KR101497045B1 - 난소 암종의 방사성면역요법을 위한 인간 항-엽산염 수용체알파 항체와 항체 단편 - Google Patents

Abstract

엽산염 수용체-알파(folate receptor-alpha, FRα)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 가변 영역이 아래의 아미노산 서열 중에서 최소한 하나를 포함하는 경쇄를 포함하고:

- RASESVSFLGINLIH (SEQ ID NO: 3),

- QASNKDT (SEQ ID NO: 4),

- LQSKNFPPYT (SEQ ID NO: 5),

여기서, 경쇄의 불변 영역은 카파 불변 영역이다.

엽산염 수용체-알파(FRα)

Description

난소 암종의 방사성면역요법을 위한 인간 항-엽산염 수용체 알파 항체와 항체 단편{Human anti-folate receptor alpha antibodies and antibody fragments for the radioimmunotherapy of ovarian carcinoma}

본 발명은 인간 엽산염 수용체 알파(folate receptor-alpha, FRα)에 특이적인 높은 친화성 인간 항체와 항체 단편, 특히 Fab 단편에 관계한다. 본 발명은 또한, 이들 항체와 단편을 생산하는 방법 및 치료적 환경(therapeutic setting)과 진단적 환경(diagnostic setting), 예를 들면, 특히 난소 암에서 방사성면역요법에서 이들의 용도에 관계한다. 본 발명은 또한, 이들 항체와 단편을 함유하는 제약학적 조성물에 관계한다.

상피 난소 암(epithelial ovarian cancer, EOC)은 선진국과 유럽에서 가장 치명적인 부인과 악성(gynaecological malignancy)이다. 상대적으로 낮은 발병률(incidence)(매년 대략 1/100,000 새로운 사례)에도 불구하고, EOC는 높은 치명률(case-fatality ratio)을 나타내고, 5년 생존 기간(whole survival)이 대략 44%에 불과하다(1,2). 종양이 장기에 한정된 여성은 우수한 예후(prognosis)를 나타내지만, 대부분의 초기 단계 암은 무증상(asymptomatic)이고, 2/3 이상의 환자는 진전된 질환(advanced disease)로 진단된다. 일반적으로, 초기 단계 EOC는 무증상이 고, 대부분의 여성(70-75%)은 진전된 질환을 나타내는데, 이는 종종, 확산된 소형-부피 종양 침착물(diffuse small-volume tumour deposit)로서 전개된다. 최초 수술은 조직학적 확정(histological confirmation), 단계 확인(staging)과 종양 제거(tumour debulking)를 위한 의심되는 난소 암의 관리에서 거의 필수적이다. 주로 초기-단계 질환에서 달성되는, 진단 시점에서 효과적인 암세포축소 수술(cytoreductive surgery)은 향상된 생존과 상관하였다. 하지만, 조기 진단에서 어려움과 확산성 소형-부피 질환(diffuse small-volume disease)에 대한 성향(propensity)으로 인하여, 상당수의 EOC 환자는 잔류암(residual disease)을 제거하기 위한 시도에서 어쥬번트 치료(adjuvant treatment)가 요구된다.

화학요법(chemotherapy)은 난소 암종의 효과적인 치료에서 더욱 중요한 역할을 수행하고 있다(3,4). EOC는 화학감수성 종양(chemosensitive tumour)으로 간주된다; 실제로, 고활성 일선 화학요법제(front-line chemotherapy)를 복용하는 EOC 환자의 70-80%는 임상적 관해(clinical remission)에 들어간다. 하지만, 새로운 치료적 접근법(therapeutic approach)의 개발과 향상된 평균 생존 기간(median overall survival)에도 불구하고, 최초 치료에 대한 완전 반응(complete response)후 대부분의 진전된-단계 환자에서 재발(relapse)이 발생하고, 이들 환자 중에서 최소한 70-90%는 궁극적으로, 약제-내성(drug-resistant) 암으로 사망하고, 장기 생존(long-term survival)은 10-30%에 불과하다.

이런 이유로, 난소 암에 대한 대안적 치료 방법이 요구된다. 이들 대안적 치료법 중의 한 가지는 방사성면역요법(radioimmunotherapy)이다. 난소 암종은 화학- 저항성(chemo-resistant)인 전이를 제거하기 위하여 어쥬번트 방사성면역요법으로 치료될 수 있다. 방사성면역요법은 방사성 성분(radioactive component)으로, 암 에피토프에 특이적인 단클론 항체를 표지하는 단계가 포함된다. 방사성표지된 단클론 항체는 이후, 생체내 주입되고, 이의 특이성(specificity)은 암 덩어리(cancer mass)에서 이의 축적을 유도할 것이다. 이러한 기술은 암 세포에서 치료제, 본 발명의 경우에, 방사성 성분의 농축을 가능하게 하고, 부위 특이적이지 않은 화학-요법에 대조적으로, 선택적 표적화(selective targeting)와 상이한 작용 기전의 가능성 및 전체 치료에 이용되는 치료제의 더욱 낮은 용량으로 인하여 독성(toxicity)과 부작용(side effect)이 덜하다.

난소 암종에 대하여, 지금까지 여러 상이한 마커(marker)가 확인되었고 다수의 상이한 항체가 산출되었다. 이들 중에서, 가장 특징화된 마커는 항-CA125(5,6)와 항-MUC-1항체 및 항-엽산염 수용체 항체, 예를 들면, Mov18(7)이다. 후자는 여러 유의한 이점을 제공한다.

엽산염 수용체 알파(FRα)는 엽산(folic acid)과 일부 환원된 엽산염(reduced folate), 예를 들면, 5-메틸테트라하이드로엽산염(methyltetrahydrofolate)과 테트라하이드로엽산염(tetrahydrofolate)에 대한 높은 친화성을 갖는 글리코실 포스파티딜이노시톨(glycosyl phosphatidylinositol) 연결된 단백질이다. 또한, 이는 특히 신장(kidney), 태반(placenta)과 맥락총(choroid plexus)에서 제한된 수의 상피 세포 상에 존재하지만 그들의 정점 표면(apical surface)에서 발현되기 때문에, 항체가 여기에 접근하지 못한다. 난소 암종 세포에 의한 FRα의 과다 발현 및 정상 조직 내에서 이의 제한된 분포는 방사성면역요법을 위한 항-FRα 항체의 개발 기회를 제공한다. MOv18은 방사성면역요법에 이상적인 표적인 알파 엽산염 수용체(alpha folate receptor)에 특이적인 단클론 항체(monoclonal antibody)인데, 그 이유는 상기 수용체가 90%의 난소 암종에서 과다-발현되기 때문이다. ¹³¹I로 방사성표지된 MOv18은 임상 I/II기 시험에 이미 도입되었고, 일부 성과를 거두었다. FRα에 대하여 생성된 다른 뮤린 단클론 항체에는 MOv19가 포함된다.

MOV18을 비롯한 다수의 다른 mAb는 상이한 임상 시험에서 효능을 나타내긴 했지만 그들의 뮤린 기원(murine origin)에 의해 임상적 개발이 제한되었다. 면역원성(immunogenicity)을 회피하기 위하여, 일부 항체는 그들의 임상적 개발 이전에 또는 임상적 개발 동안 키메라 또는 인간화 항체를 형성하도록 조작되었는데, 최종 세대는 완전 인간 항체이고 임상적 개발 중에 있다.

방사성면역요법에서 종종 부딪히는 한계는 수일간 존속할 수 있는 장기의 항체 반감기(antibody half-life)이다. 한편, 이러한 특성은 종양을 표적하는 항체에 적절한 양의 시간을 제공하는 이점이 될 수 있다. 하지만, 다른 한편, 이는 신체를 통하여 정맥내에서 붕괴하는 방사성 성분인 라벨(label)에 따라, 환자 내에서 수일간 존속할 수 있음을 의미한다. 이러한 경우에, 혈액 또는 장기에 대한 종양 비율이 가장 긍정적인 조건에서 로그(log)를 거의 초과하지 못하는데, 그 이유는 이러한 항체가 환자의 체내에서 느리게 소거되기 때문이다. 이러한 관점에서, 항체 반 감기 감소는 건강한 조직 내에서 비-특이적인 방사성의 축적으로 인한 부작용을 저하시킴으로써 치료 독성(treatment toxicity)을 감소시킬 것이다.

다른 고려 사항은 종양 침투(tumour penetration)이다. mAb 분자의 입체 장애(steric-hindrance)는 표적이 혈류(blood stream) 내에서 분리된 세포이면, 영향을 주지 않지만, 난소 암종의 경우에서처럼 고형 종양(solid tumour)을 고려할 때는 중요하다(8,9).

고형 종양 침투 역시 리간드(ligand)에 대한 항체 친화성(antibody affinity)에 의해 영향을 받는데, 너무 낮은 친화성은 종양 국지화(tumour localization)를 예방하는 반면 너무 높은 친화성은 종양 주변(tumour periphery)에 항체 결합(antibody binding)을 제한하는 것으로 밝혀졌는데(10), 후자 현상은 항원 장벽(antibody barrier)으로 기술된다,

이들 고려 사항(기원, 크기, 반감기와 친화성)에 비추어, 난소 암종의 방사성면역요법을 위한 인간 항체 단편(Fab)의 이용이 제안되었다. 실제로, 정규 항체(full antibody)보다 작은 분자는 종양 침투(tumour penetration)에 유리할 가능성이 높고, 이의 인간 기원은 면역원성 반응(immunogenic reaction)을 배제할 것이다. 게다가, 반감기가 단축될 것이다. 이들 분자의 친화성은 선택된 항체 단편의 함수로서 특이적으로 다루어져야 한다. Fab 형식(format)의 다른 이점은 이러한 유형의 분자가 기능적 당화(glycosylation)를 필요로 하지 않는다는 점이다. 이는 미생물 생산 및 연관된 이점과 조화된다.

이런 항체 단편은 MOv18이 산출된 동일한 융합체로부터 선택되고 동일한 표 적 항원, 즉, FRα 상에서 비-교차-반응(non-cross-reacting) 에피토프(epitope)를 인식하는 단클론 항체(Mab)인 MOv19로부터 시작하는 유도된 선택(guided selection)을 통하여 과거에 산출되었다. C4(11)로 명명된 선택된 Fab 단편은 시험관내 검사에 의해 FRα에 특이적으로 결합할 수 있는 것으로 보고되었다. C4는 전체 EOC 세포 상에서 수행된 스카차드 분석(Scatchard analysis)에 의해, 200nM의 예측 K_aff를 보였다.

따라서 난소 암의 치료와 진단에서 생체내 임상적 이용에 적합한 C4-Fab 단편의 개발이 착안되었다. 하지만, 본 발명자들은 C4 항체 Fab 단편의 상대적으로 낮은 친화성 및 이의 생체내 반감기가 임상적 개발을 위한 요구사항에 부적합하다는 것을 확인하였다. 실제로, C4 Fab 단편으로 본 발명자들에 의해 수행된 생체내 실험에서 아래와 같은 사실이 밝혀졌다:

- C4 Fab 단편의 친화성은 효과적인 종양 국지화(tumour localization)를 달성하기에 너무 낮았다;

- C4 Fab의 생체내 반감기가 너무 짧은데, 이는 낮은 친화성과 함께, 종양 국지화를 방해하였다; 정맥내 투여(intravenous administration)후 1시 시점에도 동물 혈액 내에서 Fab 단편을 탐지하는 것이 거의 불가능하였다. 이러한 과도한 소거(clearance)는 고형 종양 내에서 항체 단편의 축적을 방해하여 모순된 생체분포(biodistribution) 결과를 유발하였다.

이에 더하여, 본 발명자들은 대장균(E. coli) 내에서 재조합 C4 Fab의 생산 및 이의 차후 정제가 정제 단계 동안 제거하기 어려운 비-기능성 경쇄 동종이합체(non-functional light chain homodimer) 오염물질(L₂)의 동시 생산에 의해 심각하게 방해받는다는 것을 확인하였다.

이런 이유로, 본 발명자들은 난소 암종의 방사성면역요법에 적합한 이합체성 Fab 단편을 생산하는 가능성을 조사하기로 결정하였다. Fab에서 F(ab')₂ 형식으로의 이전은 여러 이점, 예를 들면, 단편 결합성(fragment avidity)과 이에 따른, 전체 친화성(overall affinity)을 증가시키는 이가(bivalency)를 제공하고, 상응하는 Fab 단편에 대하여 분자량을 2배로 늘리는데, 이는 교대로, 소변으로 배출(excretion)을 감소시켜 신장을 보호하고, 결과적으로 이의 생체내 반감기(in vivo half-life)를 연장시킨다(12).

하지만, 본 발명자들은 놀랍게도, C4 Fab 단편을 효과적으로 이합체화하는 것이 불가능하다는 것을 확인하였다. 자연적인 또는 화학적 이합체화(dimerization) 방법 중에서 어느 것도 C4 이합체의 기준에 맞는 수율을 산출하지 못하였다; 소량의 정확한 이합체 산물은 겔 여과 크로마토그래피 정제(gel filtration chromatography purification)에 의해 제거될 수 없는 부정확한 대리 이합체 종(surrogate dimer species)에 의해 고도로 오염되었다. 본 발명자들은 Fab 이합체의 생산이 카파 경쇄로 C4 람다 경쇄의 치환을 비롯한, 원래 C4 Fab 단편의 광범위한 변형을 요구한다는 것을 확인하였다. 이는 유도된 선택 전략을 이용하여 수행되었다. 이렇게 선택된 카파 경쇄를 포함하는 새로운 Fab 단편은 AFRA로 명명되었고, 향상된 결합 친화성(binding affinity)을 갖는 Fab를 산출하였다. 이러한 새로운 카파 경쇄는 또한, 경쇄 동종이합체(homodimer) 형성의 문제를 차단하고, 안정성(stability)을 향상시켰는데, 이는 방사성면역요법에서 유리하다(13). 다른 이점은 카파 사슬이 대장균(Escherichia coli)에서 더욱 용이하게 발현된다는 사실인데, 이는 산업적 적용의 경우에 특히 유리하다. 본 발명의 AFRA 카파 경쇄의 아미노산 서열은 도 1과 7(SEQ ID NO:1)에 도시된다. 비교를 위하여, C4 경쇄의 아미노산 서열 역시 도 1(SEQ ID NO:12)에 도시된다.

따라서 본 발명은 엽산염 수용체 알파에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게는, 단클론 항체 또는 항체 단편에 관계하는데, 여기서 상기 항체 또는 단편은 도 1과 7에 도시된 AFRA 아미노산 서열(SEQ ID NO:1)을 포함하거나 이러한 서열로 구성되는 경쇄, 또는 도 1과 7에 도시된 AFRA 아미노산 서열(SEQ ID NO:1)과 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 보유하는 상기 경쇄의 유도체를 포함한다. 기능적 등가물(functional equivalent)은 하기에 정의된다.

본 발명에서, 아래의 용어가 이용된다:

- 달리 명시되지 않으면, "본 발명의 항체와 단편 " 또는 "AFRA 항체" 또는 "AFRA 항체 단편"은 도 1과 7에 도시된 AFRA 아미노산 서열(SEQ ID NO:1)에 동일한 아미노산 서열, 또는 도 1과 7에 도시된 AFRA 아미노산 서열(SEQ ID NO:1)에 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성되는 경쇄를 포함하는 항체 또는 단편을 지칭한다.

- "AFRA-유래된 항체" 또는 "AFRA-유래된 항체 단편"은 도 1과 7에 도시된 AFRA 아미노산 서열(SEQ ID NO:1)에 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 보유하는 경쇄를 포함하는 항체 또는 단편을 지칭한다.

- "AFRA 경쇄"는 도 1(AFRA)과 도 7(SEQ ID NO:1)에 도시된 경쇄를 지칭한다. "AFRA-유래된 경쇄"는 도 1(AFRA)과 도 7(SEQ ID NO:1)에 도시된 아미노산 서열과 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 보유하는 경쇄를 의미한다.

- "항체"는 "면역글로불린"(또는 'Ig')과 동의어로 이용된다. 달리 명시되지 않는 경우에, '항체' 또는 '면역글로불린'은 본래(또는 완전) 항체 분자를 의미한다. 단편은 이와 같이 표시된다.

- 항체 분자 내에서 아미노산 위치의 넘버링(numbering)은 달리 명시되지 않으면, Kabat 넘버링 체계(numbering system)를 이용하여 만들어진다(Kabat, H. A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. (U.S. Dept. Health and Human Services, Bethesda, Md., 1991).

본질적으로, 항체는 B 림프구(lymphocyte)에 의해 생산되는 당단백질(glycoprotein) 분자이다. 본 발명의 항체는 B 림프구에 의해, 하이브리도마(hybridoma)에 의해, 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내에서 재조합 항체의 발현에 의해, 또는 합성 기술(synthetic technique), 예를 들면, 기존 항체로부터 항체 조작에 의해 만들어질 수 있다. 이들은 당화(glycosylation)되거나 당화되지 않는다. 일반적으로, 항체는 높은 정도의 특이성(specificity)으로 항원에 결합하고, 물리적, 기능적 특성에 기초하여, IgG, IgM, IgA, IgD와 IgE로 명명된 5가지 분류(또는 아이소타입(isotype))로 세분될 수 있다. 이들 상이한 유형의 항체는 대략 150,000 달톤(Dalton)(150 kDa)의 분자량을 공유하고, 시스테인 잔기(cysteine residue) 사이에 사슬간 이황화(S-S) 연쇄를 통하여 공유 결합된 2개의 동일한 폴리펩티드 중쇄(H)와 2개의 동일한 경쇄(L)로 구성되는 공통의 기본 구조 단위(basic structural unit)를 공유한다. 본 발명의 본래 항체 역시 이러한 구조를 갖는다. 적절하게는, 이들은 IgG 유형이다.

본 발명에서, '항체 단편'은 항체의 임의의 부분, 바람직하게는, 항원-결합 부분을 의미하고, 이들 부분의 변이체(variant)를 포괄한다. 본 발명에 따른 항원-결합 단편의 실례는 Fab 단편; Fab' 단편; F(ab)₂ 단편과 미니바디(minibody)이다. 이들 단편의 변이체에는 고유 힌지 서열, 합성 힌지 서열, 펩티드 링커 또는 화학적 배합체(conjugate)의 이용으로 수득되는, 단편의 이합체(dimer)와 삼합체(trimer) 및 단편간 융합체(inter-fragment fusion)가 포함된다. 본 발명의 단편은 일가(monovalent)(가령, Fab 단편), 이가(가령, F(ab)₂ 단편) 또는 다가(multivalent)(가령, 삼합체성 Fab 단편을 포함하는 화학적 배합체)일 수 있다.

본 발명의 AFRA 항체와 단편이 특이적으로 결합하는 항원은 인간 엽산염 수용체 알파(FRα)이다. 엽산염 수용체는 3가지 동등형(isoform), 알파, 베타와 감마를 보유하는데, 이들은 아미노산 서열에서 대략 70% 동일성(identity)을 나타낸다. 이들 상이한 동등형은 엽산(folic acid)에 대한 상대적 친화성(relative affinity)에서 현저한 차이를 나타내고, 차별적으로 조직-특이적이고 여러 악성에서 차별적으로 상승된다. 알파 동등형은 글리코실-포스파티딜이노시톨 막 앵커(glycosyl-phosphatidylinositol membrane anchor)에 의해 세포 표면에 정상적으로 연결된다(15). 이는 엽산에 대한 높은 친화성을 갖고, 수용체-결합된 엽산염 화합물과 엽산염 배합체의 내재화(internalization)를 매개한다. 엽산염 수용체 알파는 정상 조직 내에서 매우 제한된 분포(즉, 제한된 숫자의 정상 상피 세포 상에 존재)를 나타내지만, 부인과 조직의 암종, 예를 들면, 난소 암종에서 과다 발현된다. 본 발명에서, "엽산염 수용체 알파"는 아래의 용어와 동의어다:FR-알파; FRα; 엽산염 수용체 1; 성숙 엽산염 수용체; 성숙 엽산염-결합 단백질; FBP; 난소-종양 연관된 항원 MOv18. 본 발명에서, 상기 용어는 세포의 표면 상에서 발현된 수용체 및 이의 가용성 형태(soluble form)를 포괄한다. 인간 엽산염 수용체 알파의 일차 아미노산 서열은 도 10A에 도시되고, 가용성 형태는 도 10B에 도시된다.

본 발명의 항체와 단편의 중요한 특징은 엽산염 수용체 알파에 대한 결합이 특이적이라는 점이다. 본 발명의 항체와 단편은 C4와 Mov19의 항체와 단편에 중첩되는 반응성(reactivity)을 나타내기 때문에, 엽산염 수용체의 베타와 감마 동등형에 결합하지 않는다. "특이적으로 결합하는"은 본 발명의 항체와 단편이 포유동물 세포의 표면 상에서 발현되는 FRα에 높은 친화성(바람직하게는, 최소한 100 nM의 KD, 가장 바람직하게는, 최소한 20nM의 KD)으로 결합하고, 동일한 에피토프 영역 내에서 90% 이하 동일성, 바람직하게는, 95% 이하 동일성, 가장 바람직하게는, 98% 이하 동일성을 갖는 단백질에 결합하지 않는다는 것을 의미한다.

본 발명의 단클론 항체에 의해 인식되는 에피토프는 연속 에피토프이거나, 또는 인간 세포의 표면에서, 바람직하게는, 인간 난소 암종 세포의 표면에서 고유 배열(native configuration)을 채택하는 수용체에 의해 형성되는 불연속(형태) 에피토프일 수 있다, 가령, 본 발명의 항체와 단편은 90% 이하 전체 동일성, 바람직하게는, 95% 이하 전체 동일성, 가장 바람직하게는, 98% 이하 전체 동일성을 갖는 단백질에 결합하지 않는다. 따라서 본 발명의 항체와 단편은 도 10A와 B에 도시된 인간 엽산염 수용체 알파에 매우 높은 동일성을 갖는 단백질, 예를 들면, 도 10 서열에 대하여 1개 내지 5개 아미노산 차이(amino acid difference)를 보유하고, 본 발명의 항체에 의해 인식되는 에피토프 영역에 대하여 도 10 서열과 실질적으로 동일한 대립형질 변이체(allelic variant)에 결합할 수 있다.

상기한 바와 같이, FRα는 난소 암종 세포에서 과다 발현되긴 하지만, 특정 유형의 정상 상피 세포 상에서도 발현된다. 하지만, 정상 세포 상에서 발현은 정상 표면에 한정되고, 생체내 환경에서 본 발명의 항체가 수용체에 접근하지 못한다. 결과적으로, 생체내에서, 본 발명의 항체와 단편은 난소 암종 세포 상에서 발현된 FRα에 특이적으로 결합하는데, 여기서 변형(transformation)의 결과로써, 세포가 극성(polarity)을 상실하고, 알파 엽산염 수용체가 전체 세포 표면(또는 다른 암종) 상에서 발현되고 정상 상피 인간 세포의 표면 상에서 발현된 수용체에 결합할 수 없다. 대조적으로, 본 발명의 항체와 단편을 시험관내 검사에서 조사하는 경우에, 낮은 수준의 FRα를 발현하는 분리된 정상 인간 상피 세포 또는 조직(가령, 뇌하수체(pituitary), 자궁 내막(endometrium), 갑상선(thyroid) 또는 췌장(pancreas)의 상피 세포) 또는 세포주(cell line) 상에서, 특이적인 결합이 탐지될 수도 있다.

본 발명의 AFRA 항체와 AFRA 항체 단편은 특이적인 경쇄에 의해 특징되는데, 이의 아미노산 서열은 도 1(SEQ ID NO:1)에 도시된다. 이러한 도시된 AFRA 경쇄는 면역글로불린 경쇄(L)에 전형적인 구조를 갖는다. 실제로, 일반적으로, 경쇄(L)는 대략 220개 아미노산 길이이고, 경쇄의 아미노 말단에서 하나의 가변 도메인(variable domain, "VL")(대략 110개 아미노산) 및 L 사슬의 나머지 카르복실 절반으로 구성되는 하나의 불변 도메인(constant domain, "CL")을 보유한다. 본 발명의 AFRA 경쇄는 218개 아미노산: 가변 영역("VL")을 구성하는 N-말단 113개 아미노산 및 불변 도메인 ("CL")을 구성하는 카르복시 말단의 나머지 105개 아미노산을 포함한다. 이러한 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은 본 발명의 AFRA 항체에 유일하다. 연관된 중쇄의 가변 영역과 함께, 이는 본 발명 항체의 항원 결합 부위(antigen binding site)를 형성한다. AFRA 경쇄의 불변 영역은 전형적인 카파 경쇄이다.

본 발명의 AFRA 항체와 단편의 경쇄는 통상적으로, 도 1과 7에 도시된 경쇄와 동일하지만, 본 발명으로부터 이탈 없이 이러한 서열에 특정의 변화를 발생시킬 수 있다. 실제로, 본 발명은 도 1과 7에 도시된 AFRA 아미노산 서열(SEQ ID NO:1)에 기능적으로 동등한 경쇄를 포함하는 "AFRA-유래된 항체" 또는 "AFRA-유래된 항체 단편"에도 관계한다. 이런 기능적으로 동등한 경쇄는 가변 영역이 엽산염 수용체 알파에 대한 특이성(specificity)을 결정하는 도 1과 7에 도시된 AFRA 경쇄의 영역 중에서 최소한 하나를 포함하는 경쇄 및 카파 불변 영역을 포함하는 아미노산 서열이다.

특이성을 결정하는 영역은 "상보성 결정 영역(complementarity-determining region)"(CDR)으로 불리는, V_L 사슬의 "초가변 영역(hypervariable)" 영역에 상응한다. 이들 CDR은 CDR1, CDR2와 CDR3, 또는 대안으로, L1, L2와 L3으로 지칭된다. AFRA 서열(SEQ ID NO:1)의 Fab 결정 구조(crystal structure)에 의해 확인되는 상보성 결정 영역은 아래와 같다:

RASESVSFLGINLIH (SEQ ID NO: 3),

QASNKDT (SEQ ID NO: 4),

LQSKNFPPYT (SEQ ID NO: 5),

이들 영역은 도 7에서 굵은 글씨체와 밑줄로 표시된다. 따라서 본 발명의 이러한 이형에 따라, AFRA-유래된 항체 또는 AFRA-유래된 항체 단편은 엽산염 수용체-알파(FRα)에 특이적으로 결합하고, 가변 영역이 아래의 아미노산 서열 중에서 최소한 1개, 바람직하게는, 2개, 가장 바람직하게는, 3개 모두를 포함하는 경쇄를 포함한다:

CDR1: RASESVSFLGINLIH (SEQ ID NO: 3),

CDR2: QASNKDT (SEQ ID NO: 4),

CDR3: LQSKNFPPYT (SEQ ID NO: 5).

앞서 열거된 CDR 서열은 바람직하게는, 본래 AFRA 경쇄에서 위치와 동일한 위치, 다시 말하면, CDR1: 24-38; CDR2: 54-60; CDR3: 93-102(Kabat 넘버링 체계 이용)에서 AFRA-유래된 경쇄 내에 존재한다. 상기 AFRA-유래된 경쇄의 가변 영역의 나머지 서열은 임의의 골격 서열(framework), 예를 들면, 최대 10개 또는 20개 아미노산, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 아미노산의 치환(substitution), 결실(deletion) 또는 삽입(insertion)에 의해 도 1과 7의 서열(SEQ ID NO:1)과 상이하고, AFRA CDR을 보유하는 항체 또는 항체 단편에서 도 1에 도시된 AFRA 경쇄 골격 서열을 대체하여 이용될 때, 인간 엽산염 수용체 알파에 대한 상기 항체 또는 이의 단편의 특이성을 정성적으로 변화시키지 않는 골격 서열일 수 있다. 한 구체예에서, AFRA 유래된 경쇄의 가변 영역은 최대 10개 또는 20개 아미노산, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 아미노산의 치환(substitution), 결실(deletion) 또는 삽입(insertion)에 의해 도 1과 7의 서열(SEQ ID NO:1)과 상이한데, 이러한 치환, 결실 또는 삽입은 CDR 내부 또는 외부에서 진행될 수 있다. 상기 AFRA-유래된 경쇄의 불변 영역은 고전적인 카파 불변 영역, 예를 들면, 도 7 AFRA 서열의 아미노산 114 내지 219(이중 밑줄로 표시됨)에 동일하다. 적절하게는, 이들 AFRA-유래된 항체 또는 AFRA-유래된 항체 단편은 50nM 이하, 바람직하게는, 20nM 이하의 친화성(KD)으로 엽산염 수용체-알파(FRα)에 결합한다.

엽산염 수용체 알파에 대한, 앞서 정의된 바와 같은 AFRA-유래된 항체 또는 AFRA-유래된 항체 단편의 특이성은 FRα와의 반응성(reactivity) 및 90% 이하 서열 동일성, 바람직하게는, 95% 이하 서열 동일성을 갖는 수용체 단백질과의 교차 반응성(cross reactivity)의 부재를 증명하는 통상적인 실험 수단(experimental means)을 이용하여 실험관내에서 및/또는 생체내에서 검사할 수 있다.

경쇄(L)가 SEQ ID NO:1의 변형되지 않은 AFRA 서열, 또는 앞서 기술된 바와 같은 이의 유도체인 지에 상관없이, 본 발명에 따른 항체 또는 단편은 바람직하게는, 항체 중쇄의 최소한 일부, 예를 들면, 통상적으로 C_H1로 지칭되는 첫 번째 불변 영역과 함께 또는 이런 영역 없이, 최소한 가변 영역(V_H)을 더욱 포함한다. 본 발명의 경쇄와 연결될 수 있는 중쇄의 다른 부분은 가변 영역(V_H), 첫 번째 불변 영역(C_H1)과 힌지 영역의 전체 또는 일부를 포함하는 중쇄 단편이다. 대안으로, 중쇄는 V_H, C_H1,힌지 영역, C_H2, C_H3과 선택적으로 C_H4를 순차적으로 포함하는 고유 중쇄일 수 있다. 중쇄와 경쇄 사이에 연결은 정상적으로, 경쇄의 카르복시 말단에서 시스테인이 관여하는 이황화 연쇄(disulfide linkage)를 통한 공유 연결이다.

본 발명에서, AFRA 경쇄와 연결될 수 있는, 중쇄의 상이한 분절(segment)은 본래 면역글로불린 중쇄(H)가 통상적으로, 대략 440개 아미노산 길이인 점을 고려하여, 아래와 같이 정의된다: 가변 도메인(V_H)은 중쇄의 아미노 말단 가닥(stretch)이다(대략, 110개 아미노산). 중쇄의 나머지 부분은 소정의 종류 내에서 높은(최소한 30%) 서열 상동성(sequence homology)을 갖는 대략 110개 아미노산의 3개 또는 4개(중쇄 종류에 따라) 반복(repeat)을 포함한다. 이들 영역은 C_H1, C_H2, C_H3과 C_H4로 지칭되는 중쇄의 불변 영역이다. 중쇄는 또한, C_H1과 C_H2 도메인 사이에 위치하는 힌지 영역 역시 포함한다. 이는 유연성(flexibility) 및 사슬간 이황화 결합(interchain disulfide bond)을 형성하는 능력을 분자에 제공한다. 이러한 힌지는 각 항체 분자의 2개의 항원-결합 영역이 독립적으로 이동하여 항원에 결합할 수 있도록 한다.

중쇄의 가변 영역은 3개의 초가변 영역, 다시 말하면, H1, H2와 H3, 또는 대안으로, CDR1, CDR2와 CDR3으로 지칭되는 "상보성 결정 영역(complementarity-determining region)"(CDR)을 보유한다. 중쇄의 CDR은 대략 3개 내지 25개 아미노산의 길이를 갖고, 항체 특이성(antigen specificity)에서 중요한 역할을 수행한다.

알파(α), 감마(γ), 델타(δd), 엡실론(ε)과 무(μ)로 지칭되는 5가지 상이한 H 사슬이 자연에 존재하는데, 이들은 아미노산 서열에서 서로 상이하다. 소정의 항체의 아이소타입(isotype)(즉, IgA, IgG, IgD, IgE, 또는 IgM 종류에 속하는 지의 여부)은 문제 항체의 H 사슬에 의해 결정되는데, 알파 H 사슬은 IgA 아이소타입을 정의하고, 감마 H 사슬은 IgG 아이소타입을 정의하는 방식이다. IgG 종류에는 IgG1 내지 IgG4로 지칭되는 4가지 아류( sub-class)가 존재한다. 본 발명에 따른, AFRA 항체 또는 단편 또는 이의 유도체의 중쇄는 이들 아이소타입 중에서 하나일 수 있지만 IgG 아이소타입, 예를 들면, IgG1이 특히 바람직하다.

AFRA 경쇄와 함께 존재하는 중쇄의 특정 하위-영역(sub-region) 및 얼마나 많은 아단위(sub-unit)가 서로 연결되는 지에 따라, 본 발명의 항체와 항체 단편은 본래 항체의 형태를 취하거나, 또는 대안으로, 이의 항원-결합 단편, 예를 들면, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)₂ 단편 등일 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따라, AFRA 항체, 또는 AFRA-유래된 항체 또는 단편은

i) 도 1 또는 7(SEQ ID NO: 1)에 도시된 바와 같은, AFRA 경쇄(가변(V_L)과 불변 영역(C_L)), 또는 앞서 정의된 바와 같은 이의 유도체,

ii) 중쇄의 가변 영역(V_H)과 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 포함하거나 이들로 구성되는 Fab 단편이다.

바람직하게는, 경쇄와 중쇄는 경쇄 내에서 카르복시-말단 시스테인이 관여하는 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 서로 공유 결합된다. 본 발명의 Fab 단편은 전형적으로, 대략 55 kDa의 크기를 갖는다.

본 발명의 이러한 구체예의 특히 바람직한 실례는 중쇄의 가변 영역(V_H)이 도8의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 2)을 보유하는 Fab 단편이다. 대안으로, 중쇄(V_H)의 가변 영역은 도 8에 도시된 것과 상이한 골격 서열 내에서 이러한 도시된 서열의 CDR 영역 중에서 최소한 1개, 바람직하게는, 2개 또는 3개를 포함하는 아미노산 서열을 보유할 수도 있다. 도 8 서열의 CDR 영역은 아래와 같다:

CDR1: DYAMI (SEQ ID NO: 6)

CDR2: SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO: 7)

CDR3: ERYDFWSGMDV (SEQ ID NO: 8)

본 발명의 이러한 구체예의 다른 특히 바람직한 실례는 중쇄의 불변 영역(C_H1)이 감마 중쇄, 특히 감마1 중쇄의 C_H1 영역인 Fab 단편이다. 전형적인 C_H1 중쇄의 실례는 도 9(SEQ ID NO: 9)에 도시된다.

따라서 본 발명의 바람직한 Fab 단편은 아래의 서열 요소를 포함하거나 이들 요소로 구성된다:

i) SEQ nㅀ1의 아미노산 서열을 보유하는 경쇄,

ii) 가변 영역이 도 8에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO: 2)을 보유하고, 첫 번째 불변 영역(C_H1)이 도 9에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO: 9)을 보유하는 중쇄.

본 발명의 다른 측면에서, 항체 단편은 Fab' 단편일 수 있다. 본 발명에서, Fab' 단편은 중쇄가 카르복시 말단 상에서, 두 번째 항체 단편에 공유 결합을 위하여 적합한 고유 힌지 영역을 추가적으로 포함하는 Fab 단편이다. 힌지는 공유 결합 형성에 적합한 하나이상의 아미노산 잔기 또는 화학기(chemical group), 예를 들면, 유리 시스테인을 보유하고, 따라서 Fab' 단편의 이합체화(dimerisation)을 가능하게 한다. 힌지 영역은 항체 고유 힌지 영역의 최소한 일부, 예를 들면, 알파(α), 감마(γ), 델타(δ), 엡실론(ε)과 무(μ) 중쇄 중에서 임의의 하나에서 자연적으로 발생하는 힌지 영역일 수 있다. 특히 적절하게는, 감마 아류, 특히 감마1의 고유 서열, 예를 들면, 펜타펩티드 DKTSC, 또는 헥사펩티드 DKTHTC에 상응하는 힌지 영역, 또는 이의 일부분이다. Fab' 단편의 산출에 이용되는 힌지 영역의 일부분은 예로써, 카르복시 말단에서 최소한 하나의 유리 시스테인 잔기를 전형적으로 보유하지만, 2개 또는 3개의 유리 시스테인 잔기를 보유하도록 조작된다.

대안으로, Fab' 단편은 생체내 환경 내에서 가수분해(hydrolysis)에 저항성(resistance)을 공여하는 화학적 링커(chemical linker)와 같은 비-단백질성(non-proteinaceous) 모이어티에 의해 인공적으로 이합체화될 수도 있다. 이런 인공 링커의 실례는 비스말레이미드 에탄(bismaleimide ethane)(BMOE)이지만, 여러 다른 링커가 기존 문헌에서 보고되었다(16, 17).

Fab' 단편을 이용하는 이점은 이들이 이합체화되어 2개의 항원 결합 도메인을 보유하는 F(ab')₂ 단편을 형성할 수 있다는 점이다. 따라서 F(ab')₂ 단편은 이가이고, Fab 단위체(monomer)에 대한 결합성을 증가시킨다. 이합체를 구성하는 이들 2개의 Fab' 단편은 Fab' 중쇄의, 2개의 힌지 영역 각각의 사이에 결합에 의해 서로 연결된다. Fab' 단위체는 중쇄의 C-말단 상에서 이들 유리 시스테인의 자연 산화(natural oxidation)에 의해 이합체화될 수 있다. F(ab')₂ 단편은 전형적으로, 대략 100 내지 110 kDa의 크기를 갖는다.

비-단백질성 인공 링커에 의해 이합체화되면, F(ab')₂ 이합체를 형성하는 이들 2개의 Fab' 단위체는 이러한 화학적 링커를 서로 공유 연결된다, 가령, 비스말레이미드 에탄(BMOE)은 비-가수분해성의 말레이미드 연쇄를 산출하고, 따라서 생체내 환경 내에서 이합체 상에서 안정성(stability)을 제공한다.

본 발명의 이러한 측면에서, F(ab')₂ 이합체의 이들 2개의 항원 결합 도메인은 동일한 특이성을 보유하고, 둘 모두 엽산염 수용체 알파의 소정의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 대안으로, F(ab')₂ 이합체는 이중특이적인데, 항원 결합 도메인 중에서 하나는 엽산염 수용체 알파의 첫 번째 에피토프에 특이적이고, 다른 하나는 엽산염 수용체 알파의 두 번째 에피토프에 특이적이다. 다른 가능성은 두 번째 항원 결합 도메인이 엽산염 수용체 알파와 전혀 상이한 항원, 예를 들면, 두 번째 암종 항원 또는 작동체 세포의 자연 킬러 마커(natural killer marker)에 결합한다.

본 발명의 항체와 단편은 바람직하게는, 완전 인간 항체이다. 본 발명의 AFRA 경쇄는 인간 기원이다. 이런 이유로, 경쇄를 인간 기원의 중쇄와 결합시키는 것이 바람직하다. 대안으로, AFRA 경쇄는 비-인간 기원, 예를 들면, 뮤린의 중쇄와 먼저 결합되고, 이후 항체 조작 기술을 이용하여 상기 중쇄를 인간화시킬 수 있다.

본 발명의 항체와 단편은 인간 엽산염 수용체 알파에 대한 높은 결합 친화성과 결합성으로 특징된다. 결합 친화성은 항체, 또는 이의 단편 상에서 단일 항원-결합 부위와 이의 특이적인 항원 에피토프 사이에 상호작용의 강도이다. 친화성이 높을수록, 항원과 항체 또는 단편 사이의 결합이 더욱 강하고, 항원이 결합 부위 내에 존속할 가능성이 더욱 높다. "결합성"은 항체 또는 항체 단편 사이의 상호작용의 전체 강도를 기술하는데 이용되고, 친화성과 상호작용의 결합가(valency)에 좌우된다. 개별 항체 분자가 더욱 많은 항원-결합 부위를 보유할수록, 항원에 대한 결합성이 더욱 높다.

친화성은 항체와 항원의 결합(k_ass)과 해리(k_diss)에 대한 반응속도 상수(rate constant) 사이의 비율인 친화성 상수(affinity constant) K_A로서 표시될 수 있다. K_A는 M^-1로 측정된다; 친화성이 높을수록, K_A가 더욱 높다. 대안으로, 친화성은 해리 상수(dissociation constant) K_D로서 표시될 수 있는데, 여기서 K_D = 1/K_A이다. K_D의 단위는 M이고, 친화성이 높을수록 K_D가 더욱 낮다. 본 발명에서, 친화성은 통상적으로, K_D로서 표시된다. 친화성을 측정하는 대부분의 방법이 항체 또는 단편의 결합 부위의 숫자를 고려하기 때문에, K_A와 K_D 친화성 수치는 실제로, 일가 항체 또는 단편에 대한 친화성을 반영하는 것으로 간주될 수 있고, 결합성은 다가항체 또는 단편에 대한 친화성을 반영하는 것으로 간주될 수 있다.

적절하게는, 본 발명의 AFRA 항체와 단편은 100 nM 내지 1 pM 범위의 친화성(K_D)으로 엽산염 수용체-알파(FRα)에 결합한다. 더욱 적절하게는, 이들은 75 nM 이하, 바람직하게는, 50 nM 이하, 더욱 바람직하게는, 30 nM 이하, 가장 바람직하게는, 5 nM 이하의 친화성(K_D)을 갖는다. 예로써, 본 발명의 일가 단편, 예를 들면, Fab 단편은 전형적으로, 50 nM 이하의 K_D를 보인다. 이러한 친화성은 공지된 단위체 C4 Fab 단편에 비하여 상당한 향상을 대표한다. 본 발명의 이가 단편, 예를 들면, F(ab')₂ 또는 Di Fab 말레이미드(DFM)는 전형적으로, 30 nM 이하, 예를 들면, 5 nM 이하의 K_D를 보인다. 이들 수치는 가용성 수용체 또는 세포 표면-발현된 수용체를 항원으로 이용하여 획득될 수 있다.

본 발명에 따르면, 결합 친화성은 다수의 통상적인 기술, 예를 들면, 평형 투석(equilibrium dialysis)에 의해, 아래에 같은 데이터의 스카차드 분석(Scatchard analysis)으로 측정될 수 있다: r/c=K(n-r),

여기서

ㅇ r = 평형에서 결합된 리간드 몰(mole)/항체 몰(mole);

ㅇ c = 평형에서 유리 리간드 농도(free ligand concentration);

ㅇ K = 평형 결합 상수(equilibrium association constant);

ㅇ n = 항체 분자당 항원 결합 부위의 숫자(결합가)

ELISA 경쟁 결합 검사(competition binding assay) 역시 스카차드 분석을 이용한 K_A의 측정에 이용될 수 있다.

대안으로, 상대적 K_D는 ELISA 고원기 신호(plateau signal)의 절반이 획득된 농도로서 결정될 수 있다.

결합 친화성을 측정하는데 이용될 수 있는 다른 기술은 예로써, Biacore 기술(Pharmacia)을 이용한 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, SPR)이다. 상기 방법으로, 결합 동역학(binding kinetics)과 친화성 상수를 측정하는 것이 가능하다. 이러한 기술에 따라, K_D = k_diss/k_ass인데, 여기서 k_diss는 해리 속도 상수(dissociation rate constant)(일명, k_off)이고, k_ass는 결합 속도 상수(association rate constant)(일명, k_on)이다.

본 발명에 따르면, 친화성 분석에 이용되는 항원은 완전 세포, 특히 인간 세포, 예를 들면, 인간 난소 암종 세포(가령, OVCAR3(ATCC), IGROVI(Dr J. Bㅹnard, Institut Gustave Roussy, Villejuif, France)), 또는 인간 엽산염 수용체 알파로 형질감염된 세포, 예를 들면, A431-Fr 세포의 표면 상에서 발현되는 엽산염 수용체 알파이다(18). 대안으로, 항원은 가용성 수용체, 예를 들면, 도 10에 도시된 바와 같은 재조합 FRα의 형태일 수도 있다. 가용성 수용체는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석에 이용하기 특히 유리하고, 인간에서 생체내 결합을 예측하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 AFRA 항체와 단편은 다양한 치료, 진단, 그리고 영상 적용에 이용될 수 있다. 따라서 본 발명은 엽산염 수용체-알파(FRα)의 과다 발현에 관련된 질환의 치료를 위한 본 발명에 따른 AFRA 항체 또는 단편에 관계한다. 특히, 본 발명의 AFRA 항체와 단편은 엽산염 수용체-알파(FRα)의 과다 발현에 관련된 질환, 예를 들면, 암의 치료를 위한 약제의 제조에 이용될 수 있다. 따라서 본 발명의 한 측면은 엽산염 수용체-알파(FRα)의 과다 발현에 관련되는 질환을 치료하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 본 발명에 따른 AFRA 항체 또는 단편의 효과량을 이런 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

다양한 치료, 진단, 그리고 영상 적용을 위하여, 본 발명의 항체 또는 단편은 작동체 모이어티, 예를 들면, 세포독성제 또는 마커에 결합된다. 이는 질환, 예를 들면, 암종(가령, 부인과 암종)의 치료에도 해당된다.

AFRA 항체와 단편의 특히 바람직한 치료적 용도는 인간에서 난소 암종의 방사성면역요법이다. 이런 적용을 위하여, 본 발명의 항체와 단편은 세포독성 방사성핵종(cytotoxic radionuclide), 예를 들면, ¹³¹I, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁸Re에 결합된다. 가장 바람직한 방사성핵종은 ¹³¹I이다. 게다가, 다른 방사성핵종, 예를 들면, ⁹⁹Tc가 예로써, 진단 상황(diagnostic setting) 또는 영상 상황(imaging setting)에 이용될 수도 있다.

AFRA 항체와 단편은 공지된 C4 Fab보다 현저하게 향상된, 알파 엽산염 수용체에 대한 낮은 K_D 수치로 인하여 방사성면역요법에 특히 적합하다. C4의 친화성에 비하여 AFRA 항체와 단편의 더욱 높은 친화성은 방사성면역요법에 대한 실질적인 이점을 대표하는데, 그 이유는 이것이 종양 국지화(tumour localization)와 항체 용량(antibody dosage)에 직접적인 영향을 주기 때문이다. 이러한 특정의 경우에, AFRA 항체와 단편의 더욱 높은 친화성은 종양-결합된 항체의 양을 직접적으로 반영한다. 다시 말하면, AFRA 항체와 단편은 C4보다 훨씬 낮은 K_D 수치를 갖기 때문에, AFRA 분자는 동일한 희석도(dilution)에서 C4에서보다 종양 조직 내에서 더욱 높은 농도에 도달한다. 이는 배경(background)을 감소시키고, 결과적으로 항체 비-특이적 결합(antibody unspecific binding)에 기인한 치료 부작용(treatment side effect)을 감소시킨다. 방사성면역요법은 종양 내에서 방사성의 특이적인 축적에 효과적으로 기초하고, AFRA 항체와 단편으로 달성되는 종양/건강한 조직의 더욱 높은 비율은 향상된 치료 효과에 대한 명백한 포인터를 제공한다.

본 발명의 항체 또는 단편에 방사성핵종의 결합(conjugation)은 임의의 통상적인 기술, 예를 들면, 항체와 방사성동위원소(radioisotope) 사이에 링커의 이용으로 달성될 수 있다. 적절하게는, 방사성면역배합체(radioimmunoconjugate)는 방사성핵종에 따라 대략 0.5 내지 대략 15 mCi/㎎의 특이 활성(specific activity)을 갖고, 정맥내 또는 다른 경로를 통하여 투여될 수 있다. 치료의 요구되는 지속 기간과 효능에 따라, 본 발명의 방사성핵종-항체 배합체는 다른 치료 약제(therapeutic drug) 또는 방사성-감작화제(radio-sensitizing agent)와의 조합으로, 1회 또는 수회 투여될 수 있다. 적용되는 방사성면역배합체의 양은 암종의 정확한 성격에 좌우된다. 투여당 방사선량(radioactivity dose)은 효과적일 만큼 충분히 높아야 하지만, 용량 제한 독성(dose limiting toxicity, DLT)보다 낮아야 한다. 단일 투여가 바람직하다; 복수 투여 역시 가능하다. 일반적으로, 투여당 방사선량은 20과 80 mCi/체표면적(body surface area, BSA) ㎡이다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 방사성면역요법에 이용되는 AFRA 항체 단편은 이합체 단편, 예를 들면, F(ab')₂, 또는 화학적 Fab 이합체, 예를 들면, F(ab')₂-DFM이다. 방사성면역요법 적용을 위한 전형적인 AFRA Fab 이합체는 가변 영역, 예를 들면, 도 8에 도시된 가변 영역, 또는 상이한 골격 서열 내에서 도 8 서열의 CDR을 포함하는 가변 영역을 보유하는 IgG 중쇄와 결합된 AFRA 경쇄를 포함한다.

본 발명의 항체와 단편은 질환, 예를 들면, 암, 특히 난소 암의 치료에서 단일 치료제로서 이용된다. 대안으로, 이들은 복수 약제 및/또는 치료 방법을 수반하는 복합 요법(combined therapy)에서 다른 치료제와 병용될 수 있다. 가령, 본 발명의 항체 또는 단편은 화학 요법, 방사선 요법, 호르몬 요법 또는 생물학적 요법과 병용될 수 있다.

따라서 본 발명의 이러한 구체예는 치료에서 동시적, 개별적 또는 순차적 이용을 위한, 본 발명에 따른 항체 또는 단편 및 복합 조합제(combined preparation)로서 최소한 하나의 추가 치료제를 함유하는 산물(product)에 관계한다. 추가 치료제는 전형적으로, 화학치료제와 방사성치료제로 구성되는 군에서 선택된다. 복합 요법을 위한 이들 산물은 인간 암, 예를 들면, 난소 암의 치료에 특히 적합하다.

이런 복합 요법에서, 본 발명의 항체 또는 단편은 AFRA 항체 또는 단편과 동시에, 또는 이들 항체에 뒤이어 투여되는 적절한 이차 치료와 연관된 일차 치료로서 이용된다. 대안으로, 본 발명의 항체 또는 단편은 일차 치료, 예를 들면, 화학요법을 보조하는 이차 치료로서 이용될 수도 있다. 따라서 본 발명의 이러한 측면은 엽산염 수용체-알파(FRα)의 과다 발현에 관련되는 질환을 치료하는 방법을 포함하는데, 상기 방법은 첫 번째 치료제의 효과량과 두 번째 치료제의 효과량을 이런 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 첫 번째와 두 번째 치료제는 동시에, 순차적으로, 또는 개별적으로 개체에 투여되고, 첫 번째 또는 두 번째 치료제는 본 발명에 따른 AFRA 항체 또는 단편을 포함한다.

따라서 본 발명의 항체 또는 단편은 인간 암, 특히 난소 암의 치료를 위하여, 추가 치료제, 예를 들면, 화학치료제로 보조 또는 어쥬번트 요법을 수행하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, AFRA 항체 또는 단편은 칵테일 또는 혼합물의 형태로, 다른 항체 또는 단편과 함께 존재한다. 이들 다른 항체 또는 단편은 엽산염 수용체 알파에 특이적인 추가의 AFRA 항체 또는 단편이거나, 또는 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 항체 또는 단편이다. 본 발명의 칵테일 또는 혼합물은 또한, 상이한 AFRA 항체 형식을 포함하는 AFRA 항체 또는 단편의 혼합물, 예를 들면, 도 1 또는 7에 도시된 AFRA 아미노산 서열(SEQ ID NO:1)과 함께 최소한 하나의 경쇄, 또는 상기 경쇄의 기능적 등가물을 보유하는 단위체와 이합체 AFRA 항체 또는 단편의 혼합물이 포함된다.

따라서 본 발명은 AFRA 항체 또는 단편의 혼합물을 포함하는데, 상기 혼합물은

i) 인간 엽산염 알파 수용체에 특이적으로 결합하는 이가 항체 단편, 상기 이가 단편은 2개의 공유 연결된 Fab' 단편을 포함하고, 이들 단편 각각은 도 1 또는 7에 도시된 AFRA 아미노산 서열(SEQ ID NO:1)을 보유하는 경쇄, 또는 상기 경쇄의 기능적 등가물,

ii) 도 1 또는 7에 도시된 AFRA 아미노산 서열(SEQ ID NO:1)을 보유하는 최소한 하나의 경쇄, 또는 상기 경쇄의 기능적 등가물을 포함하는 다른 항체 단편을 포함하거나 이들로 구성되는 항체 단편의 이질성 조성물(heterogeneous composition)을 함유하고,

상기 이가 항체 단편(i)은 조성물의 최소한 50%, 바람직하게는, 최소한 60%, 가장 바람직하게는, 최소한 70%를 구성한다. 적절하게는, 단편(ii)는 조성물의 20% 이하, 가장 바람직하게는, 10% 이하를 구성한다.

이가 종(bivalent species)은 Fab' 단편의 힌지 영역 사이에 이황화 연쇄에 의해 연결된 자연 이합체이거나, 또는 화학적 이합체, 예를 들면, DFM-AFRA이다.

가령, 자연 이합체화(natural dimerisation)의 조건에서, AFRA 이합체화 산물의 대략 80%는 정제후 F(ab')₂이다. 본 발명의 AFRA 단편에 의해 형성된 항원-결합 이합체의 높은 비율은 공지된 C4 Fab와 비교하여 추가의 이점을 제공한다. 본 발명자들은 가성 이합체(pseudo dimer)가 이합체화 동안 형성되는 것을 관찰하였다. 이러한 가성-이합체는 하나의 중쇄에 공유 연결된 2개의 경쇄로 구성되고, 두 번째 중쇄는 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)을 통하여 구조 내에 유지된다. 이러한 가성 이합체는 SDS-PAGE에서 2개의 종: 75 kDa(L₂H)와 25 kDa(중쇄)로 분리될 수 있기 때문에, 이는 단순화를 위하여 L₂H로 명명되었다. C4 Fab'의 '자연' 이합체화 동안, 정확한 이합체, L₂H₂는 반응 산물의 대략 30%에 불과한 반면, 나머지 70% 물질은 L₂H 이합체에 해당한다. 대용물(surrogate)로부터 C4 이합체를 크로마토그래피로 정제하는 것이 가능하지 않고, 가성 이합체의 비율이 정확한 이합체의 비율보다 훨씬 높기 때문에, 방사성면역요법을 위한 C4 분자의 개발은 실현가능하지 않다.

화학적 이합체화에 의해 수득된 이합체의 경우에, AFRA 단편은 최소한 50% F(ab')₂를 보유하는 이합체화 생성 혼합물을 산출한다. L₂H 종은 조성물의 20% 이하, 가장 바람직하게는, 10% 이하로 존재하고, 이질성 조성물은 이들 2가지 형태가 크로마토그래피 방법(chromatographic method)으로 분리될 수 없으면 정제된 형태로 존재한다. L2H 종의 존재에도 불구하고, 이질성 AFRA-DFM 혼합물은 예로써, 50nM 이하, 바람직하게는, 30nM 이하, 가장 바람직하게는, 5nM 이하의 K_D로, 인간 엽산염 알파 수용체에 대한 높은 결합 친화성을 갖는 것으로 밝혀졌다.

"자연" 이합체 형성 동안 반응하는 C4 경쇄의 강한 성향은 화학적 이합체 합성(DFM) 동안 더욱 두드러지고, 여러 조건의 pH와 온도에서 시험할 때에도 이합체 집합(dimer assemblage)이 거의 불가능하다. C4 화학적 이합체화 반응은 5% 이하의 수율(yield)을 제공하는데, 이 중에서 대략 30%만 정확한 이합체이다. 따라서 반응 종결 시점에 수득된 이합체의 전체 %가 AFRA에서보다 10배 낮다. 단위체로서 이용될 수 없는 C4 Fab의 낮은 친화성과 함께, 이러한 특별한 특성은 방사성면역요법을 위한 C4 항체 단편의 개발을 불가능하게 한다.

본 발명의 다른 측면은 엽산염 수용체-알파(FRα)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편의 경쇄를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자에 관계하는데, 여기서 상기 경쇄는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 등가물을 포함한다. 상기 핵산은 DNA 또는 RNA이고; 이중 가닥(double-stranded) 또는 단일-가닥(single-stranded)이다.

본 발명은 또한, 상기 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터에 관계하는데, 여기서 상기 핵산 코딩 서열은 전사 조절 신호에 작동가능하게 연결되고, 따라서 적절한 숙주 세포 내에서 AFRA 경쇄의 발현을 가능하게 한다. 상기 핵산은 예로써, 숙주 세포 내에서 경쇄와 중쇄의 자연적인 결합을 용이하게 하는 이중시스트론 정렬(bicistronic arrangement)로, 항체 중쇄 또는 이의 단편을 인코딩하는 서열을 더욱 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, AFRA 경쇄를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포, 예를 들면, 본 발명의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관계한다. 이들 숙주 세포는 원핵 또는 진핵이다. 원핵 숙주 세포의 실례로서, 대장균(Escherichia coli)이 특히 바람직하다. 적절한 진핵 세포의 실례에는 인간, 영장류, 뮤린 또는 효모 세포가 포함된다.

특히 바람직한 세포는 the Budapest treaty 하에, 수탁 번호 CNCM I-3586으로 2006년 3월 15일에 CNCM에 수탁된 대장균(E. coli)의 균주이다. 상기 미생물(Escherichia coli 균주 BW25113 △PyrC::kan(lacI ^q , rrnB _T14 , △lacZ _WJI6 , hsdR514, △araBA-D _AH33 , △rhaBAD _LD78 ))은 플라스미드 DoB0134를 포함하고, 본 발명의 AFRA Fab를 생산한다. 이러한 기탁된 균주로부터 수득되는 AFRA Fab 단편 역시 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명은 또한, 높은 친화성 인간 항체 또는 이의 단편을 생산하는 방법에 관계하는데, 상기 항체 또는 이의 단편은 엽산염 수용체-알파(FRα)에 특이적으로 결합하고, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:

- 적절한 숙주 세포 내에 상기한 발현 벡터를 형질감염시키는 단계;

- 발현된 AFRA 항체 또는 이의 단편을 회수하는 단계;

- 선택적으로, 회수된 항체 또는 이의 단편을 돌연변이 및/또는 이합체화시키는 단계.

이렇게 발현된 항체 또는 단편의 돌연변이는 힌지 부분 또는 시스테인 잔기를 추가하도록 수행되거나, 또는 이러한 항체/단편의 친화성과 특이성을 조율하거나 조정하는데 이용될 수 있다.

한 구체예에서, 발현 벡터는 항체 중쇄 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 두 번째 발현 벡터와 함께 세포 내에서 공동-발현되고, 상기 핵산은 전사 조절 신호에 작동가능하게 연결된다.

본 발명의 항체를 생산하는 대안적 방법은 아래의 단계를 포함한다:

- 인간 V_HC_H 레퍼토리(repertoire)의 구성; 인간 레퍼토리는 바람직하게는, 레퍼토리 구성(repertoire construction)의 시점에는 질환이 없었던 난소 암종 환자로부터, 또는 대안으로, 건강한 공여자로부터 골수(bone marrow), 림프절(lymph node), 비장(spleen) 또는 말초혈(peripheral blood)로부터 획득된 인간 B 세포로부터 구성된다. 이러한 레퍼토리는 합성에 의해 산출될 수도 있다.

- 엽산염 수용체-알파(FRα)에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 가진 인간 항체 중쇄의 선택, 상기 선택은 인간 V_HC_H 레퍼토리(repertoire) 상에서 유도 주형(guiding template)으로서 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 보유하는 경쇄를 포함하는 항체 단편을 이용한 유도된 선택(guided selection) 및 차후에, FRα를 과다 발현하는 인간 세포 상에서 또는 가용성 FRα 단백질 상에서 선택에 의해 수행된다.

- 상기 경쇄와 중쇄의 조합(assembly)을 가능하게 하는 조건 하에 적절한 숙주 세포 내에서, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 보유하는 경쇄를 인코딩하는 유전자와 함께 선택된 인간 항체 중쇄를 인코딩하는 유전자의 발현.

한 구체예에서, 선택된 인간 항체 중쇄를 인코딩하는 유전자 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 보유하는 경쇄를 인코딩하는 유전자는 전사 조절 신호에 작동가능하게 연결된, 선택된 인간 항체 중쇄와 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터에 의해 세포 내에서 발현된다.

대안적 구체예에서, 선택된 인간 항체 중쇄를 인코딩하는 유전자는 전사 조절 신호에 작동가능하게 연결된, 선택된 인간 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 첫 번째 발현 벡터에 의해 세포 내에서 발현되고, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 보유하는 경쇄를 인코딩하는 유전자는 전사 조절 신호에 작동가능하게 연결된, AFRA 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 두 번째 발현 벡터에 의해 세포 내에서 발현된다.

이러한 방법은 AFRA 경쇄와 결합될 때, 엽산염-수용체 알파에 특이적인 결합 도메인을 산출하는 상이한 중쇄의 선택을 가능하게 한다. 이러한 유형의 방법에 관한 구체적인 사항은 하기 실시예에서 제공된다.

본 발명의 다른 측면은 제약학적으로 허용되는 담체와의 조합으로, 본 발명의 항체 또는 단편을 함유하는 제약학적 조성물에 관계한다. 이런 조성물에서, 항체 또는 이의 단편은 항체에 통상적으로 연결되어 이용되는 작동체 모이어티(effector moiety), 예를 들면, 세포독성제(가령, 방사성핵종, 예를 들면, ¹³¹I, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁸Re), 또는 독소, 또는 화학치료제, 또는 프로드러그(prodrug), 또는 효소에 결합될 수 있다. ⁹⁹Tc는 진단적 적용에 이용될 수 있다.

본 발명은 또한, 난소 암종 또는 이의 전이의 진단 또는 영상을 위한 방법에 관계하는데, 상기 방법은 예로써, 개체의 조직, 또는 이의 샘플을 본 발명에 따른 항체 또는 단편과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 항체 또는 단편은 적절한 라벨, 예를 들면, 방사성핵종에 결합된다. 이러한 진단 또는 영상 방법은 생체내에서 수행될 수 있는데, 여기서 조직에 대한 항체의 현저한 결합의 탐지는 엽산염-수용체 알파의 과다 발현의 존재를 지시하는데, 이는 세포의 악성 전환(malignant transformation)을 암시한다. 대안으로, 이러한 진단 또는 영상 방법은 체외에서, 예를 들면, 개체로부터 획득된 생물학적 샘플, 예를 들면, 조직 샘플 상에서 시험관내에서 수행될 수 있다. 후자 경우에, 정상 조직의 정상적인 비-형질전환된 세포에서 엽산염-수용체 알파의 정점 발현(apical expression)의 탐지를 설명하기 위하여, 이런 조직의 샘플로 관찰되는 결합 수준에 대한 본 발명의 항체 또는 단편의 결합 수준의 비교가 권장된다.

본 발명의 다양한 측면은 하기 도면에 도시된다:

도 1: C4(SEQ ID NO:12)와 AFRA(SEQ ID NO:1) 경쇄 아미노산 서열의 정렬. AFRA 경쇄는 218개 아미노산을 포함하는데, 이들 중에서 첫 번째 113개 아미노산은 카파 가변 영역을 구성하고, 나머지 105개 아미노산은 카파 불변 영역을 구성한다. C4와 AFRA 항체 사이에 주요한 차이는 CDR에 있다.

도 2: 대장균(E. coli)에서 AFRA Fab를 발현하는데 적합한 이중시스트론 발현 벡터 DoB0134의 개요도. 대장균(E. coli)에 포함되는, 도 1에 도시된 AFRA 경쇄(SEQ ID NO:1)와 AFRA 중쇄(Q1N 돌연변이 포함)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 상기 벡터는 수탁 번호 CNCM I-3586으로 2006년 3월 15일에 CNCM에 수탁되었다. BW25113 △PyrC::kan(lacI ^q , rrnB _T14 , △lacZ _WJI6 , hsdR514, △araBA-D _AH33 , △rhaBAD _LD78 .

도 3(BIAcore 결합): 알파 엽산염 수용체 상에서 항체 단편 결합 파리미터(binding parameter)의 결정. 이를 위하여, 여러 농도의 Fab 단위체(3 내지 200nM)를 재조합 수용체로 미리 코팅된 센서칩 셀(sensorchip cell)에서 유동시키 고, 30분 동안 결합을 기록하였다. 이 기간후, 추가로 20분 동안 세척을 모니터하였다. AFRA의 경우에, K_D는 43.9 nM이고 Chi2는 1.85(패널 A)인 반면, C4의 경우에, K_D는 168 nM이고 Chi2는 2.19(패널 B)인 것으로 결정되었다.

도 4(자연 이합체화): Fab AFRA와 C4는 자연 이합체를 얻기 위하여 가볍게 환원시키고 부드럽게 산화시켰다. 환원 산물은 SDS-PAGE로 분석하고 결과는 AFRA에 대한 위쪽 A 패널에서 상대적 농도측정 분석(relative densitometry analysis)으로 보고되고, 패널 B는 C4에 해당한다. L₂H 종의 발생은 C 패널 그림에서 보고된다.

도 5(면역조직화학): 항-CA125 단클론 항체는 난소 암종에 상응하는 인간 생검(biopsy) 상에서 내부 양성 대조(internal positive control)로서 시험되었다(A 패널). 동일한 방식으로, AFRA-DFM(0.5 ㎍/㎖)은 동일한 조직 상에서 평가하였다(B 패널). 양쪽 항체는 FITC이고, 배경은 C 슬라이드 상에서 예측되었다.

도 6: (AFRA-DFM-¹³¹I의 생체분포(biodistribution)). ¹³¹I로 방사성표지된 Di-Fab-말레이미드는 종양-보유 생쥐에 iv 주입하였다. 동물은 주입후 1, 3, 6, 15, 24와 48 시간에 희생시켰다. 종양, 혈액과 미리 규정된 장기는 분리하고, 칭량하고, 계산하여 AFRA-DFM의 농도를 결정하였다. 생체분포의 결과는 하기 도면에서 주입된 용량(injected dose)/g의 비율로 보고된다.

도 7:

- 아미노산 1에서 113에 이르는 가변 영역(Vk);

- 결정 구조(crystal structure)로부터 확정된 초가변 영역: CDR1(아미노산 24 내지 38), CDR2(아미노산 54 내지 60)와 CDR3(아미노산 93 내지 102)(굵은 글씨체, 밑줄);

- 아미노산 114에서 219에 이르는 카파 불변 영역(Ck)(이중 밑줄)을 보여주는 AFRA 카파 경쇄 아미노산 서열(SEQ ID NO:1).

도 8: AFRA 중쇄(가변 영역) 아미노산 서열(SEQ ID NO:2):

- 아미노산 1에서 120에 이르는 가변 영역(Vk);

- 초가변 영역: CDR1(아미노산 31-35), CDR2(아미노산 50-66)와 CDR3(아미노산 99-110)(굵은 글씨, 밑줄);

도 9: AFRA 중쇄(불변 영역: IgG1 CH1)(SEQ ID NO: 8)

도 10(알파 엽산염 수용체):

A: 엽산염 수용체 알파의 아미노산 서열(SEQ ID NO:10):

- 신호 서열: 아미노산 1 내지 24

- 성숙 수용체 서열: 아미노산 25 내지 234

- Propep 서열: 성숙 형태(mature form)에서 떨어진 아미노산 235 내지 237

- 당화 부위(Glycosylation site); 아미노산 69, 161과 201.

B: His6 정제 태그(purification tag)(SEQ ID NO:11)를 갖는 재조합 가용성 알파 엽산염 수용체

도 11: 1 mCi/생쥐의 평균 용량(average dose)으로 생쥐 내에서 이종이식된 종양에서 방사성-표지된 AFRA-DFM의 생체내 효능. 검은색 막대: 인간 엽산염 수용체 알파로 형질감염된 A431 세포(A431FR)의 종양. 대각선 음영 막대: 인간 엽산염 수용체 알파로 형질감염되지 않은 A431세포(A431)의 종양. 열린 막대: 대조(control).

도 12: i.p. 투여후 생체내 국지화(in vivo localization). ¹³¹I로 방사성표지된 AFRA-DFM은 i.p. 성장 IGROV1 종양 세포를 보유하는 생쥐에서 i.p.(평균 용량 = 0.074 mCi/생쥐) 주입하였다. 동물은 주입후 1, 3, 6, 15와 24시 시점에 희생시켰다. 복수(ascite), 고형 i.p. 종양 덩어리, 혈액과 미리 규정된 장기는 분리하고, 칭량하고, 계산하여 AFRA-DFM의 농도를 결정하였다. 생체분포의 결과는 주입된 용량(injected dose)/g의 비율로 보고된다.

도 13: 생쥐 내에서 이종이식된 난소 암 세포에서 방사성-표지된 AFRA-DFM의 생체내 효능(in vivo efficacy). A: 인간 엽산염 수용체 알파를 자연적으로 과다 발현하는 IGROV1 세포가 i.p. 주입되고 Day +2에 1 mCi/생쥐의 ¹³¹I-DFM-AFRA 또는 염수(대조)로 i.p. 처리된 생쥐의 전체 생존(overall survival). B: 인간 엽산염 수용체 알파를 자연적으로 과다 발현하는 OVCAR3 세포가 i.p. 주입되고 Day +2 또는 +4에 1 mCi/생쥐의 ¹³¹I-DFM-AFRA 또는 염수(대조)로 i.p. 처리된 생쥐의 전체 생존.

1. 알파 엽산염 수용체에 특이적인 높은 친화성 인간 Fab 단편의 생산

증가된 결합 친화성을 비롯한 향상된 결합 특성을 갖는 인간 Fab 단편을 수득하기 위하여, C4 Fab 단편을 상당히 변형하였다. 이들 변형은 아래에 기술된다:

a) 사슬 셔플링(chain shuffling): 알파 엽산염 수용체에 특이적인 카파 경쇄의 선택

먼저, C4 람다 경쇄를 카파 경쇄를 치환하기로 결정하였다. 이러한 Fab 경쇄 치환은 파지 전시(phage display) 유도된 선택으로, C4 단편에서 앞서 기술된 바와 같이 수행하였다(11).

구체적으로, 항체 카파 경쇄(VkCk) 라이브러리는 인간 B-세포로부터 산출하였다.

상기 라이브러리는 이전에 난소 암종이 존재했지만 채혈(blood withdrawal) 시점에는 질병-없음이었던 4명의 여성으로부터 획득된 말초혈 림프구(peripheral blood lymphocyte)로부터 모아진 mRNA에서 유래되었다. 이들 여성은 혈액 수집에 앞서 수년 동안 질병-없음 상태를 유지하였다. 이들 여성 중에서 3명은 III 또는 IV 단계로 진단된 장액성 조직형(serous histotype)의 난소 암종을 앓았었다. 4번째 환자는 III 단계로 진단된 자궁내막 조직형(endometroid histotype)의 난소 암종을 앓았다. 라이브러리의 준비를 위하여 각 환자로부터 2.0 x 10⁷과 5.0x10⁷ PBMC를 수집하였다. 각 사슬 집단(chain family)은 프라이머 어닐링 온도(primers annealing temperature)에 따라 특이적 PCR 효율을 보정하기 위하여 적절한 프라이머 쌍(primer pair)으로 개별적으로 증폭하였다.

이렇게 획득된 독특한 VkCk 레퍼토리는 고유 레퍼토리가 아닌데, 그 이유는 이들 환자가 엽산염 수용체 알파 항원의 과다 발현에 이미 노출되었기 때문이다. 이는 잠재적으로, 특정 종양 및 아마도, 이런 질환을 앓는 여성에서 발현된 알파 엽산염 수용체에 대하여 발생된 항체에 대한 유전자를 포함하였다.

이렇게 획득된 라이브러리는 C4 중쇄와 조화되는 새로운 경쇄를 선택하는데 이용되었다. 본 발명자들은 알파 엽산염 수용체에 대하여 C4 분자와 동일한 특이성을 공유하는 항체 단편을 탐구하고 있었기 때문에, 유도된 선택 프로토콜을 적용하였다. 새로운 카파 경쇄를 선택하기 위한 유도 주형으로 C4 중쇄를 이용한, 난소 암종 세포(OVCAR-3 세포) 상에서 3회의 패닝(panning) 작업후, 여러 파지(phage)를 무작위 선택하고 이들 세포 상에서 결합 능력(binding capacity)을 평가하였다. 최적 결합물질이 확인되었고 AFRA(항-엽산염 수용체 알파)로 명명되었고, 이의 경쇄는 염기서열분석되었다.

선택된 카파 경쇄 아미노산 서열은 도 1에 보고된다. AFRA와 C4 단편은 실시예 1c에서 보고된 바와 같이, AFRA 중쇄의 첫 번째 아미노산에 도입된 Q1N 돌연변이를 제외하고, 동일한 중쇄를 보유한다.

b) 대장균(E. coli) 내에서 Fab의 발현:

이후, 대장균(E. coli) 내에서 AFRA Fab 단편과 C4 Fab 단편의 발현에 적합한 발현 구조체(expression construct)를 준비하였다: AFRA 또는 C4의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 유전자는 대장균(Escherichia coli) 주변세포질 구획(periplasmic compartment)으로 단편 합성을 유도하기 위하여 리더 서열(leader sequence)(대장 균(E. coli) 열 안정성 장독소(enterotoxin) II로부터 유래된 StII 리더)과 함께 인 프레임(in frame) 클론하였다. 상기 발현 벡터는 특히 발효용으로 설계되었고, 디하이드로오로타제(dihydroorotase)를 인코딩하는 pyrC 선별가능 마커와 함께, arabinose araP 프로모터의 통제 하에 경쇄와 중쇄를 모두 인코딩하는 이중시스트론 구조체(bicistroni cconstruct)를 보유한다(이러한 기본 발현 카세트는 2005년 10월 6일자 Dompe S.p.a. 이름으로 제출된 European patent application EP 05109274.0 및 WO2007/039632에 기술된다). 상기 이중시스트론 벡터는 두 번째 사슬(중쇄)의 발현과 비교하여, 첫 번째 사슬(경쇄)의 약간 과량(faint excess)을 발현하도록 설계되었는데, 그 이유는 본 발명의 경우에, 중쇄가 단독으로 발현되면 대장균(Escherichia coli)에 유해할 수 있기 때문이다.

AFRA를 발현하는 벡터는 DoB0134(도 2 참조)로 명명되고, 2006년 3월 15일에 수탁번호 CNCM I-3586으로, 대장균(Escherichia coli) 균주 BW25113 △PyrC::kan(lacI ^q , rrnB _T14 , △lacZ _WJI6 , hsdR514, △araBA-D _AH33 , △rhaBAD _LD78 )에서 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15)에 수탁되었다. 상기 균주는 실시예 1c에 기술된 N-말단 변형을 갖는 AFRA 경쇄 및 고유 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 발현한다.

상기 발현 벡터 DoB0134는 대장균(Escherichia coli) 내로 형질전환시키고, AFRA 항체 단편을 발현시키고 정제하였다. 비교 목적으로, 공지된 C4 Fab를 발현하 는 상응하는 구조체를 이용하여 유사한 실험을 수행하였다.

C4의 생산 동안, 호모 경쇄 이합체(L₂)의 상당한 축적이 관찰되었는데, 이는 재조합 단백질 합성의 최대 50%를 차지하였다. 이는 두 번째 사슬의 발현과 비교하여, 첫 번째 사슬의 약간 과량을 발현하는 상기 발현 벡터의 설계에 부분적으로 기인한다. 하지만, 상기 발현 벡터는 여러 상이한 Fab를 생산하는데 이용되고, 동종이합체 경쇄 산물은 다른 서열로도 전혀 관찰되지 않았다. 이러한 L₂ 동종이합체는 무용한 미생물 부산물인데, 이는 생산 공정에서 상당한 불이익을 유발한다. 실제로, 이는 숙주 물질대사(host metabolism)에 심하게 의존하고, 유용한 Fab'로부터 분리하기 어려우며, 표적 결합 능력(target binding capacity)이 없고, 원하는 단편을 대체하여 생산된다.

대조적으로, 본 발명의 AFRA Fab는 동일한 발현 벡터 및 동일한 대장균(Escherichia coli) 균주로부터 임의의 탐지가능한 동종이합체 경쇄를 생산하지 않는다. 이런 이유로, 전체 생산 수율(overall production yield)이 인위적으로 증가되고, 크로마토그래피 칼럼 수용력(chromatographic column capacity)이 강하게 감소되는데, 그 이유는 목적의 Fab' 단편과 동종 경쇄 이합체 사이에 수지 결합(resin binding)에 대한 경쟁이 없기 때문이다.

AFRA Fab의 특이성은 FACS를 이용하여 평가하였다. 형광 이동(fluorescence shift)은 인간 알파 엽산염 수용체를 발현하는 세포에서만 기록되었다.

c) N-말단 Q1N 돌연변이 AFRA의 변형:

C4 중쇄를 유도 주형으로 이용한 최초 유도된 선택 프로토콜의 결과로써, AFRA와 C4 단편은 초기에 동일한 중쇄를 보유하였는데, 이의 첫 번째 아미노산은 글루타민(glutamine)이었다. 하지만, 이 위치에서 글루타민은 산물 이질성(product heterogeneity)을 유발하는 피로글루탐산(pyroglutamic acid)(19)으로 전환되는 것으로 알려져 있다. 이런 이유로, N-말단 글루타민은 특정부위 돌연변이유발(site directed mutagenesis)을 이용하여 아스파라긴(asparagine)으로 치환시켰다. 이런 치환은 아미노산 측쇄 길이(side chain length)를 1개 탄소 감소시켜 이의 고리화(cyclisation)를 예방한다. AFRA 중쇄의 첫 번째 아미노산에 상응하는 DNA 삼중 코돈(triplet codon)을 변형하고, 이를 원하는 아스파라긴 잔기로 전환시키기 위하여 특정부위 돌연변이유발을 수행하였다.

이러한 특정부위 돌연변이는 이 돌연변이를 제외하고, PCR 증폭 동안 다른 예상치 못한 돌연변이가 삽입되지 않았음을 입증하기 위하여 전체 유전자를 염기서열분석함으로써 확정하였다. 상응하는 단백질은 생산하고 균질성(homogeneity)으로 정제하였다. 디-페닐 칼럼 상에서 이러한 시간 역상(time reverse phase) HPLC 분석에서, 독특한 종에 상응하는 임의의 pH에서 단일 피크가 확인되었다. 이는 전기분무 질량 분석(electrospray mass analysis)으로 확증하였는데, 여기서 AFRA 분자량(molecular weight)은 이의 일차 구조로부터 산정된 분자량과 일치하였다.

2. 인간 엽산염 수용체 알파에 대한 AFRA Fab 단편의 결합 특성:

새로운 AFRA 인간 Fab 단편은 인간 엽산염 수용체 알파에 결합하는 능력을 평가하고, 이의 결합은 C4 결합과 비교하였다.

가용성 재조합 인간 알파 엽산염 수용체를 표적 단백질(target protein)로서 이용하는, BIAcore 장치(Pharmacia)에서 플라즈몬 공명(plasmon resonance)으로 동역학 분석(kinetic analysis)을 수행하였다(도 8 참조).

a) 엽산염 수용체의 가용성 알파 동등형(FRα)의 정제

엽산염 수용체의 알파 동등형(FRα)을 발현하는 중국-햄스터 난소(Chinese-Hamster ovary, CHO-K1) 세포주를 작제하였다. 정제를 용이하게 하기 위하여, 가용성 FRα 유전자를 pIRESneo 발현 벡터 내로 서브클론(subclon)하여 엽산염 수용체 당단백질의 가용성 His-태그된 알파 동등형을 발현하였다.

가용성 단백질을 산출하고, 기회적 프라이머 쌍(opportune primer pair)을 이용한 PCR 기술로 아미노산 위치 234에서 종결되는 단축된 형태의 FRα를 산출하기 위하여, plasmatic membrane에 상기 단백질의 고정(GPI-고정)을 매개하는 수용체의 카르복시 말단 부분이 제거되도록 조작하였다.

이들 PCR 프라이머는 pIRES-neo 벡터 복수 클로닝 제한 부위(multiple-cloning restriction site)와 조화되는, 제한 부위, 정방향 프라이머(forward primer)에서 할프(half) EcoRV 및 역방향 프라이머(reverse primer)에서 EcoRI를 보유하도록 설계되었다. 이들 PCR 산물은 Quiaex 겔 추출 키트(Quiagen)를 이용하여 정제하고, EcoRI로 절단하였다. 절단후, 산물은 정제하고, T4 결찰 시스템(Biolabs)을 이용하여 하룻밤동안 EcoRI과 EcoRV 절단되고 탈인산화된 IRES-neo 벡터에 결찰시켰다. 결찰된 샘플은 대장균(Escherichia coli) DH5α 내로 형질전환시키고, LB-agar 암피실린(Ampicilin) 평판 위에 도말하였다.

여러 amp^R 콜로니는 선택하고 PCR 기술을 이용하여 검사하였다. 정확한 패턴을 보인 클론은 DNA 추출과 발현 연구를 위하여 선택하였다. 이러한 발현 벡터의 DNA 서열은 자동 염기서열분석(automatic sequencing)을 이용하여 확인하였다.

상기 발현 벡터는 이후, CHO 세포 내로 형질감염시키고, 안정한 클론은 네오마이신 저항성(neomycin resistance)을 통하여 선택하였다. 이들 중에서 최고 생산 클론은 배양 상층액(culture supernatant)의 웨스턴 블랏 분석(western blot analysis)으로 확인하고, 생산 규모를 최대 1 ℓ로 확대하였다. 배양 상층액은 10000 x g에서 15분 동안 원심분리로 정화하여 세포로부터 상층액을 분리하고, 0.22 ㎛에서 여과하고, 4℃에서 정제를 수행하고, 모든 완충액은 Tween-20 0.05 %를 포함하였다.

엽산염 수용체 단백질은 아래와 같이 상층액으로부터 정제하였다. 첫 번째 단계, His-태그된 당단백질은 Ni⁺⁺-충전된 킬레이트화 Sepharose Fast Flow(AmershamBiosciences, Uppsala, Sweden)를 이용한 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)로 농축하였다. CHO 세포 배양 상층액은 5 ㎖/min의 유속(flow rate)에서, 20mM 인산염(phosphate), 0.15 M NaCl pH 7.0으로 미리-평형화된 칼럼에 적용하였다. 모든 상층액을 칼럼에 적용한 이후, 상기 칼럼은 용리액(eluent) 내에서 A_280nm이 기준으로 환원될 때까지 출발 완충액(starting buffer)으로 세척하였다. 단백질은 0.5 M의 이미다 졸(imidazole)을 포함하는 동일한 완충액으로 용출하였다. A_280nm 피크는 다음 단계를 위하여 회수하였다. 이 시점에서, 내생성 엽산염 분자는 1 M HCl의 방울방울 첨가로 pH를 3.0으로 낮춤으로써 FRα로부터 분리시키고, 얼음-중탕(ice-bath) 내에서 1시간 동안 교반하였다. 그 다음, 샘플은 20 mM 인산염, 0.15 M NaCl pH 7.0을 포함하는 G-25 Sephadex 칼럼(HiPrep 26/10 탈염 Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)에서 완충액 교체(buffer exchange)를 수행하였다. 최종적으로, 샘플은 5 CV의 20 mM 인산염, 0.15 M NaCl pH 7.0으로 평형화된 엽산-Sepharose(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)의 2 ㎖ 칼럼을 통하여 천천히(0.5 ㎖/min) 통과시켰다. 통과물(flow-through)은 분석을 위하여 회수하였다. 평형화 완충액(equilibration buffer)으로 칼럼 세척후, FRα는 0.1 M 글리신, 0.5 M NaCl pH 2.8로 친화성 수지로부터 용출하였다.

분획물(fraction)은 effluent의 pH를 7.0로 상승시키기 위한 50 ㎖의 1 M 인산나트륨 pH 7.0을 포함하는 폴리프로필렌 검사 튜브(polypropylene test tube)에 회수하였다. 이러한 제조물에서 FRα의 순도는 Laemmli(13)의 방법에 따라 비-환원 조건(non-reducing condition) 하에 SDS(15%) 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)으로 결정하고, 겔은 Coomassie brilliant blue로 단백질에 대하여 염색하였다. 100 % 순수한 것으로 보이는 분획물은 모으고 BSA를 기준으로 하는 DC 단백질 검사 키트(Bio-Rad Richmond, CA)를 이용하여 단백질 농도의 결정을 수행하였다(14). 정제된 FRα는 적은 분량으로 -25 ℃에서 보관하였다.

b) 친화성 측정

표적 단백질은 결합 동역학(binding kinetics)을 결정하기 위하여, C5 BIAcore 센서칩(sensorchip) 상에 입히고 여러 농도의 양쪽 항체 단편을 이용하였다. 특히, 재조합 FR은 10 mM 아세트산나트륨(sodium acetate), pH 4.8에서 0.6 ㎍/㎖의 항원 농도를 갖는 아민 결합 키트(amine coupling kit)(Pharmacia)를 이용하여 CM5 센서칩에 공유 결합시켜 280 RU의 표면을 산출하였다. 잔여 활성화된 기는 35㎕ 에탄올아민(ethanolamine)(1.0 M pH 8.5)의 주입으로 차단하였다. 겉보기 동역학 해리 속도 상수(apparent kinetic dissociation rate constant)(K_off)는 wizard 프로그램을 이용하여, 50 ㎕/min의 완충액 유속(buffer flow rate)으로, 200 nM 내지 3.125 nM의 항체 포화 농도 하에 산정하였다. 평가는 최소한 30분 동안 수행하였다. 이후, 100 mM 글리신 완충액 pH 2.7로, 센서칩에 결합된 잔여 항체의 분리를 수행하였다.

개별 친화성은 결합 곡선(binding curve)으로부터 추정하였다. C4와 AFRA 둘모두 고정된 항원에 결합할 수 있었다. 하지만, AFRA의 산정된 K_D(43.9 nM)은 C4의 K_D(168 nM)보다 3배 이상 낮았는데, 이는 더욱 높은 친화성을 지시한다. 결과는 도 3에 보고된다. AFRA 단위체의 결합 동역학(binding kinetic)은 매우 높은 결합 속도(association rate)뿐만 아니라 상승된 해리 상수(dissociation constant)를 보이고, 이는 때때로, 방사성면역요법에 수임된 항체에서는 단점이 될 수 있는데, 그 이유는 일단 항체가 종양에 결합하면, 효과적인 종양 조사(tumor irradiation)를 위하여 장기적인 지속 효과가 필수적이기 때문이다.

3. 자연 이합체 F(ab') ₂ 의 생산 및 F(ab') ₂ 의 시험관내 결합 특성:

a) 자연 이합체화

AFRA Fab의 해리 상수를 늦추고 단편 결합성을 더욱 증가시키기 위하여, 이러한 Fab 단편의 이합체화를 결정하였다. 이를 위하여, 감마 1 인간 집단의 고유 힌지 서열에 상응하는 펜타(penta) 펩티드 DKTSC를 AFRA 중쇄와 C4 중쇄 둘 모두의 카르복시 말단에 추가하여 Fab'(즉, 힌지 영역에 속하는, 카르복시 말단 상에 추가의 유리 시스테인을 보유하는 Fab)로 명명된 단편을 산출하였다. 이러한 Fab' 형식(format)으로부터, 항체 중쇄(21)의 카르복시 말단에 의도적으로 추가되고 자연 전장 항체 힌지 영역의 첫 번째 시스테인에 상응하는 유리 시스테인 잔기의 자연적인 산화(natural oxidation)에 의해 F(ab')₂ 이합체를 수득하는 것이 가능하였다.

AFRA와 C4 단편 둘 모두 카르복시 말단 중쇄 시스테인을 환원시키는 온화한 조건에서 TCEP(Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)와 함께 항온처리하고, 상기 환원제(reducing agent)를 제거하기 위하여 완충액을 교체하고 pH를 8로 조정하였는데, 여기서 이황화 결합 형성(disulfide bond formation)이 화학적으로 선호되는 것으로 알려져 있다.

이합체는 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography)로 반응 혼합물로부터 분리하였는데, 여기서 이들 이합체는 독특한 피크로서 결정되었다. SDS-PAGE 분석에서, 이합체 제조물은 예상했던 것만큼 동질하지 않았고, 피크는 겔 상에서 여러 밴드(band)를 발생시켰다:

- AFRA 단편의 경우에, 상기 물질의 80%를 차지하는 주요 밴드가 예측된 바와 같이 100 kDa의 범위에서 이동하고, AFRA 이합체로 지정되었다. 전체 물질의 16%를 차지하고, 75 kDa의 겉보기 분자량(apparent molecular weigh)을 갖는 다른 밴드가 탐지되었는데, 이는 다른 Fab 경쇄에 공유 연결된 정상 단위체로 구성된 "이합체"(L₂H)에 기인하였다. 이러한 "이합체"는 두 번째 Fab 단위체의 경쇄의 카르복시 말단 시스테인 상에서 첫 번째 단위체로부터 카르복시 말단 시스테인의 생소한 공격으로 발생하였다. 이러한 경쇄 시스테인은 중쇄와의 이황화 결합에 정상적으로 관여하기 때문에, 임의의 다른 이황화 결합 형성에 이용될 수 없다. 결과의 이합체에서 Fab 중쇄는 분자의 나머지 부분에 더 이상 공유 결합되지 않고 반 데르 발스(Van der Waals) 및 경쇄와 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)을 통하여만 상호작용하기 때문에, 이러한 존재(entity)는 본래 조건에서 수행되는 겔 여과 정제(gel filtration purification) 동안 정상적인 이합체로서 용출되지만, 세정제(SDS) 농도가 분자를 파괴할 만큼 충분한 SDS-PAGE 분석 동안 2개의 밴드로 분리된다(도 4). 실제로, 이 레인(lane) 내에서, L₂H와 함께, 이합체 대용물(dimer surrogate)로부터 얻은 비-공유 결합된 중쇄에 상응하는 다른 밴드가 겔의 바닥에서 탐지될 수 있는데, 이는 전체 물질의 4%를 차지한다.

- C4 Fab의 경우에, 이러한 상황은 놀랍게도 훨씬 나빴는데, 그 이유는 SDS- PAGE에서 주요 밴드(전체 물질의 43%)가 L₂H 화합물에 상응하고, 또는, 다시 말하면, AFRA 반응의 불순물이 C4 이합체화 반응의 가장 풍부한 산물이었기 때문이다. 공유 연결된 이합체는 전체 물질의 29%에 불과하고, SDS는 혼합물의 중쇄 25%를 분리하였다.

이러한 분석은 겔 여과 정제후 획득되는 물질 내에 존재하는 모든 종을 명료하게 확인할 수 있는 LC-질량 조사로 더욱 확증하였다.

본래 수성 조건에서, 정확한 이합체 및 중쇄가 공유 연결되지 않은 "이합체"에 상응하는 불순물 사이에 크로마토그래피 행태(chromatographic behaviour)에서 이들 두 종을 분리하는데 이용될 수 있다. 본 발명자들은 순수한 이합체를 수득하기 위하여 이온 교환 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피로 양쪽 종을 분리하는 시도를 하였지만 실패하였다. 본 발명자들은 또한, 선택적 가열 변성(selective heat denaturation)으로 이합체로부터 불순물을 제거하는 시도를 하였지만 성공하지 못하였다.

b) ELISA: 알파 엽산염 수용체는 F(ab')₂의 결합을 유도한다.

이후, 이들 2개의 F(ab')₂ 이합체는 인간 알파 엽산염 수용체로 형질감염된 A431 세포주 및 인간 난소 암종 세포주 OVCAR3과 IGROVI에서 직접적으로, ELISA 양식으로 결합을 조사하였다.

4 x10⁴개 세포(인간 난소 암종 세포주 OVCAR3(ATCC)과 IGROVI(Dr J.Benard, Institut Gustave Roussy, Villejuif, France) 및 엽산염 수용체 알파로 형질감염 된 인간 표피양(epidermoid) 암종 세포인 A431-FR(17)세포)는 96 웰 양식 평판(format plate)의 각 웰에 접종하고, 합류 단층(confluent monolayer)이 획득될 때까지 성장시켰다. 세포는 실온에서 5분 동안, PBS에 녹인 0.1% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 고정시켰다. 평판은 PBS로 2회, PBS + 0.02% NaN₃에 녹인 0.1M 글리신으로 1회(5분), PBS로 연속적으로 5회, 최종적으로, 1% BSA와 0.02% NaN₃을 포함하는 PBS로 세척하였다. 항체 단편(C4 또는 AFRA)의 연속 희석액은 실온에서 1시간 동안 PBS + 0.03% BSA에서 결합시키고, PBS로 3회 세척하였다.

항체 단편 결합을 드러내기 위하여, PBS + 0.03% BSA에서 1:1000 희석된 항-인간 IgG(Fab 특이적, Sigma) 과산화효소 배합체(peroxidase conjugate)를 이용하였다. ELISA 평판은 실온에서 30분 동안 100 ㎕의 TMB 용액(Sigma)의 첨가로 드러내고, 50 ㎕의 H₂SO₄ 용액(1M)의 첨가로 중단시키고, 450nm에서 판독하였다.

FR-알파로 형질감염된 세포와 비교하여, 빈 벡터로 형질감염된 세포인 A431 모의 세포(mock cell)에서는 신호 없음이 탐지될 수 있기 때문에, AFRA와 C4 항체 둘 모두 알파 엽산염 수용체에 특이적인 것으로 판단되었다. 양쪽 단편은 방사성면역요법 이용에 적합한 효능인 낮은 나노몰(nanomolar) 범위에서 거의 동일한 전체 친화성(overall affinity)을 보였다(하지만, C4 F(ab')₂는 가성 이합체 L₂H로 심하게 오염되기 때문에, 특히 방사성면역요법에서 이의 실제적인 이용은 실현가능성이 없다). 표 I에서는 C4와 AFRA 항체 단편의 F(ab')₂의 K_D 수치의 ELISA 결정을 보고 한다. 이러한 K_D는 ELISA 고원기 신호(plateau signal)의 절반이 달성되는 농도로서 결정되었다.

F(ab')2	KD(nM)
	OVCAR3	A431-FR	IGROV1
C4	11 ± 2	1.2 ± 0.1	118 ± 64
AFRA	26 ± 10	2.5 ± 0.7	57 ± 21

4. Fab'의 화학적 이합체화 및 생체내 결합 특성:

종양 특이성과 국지화를 확증하기 위하여 생체내 검사를 수행하였다. 하지만, F(ab')₂ 분자의 이들 절반을 함께 유지하는 이황화 결합은 급속하게 가수분해되고, F(ab')₂는 Fab 단편으로 신속하게 재전환되고 혈류(blood stream)로부터 제거된다. 이런 이유로, 생체내에서 F(ab')₂ 형식(format)을 유지하기 위하여 아래에 기술된 바와 같은 화학적 이합체화(chemical dimerisation)가 수행된다.

a) 비스말레이미드(BMOE)로 Fab' 단편의 이합체화

생체내에서 F(ab')₂ 형식을 보존하기 위하여, 2개의 Fab'를 연결하여 F(ab')₂를 형성하는 비-가수분해 링커를 이용하였다(21). 더욱 구체적으로, Fab' 단편(22)을 Di Fab 말레이미드(DFM)를 이합체화하기 위하여 비스말레이미드 에탄 링커(BMOE)가 확인되었다. AFRA와 C4 Fab 단편 둘 모두 임상적 개발(clinical development)을 위한 최적 후보를 확인하기 위하여, 이러한 처리를 수행하고 생체내 생체분포(in vivo biodistribution) 실험에서 검사하였다.

Fab'의 DFM으로의 화학적 이합체화는 기존 문헌에서 이미 보고되었다. 이러한 화학적 반응은 말레이미드 헤테로환(heterocycle)과 특이적으로 반응하는 시스테인 잔기의 독특한 능력에 기초한다. 이러한 화학적 반응은 시스테인 잔기와 말레이미드 사이에 화학적 결합의 형성을 유도한다. 본 발명의 경우에, Fab' 단백질 상에서 독특한 유리 시스테인은 Fab' 중쇄의 카르복시 말단에 위치하였다. 이런 이유로, 말레이미드 공격은 엽산염 수용체 결합 부위의 맞은편 부위에서 부위 특이적이었다.

단백질은 중쇄 카르복시 말단 시스테인 잔기를 환원시키기 위하여, 실온에서 5시간 동안 Fab' 몰(mole)당 70 몰(mole)의 TCEP(Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)와 함께 항온처리하였다. TCEP는 MES 40 mM pH 6.0에서 미리 평형화된 HiPrep 탈염 크로마토그래피(Desalting chromatography) 26/10(General Electrics)로 제거하였다. 단백질은 8 ㎎/㎖로 하향 농축하고 부드럽게 교반하면서 RT에서 2.5시간 동안 항온처리하여 Fab 사슬 사이에 존재하는 이황화 결합이 재산화되도록 하였다. 반응 동역학(reaction kinetics)은 RP-HPLC 분석으로 모니터하였다. BMOE 링커(Sigma)를 0.35 링커/단백질의 몰 농도(molar ratio)로 단백질 용액(DMSO에서 1 ㎎/㎖)을 첨가하고, 부드럽게 교반하면서 실온에서 16시간 동안 항온처리하였다.

자연 F(ab')₂를 이전하기 위하여, 반응 혼합물은 실온에서 3.5시간 동안 Fab' 몰당 70 몰의 TCEP로 다시 환원시켰다. 이합체는 MES 40 mM pH 6.0으로 미리 평형화된 HiPrep Sephacryl S-100 HR 칼럼으로 정제하였다. 단백질은 SDS-PAGE 분석하고 Bradford로 정량하였다.

이러한 전략으로, AFRA-DFM은 L₂H 불순물과 거의 동일한 양으로 수득하였다. 하지만, 놀랍게도, 정확한 C4-DFM을 수득하는 것은 거의 불가능하였다. "자연" 이합체를 제거하는 이황화 황원(disulfide reduction)후 겔 여과에 의해, 단지 4%의 C4 분자만 링커와 반응하여 DFM을 형성하는 것으로 예측되었다. 상기 프로토콜을 C4 Fab'로 수회 반복하고 상이한 조건을 이용하였지만, 본 발명자들은 더욱 높은 이합체 농도를 달성할 수 없었다. 이러한 반응은 질량 분석(mass analysis)으로 단계별로 추적하였는데, 상기 반응은 Fab' 상에서 BMOE 분자의 추가후 진행되지 않는 것으로 밝혀졌다. 링커는 아마도, AFRA와 C4 Fab 단편 사이에 유일한 차이를 구성하는 C4의 람다 경쇄로 인하여, 예상치 못한 방식으로 반응하였다. 대조적으로, AFRA 모이어티의 경우에, 동일한 조건에서 이합체화가 항상 관찰되었다(표 II).

항체 단편	전체 이합체화%	SDS-PAGE에 의해 분석된 이합체 피크 산물의 비율
		높은MW	이합체 L2H2	L2H	60 kDa	Fab'	H 없는 사슬
F(ab')2-C4	65	-	29	43	-	-	25
F(ab')2-AFRA	61	-	80	16	-	-	4
DFM-C4	4	3	34	17	17	14	15
DFM-AFRA	44	10	48	17	-	17	8

상기 표로부터, C4에서 예상치 못한 산물이 60 kDa에서 특성화될 수 있지만, 나머지 이합체화 반응이 거의 동일한 산물을 거의 동일한 양으로 산출한다는 것을 확인할 수 있다. 유의한 차이(significant difference)는 반응의 종결 시점에서 획득된 이합체의 %와 관련하여 AFRA와 C4 사이에 관찰될 수 있는데, 이들 분자 사이에 인수(factor) 10 이상이 AFRA를 선호한다.

b) 생검 샘플에서 면역조직화학 검사

앞서 보고된 검사는 형질감염된 세포 또는 난소 암종 세포주에서 시험관내 수행하였다. 하지만, 상이한 세포주는 각각, 수용체의 상이한 당화 변이체(glycosylation variant)를 상이한 양으로 발현한다. 이런 이유로, 생체내 환경에서 Fab 이합체를 검사하는 것이 중요하다. AFRA는 난소 암종으로부터 발현된 알파 엽산염 수용체를 in situ 인식하는 능력에 대하여 면역조직화학 검사에서 검사하였다.

AFRA-DFM 이합체는 시험관내에서 FITC 표지하고, 염색을 위한 생검 샘플을 준비하였다. 구체적으로, 5 ㎜ 두께의 생검 샘플의 동결 절편은 절단하고, 건조시키고, 차가운 아세톤에서 5분 동안 고정시켰다. 아세톤 과량은 PBS(pH 7.4)에서 슬라이드를 세척하고, 이후 자연 건조시킴으로써 제거하였다. 냉동(cryostat) 절편은 실온에서 60분 동안 3% 탈지분유(skimmed milk)에서 3% BSA, 10% 인간 혈청으로 차단하였다. FITC DFM-AFRA 표지된 항체 단편은 3가지 상이한 희석도에서, 4℃에서 하룻밤동안 일차 항온처리하였다.

자가염색물질 완충액(autostainer buffer) 세척을 수행하였다. 항-FITC mAb(토끼 희석도 1:200)를 실온에서 30분 동안 첨가하였다. 슬라이드는 자가염색물질 완충액으로 연속적으로 세척하였다. 이후, 돼지 항-토끼 Ig, 알칼리성 인산분해효소(Alkaline Phosphatase) 결합된 mAb(희석도 1:80)를 실온에서 30분 동안 첨가하였다. 슬라이드는 자가염색물질 완충액으로 세척하였다. 뒤이어, 레드 완충액(Red Buffer)(Vector벡터)을 추가하고, 세척하고, 증류수(distilled water)에서 최종 세척을 수행하였다. 헤마톡실린(Haematoxylin)을 실온에서 15초 동안 첨가하였다. 슬라이드는 맹물(tap water)에서 세척하고, 탈수시키고, 이전하고, 현미경 관찰(microscope observation)을 위하여 검경물을 올려놓았다.

AFRA-DFM은 종양 부위 내로 다시 국지화할 수 있고 주변의 건강한 조직을 염색시키지 않았는데(도 5), 이는 생체내 환경에서 AFRA-DFM 이합체의 특이성을 증명한다.

c) 생체내 생체분포

AFRA-DFM 특이성을 확인한 이후, 생체분포 실험을 수행하였다. 이를 위하여, 거대분자(macromolecule)는 본질적으로, 발열원-없는 임상 등급 시약(pyrogen-free clinical grade reagent)(17)을 이용하여 제조업체(Pierce)에 의해 기술된 바와 같이, Chizzonite 방법을 이용하여 요도젠(iodogen) 미리-코팅된 요오드화 튜브(iodination tube)에 의해 요오드¹³¹로 방사성표지하였다. Chizzonite 방법은 상기 분자의 완전성(integrity)과 기능성(functionality)을 더욱 효과적으로 보존할 수 있다; 실제로, 5mCi/㎎의 고유 활성(specific activity)에서 최종 방사성표지된 산물은 최소한 65%의 평균 면역반응성(mean immunoreactivity)을 보였다. ¹³¹I-표지된 AFRA-DFM은 동물 혈액 내로 주입하였다.

미리 결정된 여러 주입후 시점에, 동물은 희생시키고, 장기는 분리하고 칭량하고 계산하여 이들 각각에서 방사성 축적과 제거의 동역학을 결정하였다. 정상 조직은 동물 피부 아래에 미리 이식된 종양과 대비하여, 참고(reference)로서 이용되었다.

더욱 구체적으로, 암컷 CD1 nu/nu 생쥐(무흉선)는 Charles River Laboratories(Calco, Italy)로부터 5-6주령에 구입하였다. 1주간의 순화(acclimatization)후, 생쥐는 0.1 ㎖의 0.9% NaCl에서, 인간 엽산염 수용체 알파로 형질감염된 3.5x10⁶개 A431세포, 또는 A431 모의 세포로 피하 이종이식하였다. 종양 세포 주입후 2주 내지 3주 시점에, 생쥐는 군별로 무작위 분할하고, 방사성표지된 항체 단편(¹³¹I-DFM-AFRA 5.3)으로 측면 꼬리 정맥(lateral tail vein) 내에 정맥내 주입하였다. 상기 실험은 이러한 방사성동위원소(radioisotope)로 수행하였고, 상세는 하기 표 III에 보고된다:

조사된 이종이식 종양	A431FR
시간당 군 크기	4
고유 활성 (mCi/㎎)	5.0
총 주입된 용량(μCi)/동물	30.0
총 주입된 용량(㎍)/동물	6.0
생체분포에 대한 평가된 시점 a.i.(h)	1, 3, 6, 15, 24, 48
약물동역학에 대한 평가된 시점 a.i.(h)	10분, 30분, 1, 3, 6, 15, 24, 48

d) 방사성-국지화(adio-localization).

절제(dissection), 종양과 다른 조직/장기(비장, 신장, 간, 소변이 포함된 방광, 흉골(sternum), 심장과 근육)는 회수하고 건조전 칭량(wet-weight)하였다. 각 조직과 연관된 방사성은 내부 기준(internal standard)(5와 10 ㎕의 주입된 용액)을 포함하는 감마 카운터(gamma counter)로 평가하였다.

결과는 도 6에 제시되고, 조직 g당 주입된 용량의 비율(%ID/g)로서 표시되고, 방사성 붕괴(radioactivity decay)에 대하여 보정된다. 이러한 방식으로 규격화(normalization)는 장기 또는 동물의 직접적인 비교를 가능하게 한다. 방사성면역요법의 경우에, 이상적인 분자는 종양 내에서 긴 지속 시간(lasting time) 및 건강한 조직 내에서 가능한 최소의 배경과 함께, 높은 축적을 나타낼 것이다.

이러한 생체분포 실험의 결과는 AFRA-DFM이 종양 내에서 특이적으로 축적된다는 것을 증명한다. 방광과 소변에서 상응하는 상승된 수치는 예측된 DFM 배출(excretion)과 충분히 상관하고, 해독 경로(detoxification pathway)를 확인시킨다. 예측된 바와 같이, DFM은 종양 내에 축적되는데, 주입후 6시 시점에, 이의 농도는 다른 장기에서 측정된 농도를 초과하기 시작하였다.

5. 방사성표지된 AFRA-DFM의 생체내 효능의 원리 증명

방사성표지된 항체 단편 ¹³¹I-DFM-AFRA이 FR을 비정규 장소에서 발현하는 종양(A431FR) 내에 특이적으로 축적되는 것으로 증명되었기 때문에, 종양 성장을 통제하는 이의 능력을 평가하였다. 총 주입된 용량은 약물동역학에 따라 규정되었다. 거대분자는 요오드¹³¹로 방사성표지하고, 종양 세포가 피하 이식된 동물에서 혈류 내로 주입하였다.

더욱 구체적으로, 암컷 CD1 nu/nu 생쥐(무흉선)는 Charles River Laboratories(Calco, Italy)로부터 7주령에 구입하였다. 1주간의 순화(acclimatization)후, 생쥐는 0.1 ㎖의 0.9% NaCl(염수)에서, 인간 엽산염 수용체 알파로 형질감염된 3.5x10⁶개 A431세포, 또는 A431 모의 세포로 피하 이종이식하였다. 종양 세포 주입후 1주 시점에, 생쥐는 군별로 무작위 분할하고, 염수에서 0.3 ㎖의 방사성표지된 AFRA-DFM, 또는 대조로서 염수 단독으로 측면 꼬리 정맥(lateral tail vein) 내에 정맥내 주입하였다. 종양 성장은 2-3일 마다 모니터하고, 캘리퍼스(calliper)로 측정하였다; 종양 체적은 아래와 같이 결정하였다: D x d² x 1/6 x π, 여기서 D = 큰 쪽 직경, d = 작은 쪽 직경. 3회 독립된 실험을 수행하였고, 상세는 하기 IV에 보고된다:

조사된 이종이식 종양	A431FR과 A431 모의
독립된 실험의 횟수	3
치료당 군 크기	6-7
평균 고유 활성(mCi/㎎)	4.87 ± 0.57
총 주입된 방사선량(μCi)/동물	1002 ± 80
총 주입된 단백질(㎍)/동물	211 ± 35

결과는 도 11에 제시되고, 염수 단독으로 치료된 대조와 비교하여 종양 성장의 비율로서 표시된다. ¹³¹I로 방사성표지된 AFRA-DFM은 1 mCi/생쥐의 평균 용량으로 종양 보유 생쥐에 주입하였다. 종양 성장은 2-3회 주입이후 마다 모니터하였다. 3회 독립된 실험에서 기록된 종양 성장 지연의 결과는 도 11에서 개별 대조와 비교하여 종양 성장의 평균 비율로서 보고된다. 각 실험에서, 각 치료된 군, 다시 말하면, A431 FR 또는 A431 모의에서 평균 체적(mean volume)은 개별 대조군의 평균 체적과 비교하였다. 이들 효능 실험의 결과는 방사성표지된 AFRA-DFM이 목적의 표적 항원을 발현하는 종양(A431FR)의 성장을 특이적으로 지연시키지만 무관한 종양(A431 모의)의 성장을 지연시키지 못하고, 종양 감소의 비율이 치료후 11일과 16일 시점 모두에서 유의하다는 것을 증명한다(각각, p=0.006과 p=0.05).

6. i.p. 종양으로서 성장하는 난소 암종 세포 상에서 방사성표지된 AFRA-DFM의 국지화

i.v. 주입후 방사성표지된 항체 단편 ¹³¹I-DFM-AFRA가 FR을 비정규 장소에서 발현하는 종양(A431FR) 내에 특이적으로 축적되고 상기 종양의 성장을 통제할 수 있는 것으로 증명되었기 때문에, 엽산염 수용체를 자연적으로 과다 발현하는 난소 암종세포에 국지화하는 이의 능력을 평가하였다. ¹³¹I-DFM-AFRA는 인간 상피 난소암의 자연적인 성장과 파종(dissemination)을 모방하는 모형인, 난소 암종 세포가 복강내 이식된 동물에서 복강(peritoneal cavity) 내에 주입하였다.

더욱 구체적으로, 암컷 CD1 nu/nu 생쥐(무흉선)는 Charles River Laboratories(Calco, Italy)로부터 7주령에 구입하였다. 1주간의 순화(acclimatization)후, 생쥐는 0.3 ㎖의 0.9% NaCl(염수)에서, 인간 엽산염 수용체 알파를 과다 발현하는 8-10x10⁶ IGROV1 세포로 복강내 이종이식하였다. 복수(ascite) 형성이 명백해지면(종양 세포 주입후 14-20일), 방사성표지된 AFRA-DFM를 0.3 ㎖의 염수에 담아 복강내 투여하고, 생쥐는 군별로 무작위 분할하고, 상이한 시점에서 복수, 복막(peritoneum)에 붙어 성장하는 고형 종양 덩어리 및 다른 조직/장기(혈액, 신장, 간과 근육)는 회수하고 건조전 칭량하였다. 복수는 원심분리하고, 작은 덩어리로 만들어진 복수 종양 세포는 유체로부터 분리하고 개별적으로 계산하였다. 각 조직과 연관된 방사성은 내부 기준(internal standard)(5와 10 ㎕의 주입된 용액)을 포함하는 감마 카운터(gamma counter)로 평가하였다. 3회 독립된 실험을 수행하였고, 상세는 하기 표 V에 보고된다:

조사된 이종이식 종양	IGROV1
독립된 실험의 횟수	3
시간당 군 크기	3-4
고유 활성 범위(mCi/㎎)	3.9-9.7
총 주입된 방사선량 μCi/동물(범위)	30-158
총 주입된 단백질 ㎍/동물(범위)	3.6-40
생체분포에 대한 평가된 시점(h)	1, 3, 6, 15, 24

결과는 도 12에 제시되고, 조직 g당 주입된 용량의 비율(%ID/g)로서 표시되고, 방사성 붕괴(radioactivity decay)에 대하여 보정된다. 이러한 방식으로 규격화(normalization)는 장기 또는 동물의 직접적인 비교를 가능하게 한다. 이들 실험의 결과는 방사성표지된 AFRA-DFM이 복수 내에 존재하는 난소 암 세포(IGROV1)의 표면에 특이적으로 결합하고, 방사성표지된 AFRA-DFM이 최대 15시간 동안 상기 세포 표면과 고형 종양 덩어리 상에 존속한다는 것을 증명한다.

7. i.p. 종양으로서 성장하는 난소 암종 세포에 대한 방사성표지된 AFRA-DFM의 효능

¹³¹I-DFM-AFRA가 i.p. 투여후 FR을 자연적으로 발현하는 종양(IGROV1) 내에 특이적으로 축적될 수 있는 것으로 증명되었기 때문에, 난소 암종의 복강내 종양 파종(tumor dissemination)을 통제하는 이의 능력을 평가하였다. ¹³¹I-DFM-AFRA는 항체 단편 투여전 2-4일 시점에 난소 암종 세포가 복강내 이식된 동물에서 복강 내로 주입하였다.

더욱 구체적으로, 암컷 CD1 nu/nu 생쥐(무흉선)는 Charles River Laboratories(Calco, Italy)로부터 7주령에 구입하였다. 1주간의 순화(acclimatization)후, 생쥐는 0.3 ㎖의 0.9% NaCl(염수)에서, 인간 엽산염 수용체 알파를 과다 발현하는 8-10x10⁶개 난소 암종 세포(IGROV1 또는 OVCAR3)로 복강내 이종이식하였다. 종양 세포 주입후 2일 또는 4일 시점에, 생쥐는 군별로 무작위 분할하고, 염수에서 0.3 ㎖의 방사성표지된 AFRA-DFM, 또는 대조로서 염수 단독으로 복강내 주입하였다. 종양 성장은 2-3일 마다 모니터하고, 칭량하고, 복수 형성 또는 고형 i.p. 덩어리 발생을 모니터하였다. 동물 생존을 기록하였다. 2회 독립된 실험을 수행하였고, 상세는 하기 표 VI에서 보고된다:

조사된 이종이식 종양	IGROV1 또는 OVCAR3
독립된 실험의 횟수	2
치료당 군 크기	8-9
고유 활성 평균(mCi/㎎)	4.3
총 주입된 방사선량(μCi)/동물	1.004
총 주입된 단백질(㎍)/동물	250

결과는 도 13에 제시되고, 생존 곡선(survival curve)으로서 표시된다. 생존에서 증가는 로그-랭크 검사(log-rank assay)로 평가하였다. 이들 실험의 결과는 복강에 종양 이식후 4일 시점까지 주입된 방사성표지된 AFRA-DFM이 종양 성장을 유의하게 지연시키고, 따라서 양쪽 정위(orthotopic) 종양 모형 모두에서 동물 생존을 연장시킬 수 있음을 증명한다(각각, IGROV1과 OVCAR3 모형에서 p=0.0014와 p<0001).

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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asn Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ile Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Met Asp Val Trp Gly Lys 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Phe Leu Gly Ile Asn Leu Ile His 1 5 10 15 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gln Ala Ser Asn Lys Asp Thr 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Leu Gln Ser Lys Asn Phe Pro Pro Tyr Thr 1 5 10 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Tyr Ala Met Ile 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Arg Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 9 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys <210> 10 <211> 257 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val 1 5 10 15 Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu 20 25 30 Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly 35 40 45 Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala 50 55 60 Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr 65 70 75 80 Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys 85 90 95 Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn 100 105 110 Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg 115 120 125 Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu 130 135 140 Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp 145 150 155 160 Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln 165 170 175 Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile 180 185 190 Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg 195 200 205 Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu 210 215 220 Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala 225 230 235 240 Ala Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu 245 250 255 Ser <210> 11 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala 1 5 10 15 Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln 20 25 30 Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln 35 40 45 Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His 50 55 60 Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr 65 70 75 80 Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val 85 90 95 Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys 100 105 110 Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys 115 120 125 Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys 130 135 140 Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr 145 150 155 160 Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser 165 170 175 Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro 180 185 190 Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala 195 200 205 His His His His His His 210 <210> 12 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr 20 25 30 Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ala Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Leu Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Gly Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 1

Claims (52)

1. 엽산염 수용체-알파(folate receptor-alpha, FRα)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편에 있어서,

   상기 항체 또는 이의 단편은 경쇄 및 중쇄를 포함하는 Fab 단편이고,

   상기 경쇄는 가변 영역(variable region)(V_L) 및 불변 영역(constant region)(C_L)을 포함하고,

   상기 중쇄는 가변 영역(V_H) 및 제1 불변 영역(C_H1)을 포함하며,

   상기 V_L은 하기의 아미노산 서열을 포함하고,

   - RASESVSFLGINLIH (SEQ ID NO: 3)

   - QASNKDT (SEQ ID NO: 4)

   - LQSKNFPPYT (SEQ ID NO: 5)

   상기 C_L은 카파(kappa) 불변 영역이고,

   상기 V_H는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하며,

   상기 C_H1은 IgG인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 경쇄는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
3. 제 1 항에 있어서,

   완전 인간 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
4. 제 1 항에 있어서,

   단클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
5. 제 1 항에 있어서,

   Fab' 단편이고, 여기서 상기 중쇄는 이합체용 힌지 영역을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
6. 제 1 항에 있어서,

   세포독성제 또는 마킹제로부터 선택되는 작동체 모이어티(effector moiety)에 연결되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
7. 제 6 항에 있어서,

   상기 세포독성제는 방사성핵종(radionuclide)인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
8. 제 7 항에 있어서,

   상기 방사성핵종은 ¹³¹I, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁸Re 및 ⁹⁹Tc로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
9. 제 5 항의 Fab' 단편 두 개가 공유결합으로 연결된 것을 특징으로 하는 이합체.
10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에서 정의된 항체 또는 이의 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
11. 전사 조절 신호(transcription regulatory signal)에 작동 가능하게 연결되는 제 10 항의 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
12. 제 11 항의 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
13. 제 12 항에 있어서,

    대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
14. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에서 정의된 항체 또는 이의 단편, 및 제약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 난소암종 치료용 제약학적 조성물.
15. 제 14 항에 있어서,

    상기 항체 또는 이의 단편은 세포독성제 또는 마킹제로부터 선택되는 작동체 모이어티(effector moiety)에 연결되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
16. 제 15 항에 있어서,

    상기 상기 세포독성제는 방사성핵종(radionuclide)인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
17. 제 16 항에 있어서,

    상기 방사성핵종은 ¹³¹I, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁸Re 및 ⁹⁹Tc로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
18. 제 15 항에 있어서,

    화학치료제(chemotherapeutic agent) 및 방사성치료제(radiotherapeutic agent)로 이루어진 군에서 선택되는 치료제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
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