VH CDR2、VHCDR3、可变轻链(VL)CDR1、VL CDR2和VL CDR3。OX40结合结构域可包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)。VH和VL可以是分开的多肽或者可位于同一多肽上(例如，在scFv中)。
在一些方面，本文所述的OX40结合结构域包含表E和表F中列出的六个CDR。
表E.OX40 VH CDR氨基酸序列3
3CDR根据IMGT确定。
表F.OX40 VL CDR氨基酸序列4
4CDR根据IMGT确定。
对于OX40为二价的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段可包含两个OX40结合结构域，每个结合结构域包含上面表E和表F中所列的六个CDR。
在本文所述的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的一些方面，OX40结合结构域包含表G中提供的VH序列。
表G：OX40可变重链(VH)氨基酸序列
本文所述的OX40结合结构域可包含VH，该VH包含表G中的VH序列的CDR，例如IMGT定义的CDR、Kabat定义的CDR、Chothia定义的CDR。
在本文所述的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的一些方面，OX40结合结构域包含表H中提供的VL序列。
表H：OX40可变轻链(VL)氨基酸序列
本文所述的OX40结合结构域可包含VL，该VL包含表I中的VL序列的CDR，例如IMGT定义的CDR、Kabat定义的CDR、Chothia定义的CDR或AbM定义的CDR。
在一些方面，本文所述的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段可包含两个OX40结合结构域，每个结合结构域包含表G中提供的VH和表H中提供的VL。表G中提供的VH和表H中提供的VL可位于不同多肽上或者可位于同一多肽上。当VH和VL位于同一多肽上时，它们可处于任一取向(即，VH-VL或VL-VH)，并且它们可通过接头(例如，甘氨酸-丝氨酸接头)连接。在一些方面，VH和VL连接长度为至少15个氨基酸(例如，15-50个氨基酸、15-40个氨基酸、15-30个氨基酸、15-25个氨基酸或15-20个氨基酸)的甘氨酸-丝氨酸接头。在一些方面，VH和VL连接长度为至少20个氨基酸(例如，20-50个氨基酸、20-40个氨基酸、20-30个氨基酸或20-25个氨基酸)的甘氨酸-丝氨酸接头。
在本文所述的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的一些方面，OX40结合结构域可包含VH和VL，所述VH包含表G中的VH序列的CDR，例如IMGT定义的CDR、Kabat定义的CDR、Chothia定义的CDR或AbM定义的CDR，所述VL包含表H中的VL序列的CDR，例如IMGT定义的CDR、Kabat定义的CDR、Chothia定义的CDR或AbM定义的CDR。
C.4-1BB和/或OX40结合结构域
在4-1BB或OX40结合结构域中，VH CDR或VH和VL CDR或VL可以是分开的多肽或者可位于同一多肽上。当VH CDR或VH和VL CDR或VL位于同一多肽上时，它们可以是任一取向(即，VH-VL或VL-VH)。
当VH CDR或VH和VL CDR或VL位于同一多肽上时，它们可通过接头(例如，甘氨酸-丝氨酸接头)连接。VH可位于接头序列的N-末端，并且VL可位于接头序列的C-末端。另选地，VL可位于接头序列的N-末端，并且VH可位于接头序列的C-末端。
使用肽接头连接VH区和VL区是本领域众所周知的，并且在该特定领域中存在大量出版物。在一些方面，肽接头是由Gly-Gly-Gly-Gly-Ser氨基酸序列的三个重复序列((Gly4Ser)3)(SEQ ID NO:20)组成的15聚体。在一些方面，合适的接头可通过随机诱变优化简单接头(例如，(Gly4Ser)n)来获得，其中n＝1-5(SEQ ID NO:21)。
4-1BB和/或OX40结合结构域可以是人源化结合结构域。4-1BB和/或OX40结合结构域可以是大鼠结合结构域。4-1BB和/或OX40结合结构域可以是鼠结合结构域。在一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体包含人源化4-1BB结合结构域和大鼠OX40结合结构域。在一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体包含人源化4-1BB结合结构域和鼠OX40结合结构域。在一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体包含人源化4-1BB结合结构域和人源化OX40结合结构域。
在本文所述的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的一些方面，4-1BB和/或OX40结合结构域可以是scFv。在一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段中的所有4-1BB和OX40结合结构域是scFv。在一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段中的至少一个4-1BB或OX40结合结构域是scFv。在本文所述的4-1BB xOX40双特异性抗体或其抗原结合片段的一些方面，多肽包含4-1BB结合结构域(例如，scFv)和OX40结合结构域(例如，scFv)。
在本文所述的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的一些方面，4-1BBscFv含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在本文所述的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的一些方面，OX40 scFv含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
在一些方面，4-1BB和/或OX40结合结构域可包含位于分开的多肽链上的VH和VL。在一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段中的所有4-1BB和OX40结合结构域包含位于分开的多肽链上的VH和VL。在一些方面，4-1BB和/或OX40结合结构域可包含位于同一多肽链上的VH和VL。在一些方面，4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段中的所有4-1BB或OX40结合结构域包含位于同一多肽链上的VH和VL。
在本文所述的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的一些方面，4-1BBx OX40双特异性抗体或其抗原结合片段包含两种多肽，每种多肽从氨基末端到羧基末端依次包含第一抗原结合结构域、接头(例如，其中接头是铰链区)、免疫球蛋白恒定区和第二抗原结合结构域。该构型在本文中也称为ADAPTIRTM型式。示例性分子在本公开中通篇称为FXX01102。
在这种型式中，4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段包含两种多肽的二聚体，每种多肽从氨基末端到羧基末端依次包含第一scFv、铰链区、免疫球蛋白恒定区和第二scFv，其中(a)第一scFv包含人4-1BB抗原结合结构域，并且第二scFv包含人OX40抗原结合结构域，或者(b)第一scFv包含人OX40抗原结合结构域，并且第二scFv包含人4-1BB抗原结合结构域。
如本文所提供，包含本文所提供的CDR、VH、VL、scFv和/或铰链中的任一者的抗体或其抗原结合片段或多肽还可包含免疫球蛋白恒定区。与不具有恒定区的类似双特异性抗体相比，恒定区的存在延长了双特异性抗体的半衰期。免疫球蛋白恒定区可位于例如铰链与4-1BB结合结构域(例如，4-1BB结合scFv)之间。免疫球蛋白恒定区也可位于铰链与OX40结合结构域(例如，OX-40结合scFv)之间。在一些方面，多肽从氨基末端到羧基末端依次包含铰链区、免疫球蛋白恒定区和抗原结合结构域(例如，scFv)。
在一些方面，免疫球蛋白恒定区包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgD的免疫球蛋白CH2和CH3结构域，任选地其中IgG是人的。在一些情况下，免疫球蛋白恒定区包含IgG1(例如，人IgG1)的免疫球蛋白CH2和CH3结构域。在一些方面，多肽不含CH1结构域。
在一些方面，本文所述的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段含有分别为SEQ ID NO:1-3的4-1BB VH CDR1、CDR2和CDR3序列，分别为SEQ ID NO:4-6的4-1BB VLCDR1、CDR2和CDR3序列，分别为SEQ ID NO:7-9的OX40 VH CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别为SEQ ID NO:10-12的OX40 VL CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一些方面，人4-1BB结合结构域和人OX40结合结构域位于同一多肽上。在一些方面，人4-1BB结合结构域位于人OX40结合结构域的N-末端。在一些方面，人4-1BB结合结构域位于人OX40结合结构域的C-末端。在一些方面，免疫球蛋白恒定区包括IgG1的免疫球蛋白CH2和CH3结构域。
在一些方面，抗体不含CH1结构域。
在一些方面，根据EU编号系统，免疫球蛋白恒定区包括人IgG1CH2结构域，其包含E233P、L234A、L235A、G237A和K322A取代以及G236缺失。在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白恒定区与人4-1BB结合结构域之间和/或免疫球蛋白恒定区与人OX40结合结构域之间的接头。在一些方面，免疫球蛋白恒定区与人4-1BB结合结构域之间和/或免疫球蛋白恒定区与人OX40结合结构域之间的接头含有10-30个氨基酸、15-30个氨基酸或20-30个氨基酸。在一些方面，免疫球蛋白恒定区与人4-1BB结合结构域之间或免疫球蛋白恒定区与人OX40结合结构域之间的接头含有氨基酸序列(Gly4Ser)n，其中n＝1-5(SEQ IDNO:21)，任选地其中n＝1。
D.包含4-1BB和OX40结合结构域的组合物
在一些方面，本文所述的药物组合物包含4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含两种多肽的二聚体，每种多肽从氨基末端到羧基末端依次包含第一scFv、铰链区、免疫球蛋白恒定区和第二scFv，其中(a)第一scFv包含人4-1BB抗原结合结构域，并且第二scFv包含人OX40抗原结合结构域，或者(b)第一scFv包含人OX40抗原结合结构域，并且第二scFv包含人4-1BB抗原结合结构域。在一些方面，二聚体是同二聚体。
在一些方面，本文所述的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段含有SEQID NO:13的氨基酸序列。
本公开的一些方面提供了一种包含4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物，所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含人4-1BB抗原结合结构域和人OX40抗原结合结构域，其中：(a)4-1BB抗原结合结构域包含(i)含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH-CDR1；(ii)含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH-CDR2；(iii)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH-CDR3；(iv)含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)-CDR1；(v)含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL-CDR2；以及(vi)含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VL-CDR3；并且(b)OX40抗原结合结构域包含(i)含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH-CDR1；(ii)含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VH-CDR2；(iii)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH-CDR3；(iv)含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL-CDR1；(v)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VL-CDR2；以及(vi)含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL-CDR3。
本公开的一些方面提供了一种包含4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物，所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含人4-1BB抗原结合结构域和人OX40抗原结合结构域，其中：(a)4-1BB抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区；并且(b)OX40抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区。
本公开的一些方面提供了一种包含4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物，所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含人4-1BB抗原结合结构域和人OX40抗原结合结构域，其中：(a)4-1BB抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的scFv；并且(b)OX40抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的scFv。
本公开的一些方面提供了一种包含4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物，所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含人4-1BB抗原结合结构域和人OX40抗原结合结构域，并且含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
本公开的一些方面提供了一种药物组合物，该药物组合物包含：(a)10-50mg/mL的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：(i)4-1BB抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH-CDR1；含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH-CDR2；含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH-CDR3；含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)-CDR1；含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL-CDR2；以及含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VL-CDR3；以及OX40抗原结合结构域，其包含含有SEQ IDNO:7的氨基酸序列的VH-CDR1；含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VH-CDR2；含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH-CDR3；含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL-CDR1；含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VL-CDR2；以及含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL-CDR3；(ii)4-1BB抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区；以及OX40抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区；(iii)4-1BB抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的scFv；以及OX40抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的scFv；或者(iv)SEQ ID NO:13的氨基酸序列；(b)约5mM至约15mM谷氨酸盐；(c)约25mM至约50mM亮氨酸；(d)约2％至约8％w/v蔗糖；以及(e)约0.01％至约-0.03％聚山梨酯-80；其中所述组合物的pH为约4.3至约4.7。
本公开的一些方面提供了一种药物组合物，该药物组合物包含：(a)10mg/mL的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段；其中该抗体或其抗原结合片段包含：(i)4-1BB抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH-CDR1；含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH-CDR2；含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH-CDR3；含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)-CDR1；含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL-CDR2；以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL-CDR3；以及(ii)OX40抗原结合结构域，其包含含有SEQID NO:7的氨基酸序列的VH-CDR1；含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VH-CDR2；含有SEQ IDNO:9的氨基酸序列的VH-CDR3；含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL-CDR1；含有SEQ IDNO:11的氨基酸序列的VL-CDR2；以及含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL-CDR3；(b)10mM谷氨酸盐；(c)40mM亮氨酸；(d)3％w/v蔗糖；以及(e)0.02％聚山梨酯-80；其中所述组合物的pH为4.5。
在一些方面，所述药物组合物包含(a)4-1BB抗原结合结构域，其包含含有SEQ IDNO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区；并且(b)OX40抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO:18的氨基酸序列的轻链可变区。
IV.方法和用途
本公开提供了包含结合4-1BB和/或OX40的抗体或其抗原结合片段的药物组合物，该组合物可用于多种应用，包括但不限于治疗性治疗方法，诸如癌症的治疗。在一些方面，药物组合物可用于抑制肿瘤生长和/或减小肿瘤体积。使用方法可以是体外或体内方法。本文所述的药物组合物可包括任何所公开的抗体或其抗原结合片段用于治疗的用途。
本公开提供了治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含(a)特异性结合4-1BB和OX40的双特异性抗体或其抗原结合片段；(b)约5mM至约15mM的稳定性促进缓冲液；(c)约25mM至约50mM的稳定氨基酸；(d)约2％至约8％w/v的糖；以及(e)约0.01％至约0.03％的表面活性剂。
在一些方面，癌症是包括但不限于黑素瘤、肾癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌/肠癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、脑癌和血液癌症的癌症。癌症可以是原发性肿瘤或者可以是晚期或转移性癌症。在一些方面，癌症是实体瘤。例如，本公开包括双特异性抗体用于治疗肉瘤、癌和淋巴瘤的用途。本公开提供了通过向受试者施用治疗有效量的本文所述的药物组合物来治疗患有肉瘤、癌或淋巴瘤的人类受试者的方法。
在一些方面，本公开提供了用含有肿瘤浸润性淋巴细胞的肿瘤或癌组织治疗人类受试者的方法。本公开提供了用含有表达4-1BB和OX40的淋巴细胞的肿瘤治疗人类受试者。在一些方面，本公开提供了向患有实体瘤的人类受试者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含(a)特异性结合4-1BB和OX40的双特异性抗体或其抗原结合片段；(b)约5mM至约15mM的稳定性促进缓冲液；(c)约25mM至约50mM的稳定氨基酸；(d)约2％至约8％w/v的糖；以及(e)约0.01％至约-0.03％的表面活性剂。
本公开的一些方面提供了增强受试者的免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的包含4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
本公开的一些方面提供了在受试者中激动T细胞共刺激途径的方法，该方法包括向受试者施用如本文所公开的包含4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
本公开的一些方面提供了增加受试者中NK细胞和/或T细胞(例如，CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)的增殖的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的包含4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
本公开的一些方面提供了通过向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的包含4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物来增加受试者体内肿瘤浸润性淋巴细胞数量的方法。
本公开的一些方面提供了通过向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的包含4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物来增加受试者体内肿瘤浸润性淋巴细胞的粒酶表达的方法。
在一些方面，受试者是人。
在一些方面，本文提供了用作药物的包含4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在一些方面，本文提供了用于治疗癌症的方法中的包含4-1BB xOX40双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物
V.试剂盒和容器
本公开还提供了包含本文描述和例示的任何药物制剂的容器。
在一些方面，本公开提供了试剂盒，该试剂盒包括本文描述和例示的任何药物制剂和/或双特异性抗体或其抗原结合片段。试剂盒可用于提供药物制剂、抗体、其抗原结合片段以及用于诊断、基础研究或治疗方法等的其他试剂。在一些方面，试剂盒包括本文描述和例示的任一种或多种药物制剂、抗体或其抗原结合片段和/或双特异性抗体，以及在治疗受试者的癌症的方法中使用一种或多种药物制剂、抗体或其抗原结合片段的说明书。在一些方面，试剂盒包括本文描述和例示的任一种或多种药物制剂、抗体或其抗原结合片段和/或双特异性抗体，以及使用一种或多种药物制剂、抗体或其抗原结合片段用于治疗实体瘤癌症的说明书。
实施例
应当理解，本文所述的实施例仅用于例示目的，并且将向本领域技术人员建议其各种修改或改变，这些修改或改变包括在本申请的实质和范围内。
实施例1.使用不同的赋形剂稳定蛋白质以使聚集和/或降解最小化。
不同的组分和赋形剂可基于它们的化学特性结合、相互作用和/或稳定蛋白质的不同区域。因此，筛选多种不同类型的赋形剂以确定它们对蛋白质制剂(诸如下表1中所列的子集)的影响是有用的。
不同制剂的影响可以多种方式测量。一种方法是将配制的蛋白质储存在不同的温度下，包括药物在制造后的潜在储存条件(“预期储存条件”)以及加速储存条件(高于预期储存条件的温度)。当进行储存稳定性实验时，在不同的时间点取出样品并通过不同的技术进行分析，诸如分析型尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)。使用SE-HPLC测量纯度随时间的变化可用于评估不同制剂是否抑制或促进聚集或降解。分析型阳离子交换色谱法(CEX-HPLC)和/或毛细管等电聚焦(cIEF)可用于监测蛋白质的电荷变体谱的变化，以确定不同制剂条件是否抑制或促进蛋白质结构的电荷相关变化。
除了使用储存稳定性实验评价不同制剂之外，还可使用其他方法表征对蛋白质稳定性的生物物理影响。例如，使用差示扫描荧光测定法(DSF)或差示扫描量热法(DSC)测定熔点(TM，热熔融转变的中点)可有助于评估不同制剂是使蛋白质的热稳定性稳定(升高TM)还是去稳定(降低TM)。可用于评估制剂的稳定效果的另一种生物物理方法是测定B22、颗粒相互作用参数或第二维里系数。使用在给定制剂中不同蛋白浓度下的光散射测量，线的斜率可用于确定溶液是有益的(增加，正斜率)还是不利的(降低，负斜率)。在266nm处的动态光散射(DLS)监测也可用于测定聚集温度(Tagg)，其也可用于对比不同的制剂。
表1：可包含在蛋白质制剂中的组分的实施例
组分 分类
亮氨酸 氨基酸-疏水性
谷氨酸 氨基酸-带负电荷
甘氨酸 氨基酸中性
精氨酸 氨基酸-带正电荷
组氨酸 氨基酸-带正电荷
赖氨酸 氨基酸-带正电荷
甲硫氨酸 氨基酸-抗氧化剂
抗坏血酸 抗氧化剂
甘油 增容剂
EDTA 螯合剂
氯化钠 盐
氯化钙 盐
氯化镁 盐
氯化钾 盐
甘露糖醇 糖
山梨糖醇 糖
蔗糖 糖
聚山梨酯-80 洗涤剂
实施例2.不同缓冲液、pH和蔗糖浓度的评价
FXX01102双特异性蛋白质由CHO细胞在生物反应器中表达，并使用柱色谱法纯化至接近均质(>95％纯度，通过SE-HPLC)。将其浓缩，更换缓冲液，并配制成如下表2所示的一系列不同组合物。所有缓冲液以10mM使用，并且每种溶液中FXX01102蛋白浓度为10mg/mL。本研究的目的是确定不同缓冲液、pH和蔗糖浓度对FXX01102双特异性抗体稳定性的影响。使用Uncle仪器(Unchained Labs)测定作为温度(Tagg)和Tm(熔融曲线的中点)的函数的聚集开始。经由266nm处的光散射测量作为温度增加的函数来测量Tagg。
样品组的Tm值对比表明，pH、缓冲液和蔗糖浓度对第一结构域的去折叠(Tm1)没有很大影响，因为这些值都落在约61-62℃内(数据未示出)。然而，266nm处的动态光散射(DLS)数据的对比显示样品中不溶性微粒的形成差异(图1A和图1B)。蔗糖浓度相对于缓冲液和pH的影响引起的变化较小，因此对于琥珀酸盐、组氨酸和柠檬酸盐以及8％w/v谷氨酸盐缓冲液仅绘制了2％w/v蔗糖数据。如图1A所示，pH 5.8和6.6的两种柠檬酸盐缓冲液具有非常相似的Tagg曲线，其中pH 6.6迹线向稍高的温度偏移，反映出FXX01102的更稳定的溶液条件。柠檬酸盐的Tagg数据表明，在所测试的缓冲液中，它是稳定性促进能力最低的缓冲液，其次是琥珀酸盐。pH 5.2的低pH琥珀酸盐制剂提供了比pH 6.0溶液更高的Tagg值。组氨酸和谷氨酸盐缓冲液都显示出光散射的极小增加，并且被鉴定为该组中的优选制剂。His和Glu缓冲液的图(图1B)示出谷氨酸盐在所评价的那些缓冲液中具有最低的光散射信号。组氨酸制剂显示出与琥珀酸盐制剂相同的趋势，较低的pH 5.8制剂对比高的pH 6.2溶液表现更好。由于相似的pH值与不同的缓冲剂一起使用，因此Tagg的差异不是单独的pH的结果，而可能是pH和缓冲液的电荷特征的组合。部分地基于这些结果，谷氨酸成为后续实验中的主要缓冲剂。
表2.评价对Tm和Tagg的影响的缓冲液
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实施例3.NaCl对低pH制剂的影响的评价
将FXX01102双特异性蛋白质浓缩并更换成pH 4.5的10mM谷氨酸盐、8％重量/体积蔗糖和0.02％重量/体积聚山梨酯-80的溶液，最终蛋白浓度为8mg/mL，其中含或不含100mM氯化钠(NaCl)。在0、2、4、6和8mg/mL的蛋白浓度下生成系列稀释液。在由UnchainedLaboratories制造的“Uncle”仪器上分析这些溶液。目标是确定氯化钠的添加是否改善了谷氨酸盐/蔗糖/聚山梨酯-80制剂的稳定特性。检测这两种溶液的B22，并且显而易见的是，向制剂中添加NaCl引起斜率的显著降低，等同于去稳定作用并且促进可能导致聚集的蛋白质-蛋白质相互作用(图2)。因此，在这些研究中未进一步评价氯化钠。
实施例4.精氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和甘氨酸对FXX01102制剂的B22值的影响的评价
还研究了氨基酸甲硫氨酸、精氨酸和甘氨酸对FXX01102产生的稳定特性。在pH4.5的10mM谷氨酸盐、4％w/v蔗糖中制备FXX01102的10mg/mL溶液，不含另外的赋形剂，含有100mM精氨酸、50mM甲硫氨酸或50mM甘氨酸。在Uncle上分析0、2、4、6、8和10mg/mL的系列稀释液以检测对B22的影响。B22斜率的对比(图3)表明，与精氨酸相比，甘氨酸和甲硫氨酸似乎都增加了B22斜率值，而与未添加另外的氨基酸的制剂相比，精氨酸降低了斜率。这表明与添加盐或其他带电荷的氨基酸相比，不带电荷的或更疏水的氨基酸可能对FXX01102的稳定性具有更有益的作用。
为了进一步研究疏水性氨基酸对FXX01102稳定性的影响，对比含有或不含25mM亮氨酸的制剂的B22斜率。检测在含有或不含亮氨酸的pH 4.5的10mM谷氨酸盐、4％w/v蔗糖中的FXX01102系列稀释液。含亮氨酸制剂的斜率略高于不含亮氨酸的蛋白质溶液的斜率，表明亮氨酸可以对蛋白质发挥稳定作用并降低自身相互作用特性(图4)。
实施例5.硫酸镁、赖氨酸和亮氨酸对FXX01102制剂的聚集温度(Tagg)的影响的评价
对于制剂的子集，使用Uncle仪器(Unchained Labs)测定作为温度的函数的聚集起始(Tagg)。经由266nm处的光散射测量作为温度增加的函数来测量Tagg。10mM谷氨酸盐、4％w/v蔗糖中的FXX01102，pH 4.5，含有25mM亮氨酸、MgSO4和赖氨酸。266nm处的散射对比温度图的对比显示，与不含其他赋形剂的制剂相比，MgSO4和赖氨酸在低得多的温度下引起散射增加(图5)。含有亮氨酸的样品在所评价的整个温度范围内未显示出散射的任何增加。这表明当配制FXX01102时，用亮氨酸获得的B22的改善(描述于先前的实施例中)可能转化为对聚集的抗性增加。
实施例6.-20℃下FXX01102制剂的稳定性评价
进行实验以评价FXX01102在-20℃储存时的稳定性。下面表3中所示的所有制剂含有作为缓冲剂的10mM谷氨酸盐和0.02％聚山梨酯。此外，所有制剂含有糖组分，即3％或8％w/v蔗糖、3％海藻糖或3％山梨糖醇。基于先前的数据，研究了Leu、Met或Gly氨基酸的添加是否改善FXX01102的稳定性。具有改善稳定性的制剂应显示出较少的聚集体形成，如通过尺寸排阻超高压液相色谱法(SE-UPLC)所测量。
使用两个色谱柱从澄清的生物反应器上清液中纯化FXX01102以实现>95％的起始纯度。使用UF/DF系统和至少10倍体积的缓冲液将该物质的缓冲液更换成谷氨酸盐并浓缩至10mg/mL。在制备不同制剂后，在0.5mL Sarstedt小瓶中制备200μL等分试样。在研究开始时测定pH。大多数样品具有约4.6的pH。使用SE-UPLC测定初始高分子量含量％(HMW％)。然后将小瓶置于-20℃并在储存3周、6周、3个月、6个月和7个月(对于制剂的子集)后测量。在适当的时间范围内，将小瓶从冷冻器中取出并分析。制备较大的3.75mL等分试样并进行三次冷冻/解冻(3x F/T)循环。这用作附加影响因素试验以对比不同制剂。该数据汇总于下面的表3中。在评价3个月数据之后，在6个月和7个月时仅分析样品子集以集中于感兴趣的特定制剂。
将含山梨糖醇和海藻糖的制剂(ID#5、6)与集合中其他制剂进行对比，结果表明它们有助于聚集体形成。基于3x F/T样品的HMW％、3个月和6个月时间点，这两种制剂是所分析的性能最差的条件。因此，蔗糖被确定为优选的糖组分。3％和8％蔗糖(分别为ID#2和#3)的聚集体数据表明，较高浓度的蔗糖对于长期储存没有显著的有益效果，因为这些制剂在3个月和6个月时的HMW％非常相似。然而，观察到在较高蔗糖浓度(6.3％对比8.8％)的3x F/T后存在较少的聚集体。
基于以上进行的B22分析，预测Met、Gly和Leu将对FXX01102的储存稳定性具有积极影响。分析每种氨基酸的三种浓度对-20℃稳定性的影响。对于每一种，浓度增加导致随时间形成的聚集体减少。对于Met(ID#10、11、12)、Gly(ID#13、14、15)和Leu(ID#7、8、9)，作为所添加的氨基酸赋形剂的浓度的函数，随时间推移存在HMW％降低的明显趋势。亮氨酸似乎具有最大的稳定影响，因为制剂ID#9在3x F/T分析中和随时间推移具有最低的聚集体形成。还研究了包含氨基酸组合的制剂(ID#16、17、18)，结果表明该方法具有一定有益效果。然而，组合的HMW％与仅含有相等浓度的Leu的制剂的对比(即，#16对比#8，或#18对比#8)表明Leu是该作用的主要驱动因素。测定ID#7、8和9的Tm和Tagg值，以观察从10mM增加至40mM的亮氨酸浓度是否对这两个参数中的任一个具有很大影响。差异相对较小，所有三种缓冲液的Tm为61℃，并且在266nm处测定的光散射无显著变化。
表3.评价在-20℃储存后对HMW％的影响的缓冲液。NT＝“未测试”
实施例7.评价-20℃下FXX01102的其他谷氨酸盐制剂
进行实验以评价FXX01102在-20℃储存时的稳定性。下面表4中所示的所有制剂含有5mM谷氨酸盐作为缓冲剂。此外，所有制剂含有糖组分，即0％、2％、3％或8％w/v蔗糖。基于先前的数据，我们进一步研究了Leu浓度的变化以及pH对FXX01102稳定性的影响。以与实施例6中所述相同的方式进行。具有改善稳定性的制剂应显示出较少的聚集体形成，如通过尺寸排阻超高压液相色谱法(SE-UPLC)所测量。分析数据的初始时间点和6周时间点之间的HMW％差异以及3x F/T影响因素试验。数据显示，较低的pH值和较高的亮氨酸浓度抑制随时间推移以及在多次冻融循环期间的聚集体形成。在制剂中包含蔗糖在作为缓冲剂的10mM谷氨酸盐和0.02％聚山梨酯下具有积极作用。此外，所有制剂含有糖组分，即3％或8％w/v蔗糖、3％海藻糖或3％山梨糖醇。基于先前的数据，我们还研究了Leu、Met或Gly氨基酸的添加，而不存在蔗糖导致比其他制剂更高的HMW％(制剂#6，表4)。类似于先前的实验，较高水平的蔗糖在6周时对储存稳定性数据具有标称影响，但在3X F/T期间对抑制聚集体形成具有较大影响。
表4.评价在-20℃储存后对HMW％的影响的缓冲液
***
本发明的范围不限于本文所述的具体方面。实际上，根据前面的描述和附图，除了所描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。
本文引用的所有参考文献(例如，出版物或专利或专利申请)全文以引用方式并入本文并且用于所有目的，其程度如同每个单独的参考文献(例如，出版物或专利或专利申请)被具体地和单独地指出全文以引用方式并入以用于所有目的一样。
其他方面在以下权利要求书的范围内。
序列
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序列表
<110> 阿帕特夫研究和发展有限公司(Aptevo Research and Development LLC)
<120> 包含4-1BB和OX40结合蛋白的组合物及其使用方法
<130> 4897.006PC01
<150> US 63/150,475
<151> 2021-02-17
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
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20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Phe Ser Asp Gly Tyr Tyr Ala Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
145 150 155 160
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Asn Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala
180 185 190
Ser Arg Arg His Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
210 215 220
Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Asn Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr
245 250 255
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val
260 265 270
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
275 280 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
305 310 315 320
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
325 330 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
340 345 350
Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
355 360 365
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
370 375 380
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435 440 445
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly
465 470 475 480
Gly Ser Pro Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val
485 490 495
Ala Pro Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly
500 505 510
Ser Lys Ser Val Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val
515 520 525
Leu Val Val Tyr Asp Asp Ser Gly Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg
530 535 540
Phe Ser Gly Ser Thr Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg
545 550 555 560
Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser
565 570 575
Ser Ser Asp His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
580 585 590
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
595 600 605
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val
610 615 620
Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
625 630 635 640
Leu Ser Tyr Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
645 650 655
Leu Glu Trp Val Ala Ala Ile Ser His Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr
660 665 670
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
675 680 685
Asn Arg Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
690 695 700
Val Tyr Tyr Cys Ser Asn Asp Gln Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr
705 710 715 720
Leu Val Thr Val Ser Ser Arg
725
<210> 14
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 4-1BB可变重链氨基酸序列
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Phe Ser Asp Gly Tyr Tyr Ala Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 4-1BB可变轻链
<400> 15
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Arg Arg His Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Asn Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 16
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> scFv
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Phe Ser Asp Gly Tyr Tyr Ala Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
145 150 155 160
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Asn Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala
180 185 190
Ser Arg Arg His Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
210 215 220
Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Asn Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 17
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> OX40可变重链
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Tyr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser His Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Arg Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Asn Asp Gln Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 18
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 可变轻链
<400> 18
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Gly Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 19
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> OX40 scFv
<400> 19
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Gly Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Tyr Tyr
145 150 155 160
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ala Ala Ile Ser His Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Arg Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ser Asn Asp Gln Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Arg
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头
<400> 20
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 21
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> 其中序列可重复1至5次
<400> 21
Gly Gly Gly Gly Ser
1

Claims (65)

1.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)特异性结合4-1BB和OX40的双特异性抗体或其抗原结合片段；
(b)约5mM至约15mM的稳定性促进缓冲液；
(c)约25mM至约50mM的稳定氨基酸；
(d)约2％至约8％w/v的糖；以及
(e)约0.01％至约-0.03％的表面活性剂。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述稳定性促进缓冲液选自由琥珀酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和谷氨酸盐组成的组。
3.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述稳定性促进缓冲液以约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM或约15mM的浓度存在于所述组合物中。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其中所述稳定性促进缓冲液是谷氨酸盐。
5.如权利要求2至4中任一项所述的药物组合物，其中所述谷氨酸盐以约5mM的浓度存在于所述组合物中。
6.如权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其中所述稳定氨基酸选自由精氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和甘氨酸组成的组。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述稳定氨基酸以约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM、约31mM、约32mM、约33mM、约34mM、约35mM、约36mM、约37mM、约38mM、约39mM、约40mM、约41mM、约42mM、约43mM、约44mM、约45mM、约46mM、约47mM、约48mM、约49mM或约50mM的浓度存在于所述组合物中。
8.如权利要求6或7所述的药物组合物，其中所述稳定氨基酸是亮氨酸。
9.如权利要求6至8中任一项所述的药物组合物，其中所述亮氨酸以约40mM的浓度存在于所述组合物中。
10.如权利要求1至9中任一项所述的药物组合物，其中所述糖选自由以下项组成的组：蔗糖、海藻糖和山梨糖醇。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述糖以约2％w/v至约8％w/v的浓度存在于所述组合物中。
12.如权利要求10或11中任一项所述的药物组合物，其中所述糖以约2％w/v、约3％w/v、约4％w/v、约5％w/v、约6％w/v、约7％w/v或约8％w/v的浓度存在于所述组合物中。
13.如权利要求10至12中任一项所述的药物组合物，其中所述糖是蔗糖。
14.如权利要求11至13中任一项所述的药物组合物，其中所述蔗糖以约3％w/v的浓度存在于所述组合物中。
15.如权利要求1至14中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物还包含表面活性剂。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其中所述表面活性剂是聚山梨酯-80。
17.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述聚山梨酯-80以约0.01％w/v至约0.03％w/v的浓度存在于所述组合物中。
18.如权利要求6或17所述的药物组合物，其中所述聚山梨酯-80以约3％w/v的浓度存在于所述组合物中。
19.如权利要求1至18中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物的pH在约4.3至约4.7的范围内。
20.如权利要求1至19中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物的pH为约4.5。
21.如权利要求1至20中任一项所述的药物组合物，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段以约10mg/mL至约50mg/mL的浓度存在于所述组合物中。
22.如权利要求1至21中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物不含氯化钠(NaCl)。
23.如权利要求1至22中任一项所述的药物组合物，其中所述4双特异性抗体或其抗原结合片段具有约>90％的纯度。
24.如权利要求1至23中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)浓度为约10mg/mL的所述4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段；
(b)约10mM谷氨酸盐；
(c)约40mM亮氨酸；
(d)约3％w/v蔗糖；以及
(e)约0.02％聚山梨酯-80
其中所述组合物的pH为约4.3至约4.7。
25.如权利要求1至24中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)浓度为10mg/mL的所述4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段；
(b)10mM谷氨酸盐；
(c)40mM亮氨酸；
(d)3％w/v蔗糖；以及
(e)0.02％聚山梨酯-80；
其中所述组合物的pH为4.5。
26.如权利要求1至25中任一项所述的药物组合物，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含单链Fv(scFv)。
27.如权利要求1至26中任一项所述的药物组合物，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、二硫键连接的Fv或scFv-Fc。
28.如权利要求1至27中任一项所述的药物组合物，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含人4-1BB抗原结合结构域和人OX40抗原结合结构域，其中：
(a)所述4-1BB抗原结合结构域包含(i)含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH-CDR1；(ii)含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH-CDR2；(iii)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH-CDR3；(iv)含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)-CDR1；(v)含有SEQID NO:5的氨基酸序列的VL-CDR2；以及(vi)含有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的VL-CDR3；以及
(b)所述OX40抗原结合结构域包含(i)含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH-CDR1；(ii)含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VH-CDR2；(iii)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH-CDR3；(iv)含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL-CDR1；(v)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VL-CDR2；以及(vi)含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL-CDR3。
29.如权利要求1至28中任一项所述的药物组合物，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含人4-1BB抗原结合结构域和人OX40抗原结合结构域，其中：
(a)所述4-1BB抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区；并且
(b)所述OX40抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区。
30.如权利要求1至29中任一项所述的药物组合物，其中所述4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段包含人4-1BB抗原结合结构域和人OX40抗原结合结构域，其中：
(a)所述4-1BB抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的scFv；并且
(b)所述OX40抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的scFv。
31.如权利要求1至30中任一项所述的药物组合物，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
32.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)10mg/mL的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(i)4-1BB抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH-CDR1；含有SEQID NO:2的氨基酸序列的VH-CDR2；含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH-CDR3；含有SEQ IDNO:4的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)-CDR1；含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL-CDR2；以及含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VL-CDR3；以及
OX40抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH-CDR1；含有SEQ IDNO:8的氨基酸序列的VH-CDR2；含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH-CDR3；含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL-CDR1；含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VL-CDR2；以及含有SEQ IDNO:12的氨基酸序列的VL-CDR3；
(ii)4-1BB抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区；以及
OX40抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区；
(iii)4-1BB抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的scFv；以及OX40抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的scFv；或者
(iv)SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
(b)约5mM至约15mM谷氨酸盐；
(c)约25mM至约50mM亮氨酸；
(d)约2％至约8％w/v蔗糖；以及
(e)约0.01％至约-0.03％聚山梨酯-80；
其中所述组合物的pH为约4.3至约4.7。
33.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)10mg/mL的4-1BB x OX40双特异性抗体或其抗原结合片段；其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(i)4-1BB抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH-CDR1；含有SEQID NO:2的氨基酸序列的VH-CDR2；含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH-CDR3；含有SEQ IDNO:4的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)-CDR1；含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL-CDR2；以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL-CDR3；以及
(ii)OX40抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH-CDR1；含有SEQID NO:8的氨基酸序列的VH-CDR2；含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH-CDR3；含有SEQ IDNO:10的氨基酸序列的VL-CDR1；含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VL-CDR2；以及含有SEQID NO:12的氨基酸序列的VL-CDR3；
(b)10mM谷氨酸盐；
(c)40mM亮氨酸；
(d)3％w/v蔗糖；以及
(e)0.02％聚山梨酯-80；
其中所述组合物的pH为4.5。
34.如权利要求33所述的药物组合物，其中
(a)所述4-1BB抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区；并且
(b)所述OX40抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区。
35.如权利要求1至34中任一项所述的药物组合物，其中所述药物制剂是液体。
36.如权利要求28至30和32至35中任一项所述的药物组合物，其中所述人4-1BB结合结构域和所述人OX40结合结构域位于同一多肽上。
37.如权利要求36所述的药物组合物，其中所述人4-1BB结合结构域位于所述人OX40结合结构域的N-末端。
38.如权利要求36所述的药物组合物，其中所述人4-1BB结合结构域位于所述人OX40结合结构域的C-末端。
39.如权利要求1至30和32至38中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白恒定区。
40.如权利要求39所述的药物组合物，其中所述免疫球蛋白恒定区包含IgG1的免疫球蛋白CH2和CH3结构域。
41.如权利要求1至40中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体不含CH1结构域。
42.如权利要求39至41中任一项所述的药物组合物，其中所述免疫球蛋白恒定区包含人IgG1 CH2结构域，所述结构域包含根据EU编号系统的E233P、L234A、L235A、G237A和K322A取代以及G236缺失。
43.如权利要求28至30和32至42中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白恒定区与所述人4-1BB结合结构域之间和/或免疫球蛋白恒定区与所述人OX40结合结构域之间的接头。
44.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述免疫球蛋白恒定区与所述人4-1BB结合结构域之间和/或所述免疫球蛋白恒定区与所述人OX40结合结构域之间的所述接头包含10-30个氨基酸、15-30个氨基酸或20-30个氨基酸。
45.如权利要求44所述的药物组合物，其中所述免疫球蛋白恒定区与所述人4-1BB结合结构域之间或所述免疫球蛋白恒定区与所述人OX40结合结构域之间的所述接头含有氨基酸序列(Gly4Ser)n，其中n＝1-5(SEQ ID NO:21)，任选地其中n＝1。
46.如权利要求28至45中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体包含两种多肽的二聚体，每种多肽从氨基末端到羧基末端依次包含第一scFv、铰链区、免疫球蛋白恒定区和第二scFv，其中(a)所述第一scFv包含人4-1BB抗原结合结构域，并且所述第二scFv包含人OX40抗原结合结构域，或者(b)所述第一scFv包含人OX40抗原结合结构域，并且所述第二scFv包含人4-1BB抗原结合结构域。
47.如权利要求46所述的药物组合物，其中所述二聚体是同二聚体。
48.如权利要求1至47中任一项所述的药物组合物，其中所述药物制剂可储存于-20℃下。
49.如权利要求1至48中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物在-20℃下储存后，在约3周、约6周、约3个月、约6个月和约7个月后，pH没有显著变化。
50.如权利要求1至49中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物在-20℃下储存后，在约3周、约6周、约3个月、约6个月或约7个月后，高分子量含量百分比(HMW％)没有显著变化。
51.如权利要求1至50中任一项所述的药物组合物，其中在-20℃下储存后，在约3周、约6周、约3个月、约6个月或约7个月后，所述HMW％的变化小于5％。
52.如权利要求1至51中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物在一个、两个或三个冷冻/解冻循环后，所述HMW％没有显著变化。
53.如权利要求1至52中任一项所述的药物组合物，其中在一个、两个或三个冷冻/解冻循环后，所述HMW％的变化小于5％。
54.如权利要求50至53中任一项所述的药物组合物，其中所述HMW％通过尺寸排阻超高压液相色谱法(SE-UPLC)来测量。
55.如权利要求1至54中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物在-20℃下储存后，在约3周、约6周、约3个月、约6个月或约7个月后，聚集体形成没有显著变化，如通过尺寸排阻超高压液相色谱法(SE-UPLC)所测量。
56.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1至55中任一项所述的药物组合物。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述癌症是实体瘤癌症。
58.如权利要求56或57所述的方法，其中所述癌症是肉瘤、癌或淋巴瘤。
59.如权利要求56至58中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由黑素瘤、肾癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌/肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、脑癌或血液癌症组成的组。
60.如权利要求56至59中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
61.如权利要求56至60中任一项所述的方法，其中所述受试者在肿瘤浸润性淋巴细胞上表达4-1BB和OX40。
62.如权利要求1至61中任一项所述的药物组合物用于治疗癌症的用途。
63.如权利要求1至62中任一项所述的药物组合物用于治疗实体瘤癌症的用途。
64.用于如权利要求63所述的用途的抗体药物组合物，其中所述实体瘤癌症是肉瘤、癌或淋巴瘤。
65.用于如权利要求64所述的用途的药物组合物，其中所述癌症选自由黑素瘤、肾癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌/肠癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、脑癌或血液癌症组成的组。
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