CN117187394A - 一种非小细胞肺癌的生物标志物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种非小细胞肺癌的生物标志物及应用，属于疾病诊断和治疗技术领域。本发明提供了一种在非小细胞肺癌中高表达的环状RNA circ1681，相比于正常的人支气管上皮细胞，circ1681在多种非小细胞肺癌细胞系中高表达。与癌旁对照组织相比，circ1681在非小细胞肺癌组织中显著高表达，因此可以作为生物标志物应用于非小细胞肺癌的诊断中。通过抑制circ1681的表达有利于有效抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和生长，促进凋亡，实现抗肿瘤作用。本发明还提供了circ1681作为治疗靶点在制备预防和/或治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。
Description
技术领域
本发明属于疾病诊断和治疗技术领域，具体涉及一种非小细胞肺癌的生物标志物及应用。
背景技术
癌症是全球人类健康的主要威胁之一，其中肺癌的发病人数和死亡人数均居恶性肿瘤排行之首。原发性肺癌通常分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)，其中非小细胞肺癌占所有肺癌的80％～85％。由于缺乏明显的症状，很多患者确诊时已是中晚期，失去了最佳诊疗机会。尽管目前手术治疗、化疗药物、免疫疗法等都有所改进，但是目前非小细胞肺癌的五年生存率仍然较低，亟需寻找更加敏感的非小细胞肺癌诊断标志物及治疗靶点。
环状RNA(circRNA)是一类无5'端帽子和3'端polyA尾的通过反向剪接形成的环形RNA，早期被认为是错误剪接的产物且没有生物学功能。近年来，随着高通量测序技术和生物信息学的发展，研究发现circRNA的生物学功能可分为四个方面：充当miRNA海绵、结合蛋白质、调控转录过程、甚至编码蛋白质。目前研究表明，circRNA在多种肿瘤中都发挥了关键作用，有望成为多种疾病的新型诊断标志物及治疗靶点。目前，用于非小细胞肺癌快速诊断的环状RNA有相关报道，但大部分是由多种环状RNA的组合作为鉴别非小细胞肺癌的标志物(CN112375826A和CN108148912A)，另外还有一些采用单独的环状RNA进行非小细胞肺癌诊断的报道，但其仅仅用于早期筛查与诊断，对于作为精准治疗的分子靶点来实现非小细胞肺癌的防治并未有相关的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种非小细胞肺癌的新型生物标志物。环状RNAcirc1681不仅能够用于非小细胞肺癌的早期筛查和诊断，而且可以通过靶向该位点实现非小细胞肺癌的有效治疗。
本发明提供了环状RNA circ1681作为生物标志物在制备早期筛查或诊断非小细胞肺癌的试剂或试剂盒中的应用。
本发明提供了一种用于检测非小细胞肺癌的生物标志物circ1681的试剂，包括核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的反向引物。
本发明提供了所述用于检测非小细胞肺癌的生物标志物circ1681的试剂在制备早期筛查或诊断非小细胞肺癌的试剂盒中的应用。
本发明提供了circ1681作为治疗靶点在制备预防和/或治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。
优选的，所述药物为包含抑制或敲除circ1681的表达的活性成分的药物。
本发明提供了一种抑制或敲除circ1681的表达的试剂在制备预防和/或治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。
优选的，所述试剂包括抑制circ1681表达的siRNA、shRNA和sgRNA中的一种或几种。
优选的，抑制circ1681表达的siRNA包括si-circ1681-1和/或si-circ1681-2；
所述si-circ1681-1是由核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示序列互补配对得到；
所述si-circ1681-2是由核苷酸序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示序列互补配对得到。
优选的，所述药物为抑制非小细胞肺癌增殖、迁移、侵袭、生长和/或促进非小细胞肺癌凋亡的药物。
优选的，所述环状RNA circ1681的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明提供了环状RNA circ1681作为生物标志物在制备早期筛查或诊断非小细胞肺癌的试剂或试剂盒中的应用。本发明首次筛选得到环状RNA circ1681，并实验证明其作为促癌因子在非小细胞肺癌中的作用，为非小细胞肺癌的诊断及相关治疗药物的研发奠定了基础。由于circRNA结构稳定并具有组织特异性，基于本发明发现的circ168开发的非小细胞肺癌诊断和筛查的试剂盒，有助于提高非小细胞肺癌的诊断效率。
本发明提供了circ1681作为治疗靶点在制备预防和/或治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。本发明证实circ1681是治疗非小细胞肺癌的治疗靶点。体内外功能实验的结果显示敲减环状RNA circ1681能够显著抑制非小细胞肺癌的细胞增殖能力、细胞迁移和侵袭能力、肿瘤形成能力，所述环状RNA circ1681抑制剂能够发挥有效杀伤非小细胞肺癌的体内外治疗效果，可用于非小细胞肺癌治疗药物的制备。本发明为非小细胞肺癌的诊断和治疗提供了新的靶点，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为非小细胞肺癌组织差异表达circRNA聚类分析热图；
图2为circ1681的特征结构图；
图3为PCR产物Sanger测序图；
图4为RNase R消化后RNA的表达情况示意图；
图5为circ1681在非小细胞肺癌组织和细胞表达情况示意图，其中A为非小细胞肺癌组织及其配对癌旁组织中circ1681的表达水平，B为非小细胞肺癌患者组织中circ1681的ROC曲线图，C为人支气管上皮样细胞(HBE)和非小细胞肺癌细胞(A549、H1299、PC9)中circ1681表达水平示意图；
图6为抑制circ1681表达对非小细胞肺癌细胞生物学特性的影响结果示意图，其中A为circ1681敲减效率，B为细胞生长曲线结果示意图，C为平板克隆结果示意图，D为迁移结果示意图，E为侵袭结果示意图，F为细胞凋亡结果示意图；
图7为抑制circ1681表达对裸鼠皮下荷瘤的影响结果示意图，其中A为裸鼠皮下荷瘤示意图，B为裸鼠皮下荷瘤体积和重量的定量分析结果示意图，C为肿瘤组织Ki-67染色结果示意图。
具体实施方式
本发明提供了所述circ1681作为生物标志物在制备早期筛查或诊断非小细胞肺癌的试剂或试剂盒中的应用。所述circ1681作为检测目标物来制备试剂或试剂盒。
在本发明中，所述环状RNA circ1681是RAPGEF5基因的第2至第6外显子反向剪切形成，长度为516nt，其对应的cDNA序列如SEQ ID NO：1(ACTCTATCAAGAAGAATATCTAATCCGTACCTTGAACATACGCCTTCC CAGATTTATGGAGAGAATTCTTCTTGTGCAGGAAGAGCATTGAGGAATATTATTATCGTTCAAGCAGCTGACCTGATAAAGGACAGAGTGAACCTCAAGGGGTTTTACAGGAGGAGCTGCGTTGGGTCAGAGCTGGTAGACTGGCTTCTAGAACACTGTCCTTTCGTCCAGTGCAGATCTATGGCCATAGGAGTCTGGCAACTCCTACTGGACATGGGAATTATGTTATCAGTGGACCAGCATCTATACTTTCAAGATACTTATGTTTTCTACCAGTTTTCCTCTGATGAATGTAGCTACTTGTACTGTGAATTTGAAAGAGAAGAAGAATGGCAAAATGGTGTCAAGCTTTTACTGCAACTTGTGCCTCTCATTCCTGCCAGAGGTGGCATCTGTGAACTGTCTCATCAGAAAATTGAAGACTCCGAAGAAAGCAGTGATGAAATTCTTGTGCGTCTAACATCTGCG)所示。
在本发明中，所述circ1681具有结构稳定性强的特点。利用RNase R对circ1681进行消化，相比于线性的β-actin，环状的circ1681具有抵抗RNase R消化的能力，证实circ1681具有闭合环状结构。同时经实验证实，在50对非小细胞肺癌组织及配对癌旁组织中，circ1681在非小细胞肺癌组织中显著高表达，AUC达到0.8076，敏感度86％；与人支气管上皮细胞HBE相比，circ1681在非小细胞肺癌细胞系中高表达。可见，所述circ1681对诊断非小细胞肺癌具有良好的灵敏性和特异性，符合作为生物标志物的标准。
本发明提供了一种用于检测非小细胞肺癌的生物标志物的试剂，为一种用于检测所述circ1681的表达水平的引物；所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：2(TGCGTCTAACATCTGCGACT)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：3(AGGTCAGCTGCTTGAACGAT)所示的反向引物。
在本发明中，所述引物通过qPCR检测实现准确表征circ1681的表达水平。所述qPCR检测的反应程序优选为95℃预变性5min；95℃变性10sec，60℃退火、延伸30s，重复40个循环；最后按95℃15sec，60℃60sec，95℃15sec设置融解曲线采集程序。
本发明提供了所述试剂在制备早期筛查或诊断非小细胞肺癌的试剂盒中的应用。
在本发明中，所述试剂盒还优选包括qPCR扩增的试剂和反转录反应试剂；所述qPCR扩增的试剂包括以下至少一种：2×AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix。所述反转录反应试剂优选包括以下成分：10×RT Mix、HiScript III Enzyme Mix、Oligo(dT)20VN和六碱基随机引物(Random hexamers)。
本发明提供了所述circ1681作为治疗靶点在制备预防和/或治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。
在本发明中，所述药物优选为包含抑制或敲除circ1681的表达的活性成分的药物。
在本发明中，所述circ1681在非小细胞肺癌组织中高表达，且与癌旁组织和人支气管上皮细胞的表达量呈显著性差异，且AUC达到0.8076，敏感度86％。利用siRNA分子抑制circ1681的表达量，使非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力较对照均显著较低，同时生长曲线表明circ1681的表达量降低有效抑制裸鼠体内肿瘤的生长；流式细胞分析表明circ1681的表达量降低促进了细胞的凋亡。可见，circ1681可以作为NSCLC治疗的新靶点用于NSCLC的临床治疗和研究中。
本发明提供了一种抑制或敲除circ1681的表达的试剂在制备预防和/或治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。
在本发明中，所述试剂优选包括抑制circ1681表达的siRNA、shRNA和sgRNA中的一种或几种。抑制circ1681表达的siRNA优选包括si-circ1681-1和/或si-circ1681-2。所述si-circ1681-1优选是由核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示序列互补配对得到。所述si-circ1681-2优选是由核苷酸序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示序列互补配对得到。实验表明，将siRNA转染至非小细胞肺癌细胞中，经RT-qPCR的检测能有效降低circ1681的表达量。
在本发明中，所述药物优选为抑制非小细胞肺癌增殖、迁移、侵袭、生长和/或促进非小细胞肺癌凋亡的药物。在本发明实施例中，细胞生长曲线结果表明siRNA处理能有效降低非小细胞肺癌细胞的生长速度；克隆实验表明，siRNA处理能有效降低非小细胞肺癌细胞的增殖；Transwell迁移实验表明，siRNA处理能有效抑制非小细胞肺癌细胞的迁移；基质胶侵袭实验表明siRNA处理能有效抑制非小细胞肺癌细胞的侵袭；流式细胞检测结果表明，siRNA处理能有效促进非小细胞肺癌细胞的凋亡。同时，裸鼠皮下荷瘤实验表明，circ1681的敲减使裸鼠体内肿瘤体积和重量均小于对照组。Ki-67免疫组化染色的结果显示，Ki-67表达阳性细胞比例降低，表明敲减circ1681后肿瘤细胞增殖能力受到抑制。
下面结合实施例对本发明提供的一种非小细胞肺癌的生物标志物及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
高通量测序筛选非小细胞肺癌组织高表达circRNA
收集3对非小细胞肺癌和癌旁组织进行全转录组测序(委托上海欧易生物医学科技有限公司进行)。
1.环状RNA预测
对于动物，CIRI软件具有灵敏度高和多重筛选降低假阳性的特点，是circRNA预测较为权威的软件。CIRI软件基于BWA比对结果，具体预测过程如下：
(1)通过BWAMEM比对clean reads至参考物种基因组，获得sam文件；
(2)基于xS/HyM(上游)或者xMyS/H(下游)PCC信号检测balanced junctionreads；
(3)基于PEM和GT-AG信号过滤junctionreads；
(4)基于DM算法检测unbalancedjunction reads。
2.计算各个circRNA的RPM值
RPM计算如公式I所示：
RPM＝比对到circRNA的back-splicedjunctions区域的reads数/每个样本测序数据中clean_data的reads数目公式I。
3.circRNA差异分析通过DESeq软件进行
DESeq软件通过检测和修正不同样本间counts数的离散度，可以规避高通量数据具有高离散、不连续、重复样本少等问题，最大程度上避免检测出假阳性差异基因。具体过程如下：
(1)使用estimateSizeFactors函数对counts数进行标准化获得basemean值；
(2)使用nbinomTest函数进行显著性检验，计算差异比较的p Value和foldChange值；
(3)使用FDR错误控制法对p Value进行多重假设检验矫正；
(4)默认差异筛选条件为p Value<0.05且fold Change大于2(或小于0.5)。
4.实验结果
基于上述条件，共筛选出187个非小细胞肺癌中差异表达的circRNA分子，差异表达circRNA聚类分析热图结果如图1所示，其中55个circRNA在非小细胞肺癌组织上调，132个circRNA下调。Circ1681是在非小细胞肺癌上调倍数排名靠前的。
实施例2
circ1681的引物对验证与定量检测
环状RNA circ1681由RAPGEF5基因的第2至第6外显子反向剪切形成，长度为516个碱基。Circ1681的结构特征如图2，对应的cDNA序列信息和SEQ ID NO：1(ACTCTATCAAGAAGAATATCTAATCCGTACCTTGAACATACGCCT TCCCAGATTTATGGAGAGAATTCTTCTTGTGCAGGAAGAGCATTGAGGAATATTATTATCGTTCAAGCAGCTGACCTGATAAAGGACAGAGTGAACCTCAAGGGGTTTTACAGGAGGAGCTGCGTTGGGTCAGAGCTGGTAGACTGGCTTCTAGAACACTGTCCTTTCGTCCAGTGCAGATCTATGGCCATAGGAGTCTGGCAACTCCTACTGGACATGGGAATTATGTTATCAGTGGACCAGCATCTATACTTTCAAGATACTTATGTTTTCTACCAGTTTTCCTCTGATGAATGTAGCTACTTGTACTGTGAATTTGAAAGAGAAGAAGAATGGCAAAATGGTGTCAAGCTTTTACTGCAACTTGTGCCTCTCATTCCTGCCAGAGGTG GCATCTGTGAACTGTCTCATCAGAAAATTGAAGACTCCGAAGAAAGCAGTGATGAAATTCTTGTGCGTCTAACATCTGCG)所示。
在本实施例中，发明人设计了能够特异性扩增circ1681的引物对，所述引物对的核苷酸序列如下：
上游引物F：5’-TGCGTCTAACATCTGCGACT-3’(SEQ ID NO：2)
下游引物R：5’-AGGTCAGCTGCTTGAACGAT-3’(SEQ ID NO：3)
以circ1681为模板，采用上游引物F和下游引物R进行qRT-PCR扩增，检测circ1681的表达水平，实验方法如下：
1.细胞RNA提取
(1)取对数期生长的细胞，弃去培养液，用PBS洗2次，加入1mL的TRIzol裂解液，静置裂解5～10min，收集1.5mL于无RNase的Ep管；
(2)向上述裂解液中加入200μL的氯仿，剧烈震荡15sec，成乳浊液，4℃静置5min；
(3)4℃，12000g离心15min，小心吸取上层水相至一新的Ep管中，加入等体积的预冷异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min；
(4)4℃，12000g离心10min，可见管底有白色絮状沉淀。小心弃去上清，加入1mL75％乙醇(DEPC水配置)，充分洗涤沉淀；
(5)4℃，12000g离心5min，尽量弃去乙醇，在洁净的环境中敞口干燥沉淀2-5min，当沉淀呈半透明薄膜状时，加入适量DEPC水充分溶解RNA。
2.逆转录
(1)去除基因组DNA
在冰上用无RNase的Ep管中配制表1所示混合液(以20μL体系为例)：
表1逆转录反应体系1
| RNase-free ddH2O | 补充至10μL |
| 5×gDNA wiper Mix | 2μL |
| 总RNA | 1μg |
42℃加热2min。
(2)按表2配制第一链cDNA合成反应液
表2逆转录体系2
| 上一步的混合液 | 10μL |
| 10×RT Mix | 2μL |
| HiScript III Enzyme Mix | 2μL |
| Oligo(dT)20VN | 1μL |
| 六碱基随机引物Random hexamers | 1μL |
| RNase-free ddH2O | 4μL |
37℃加热15min；85℃加热5sec。
3.qPCR
(1)按表3在qPCR管中配制如下混合液：
表3 qPCR体系配制
| 2×AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix | 10μL |
| 正向引物(10μM) | 0.4μL |
| 反向引物(10μM) | 0.4μL |
| cDNA | 2μL |
| RNase-free ddH2O | 7.2μL |
(2)PCR扩增流程：①95℃预变性5min；②95℃变性10sec，③60℃退火、延伸30s，②～③步重复40个循环，⑤最后按95℃15sec，60℃60sec，95℃15sec设置融解曲线采集程序。
4.Sanger测序
将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据产物片段大小回收后进行Sanger测序，验证circ1681的环状结构。
5.circ1681的稳定性检测
按表4配制如下混合液：
表4 RNase R实验体系配制
| RNase R组 | Mock组(对照组) | |
| RNA | 2μg | 2μg |
| RNase R | 6U(2U/μL) | 0 |
| 10×buffer | 2μL | 2μL |
| ddH2O | 补至20μL | 补至20μL |
37℃水浴15min，后续定量PCR检测同实施例2方法1-3。
6.实验结果
Circ1681的结构示意图和Sanger测序结果如图2和图3所示，circ1681由RAPGEF5基因的第2至第6外显子反向剪接形成环形结构，且circ1681扩增产物包含特异的反向拼接位点。
RNase R对circ1681和β-actin的消化对比图如图4所示，相比于线性的β-actin，环状的circ1681具有抵抗RNase R的消化，证实circ1681具有闭合环状结构。
在50对非小细胞肺癌组织及配对癌旁组织中检测circ1681的表达情况，qRT-PCR结果表明，circ1681在非小细胞肺癌组织中显著高表达(图5中A)，AUC达到0.8076，敏感度86％(图5中B)；与人支气管上皮细胞HBE相比，circ1681在非小细胞肺癌细胞系中高表达(图5中C)。
实施例3
抑制circ1681表达对非小细胞肺癌增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响
1.细胞转染
(1)取生长状况良好的细胞(A549和PC9)，于转染前18-24h接种于6孔板，使转染前的细胞汇合度达到30％-50％。
(2)取5μL siRNA，加入到含有250μL Opti-培养基的Ep管中，轻柔混匀。其中siRNA为si-circ1681-1(SI-1)或si-circ1681-2(SI-2)；所述si-circ1681-1由SEQ IDNO：4(CUGCGACUCUAUCAAGAAGTT)和SEQ ID NO：5(CUUCUUGAUAGAGUCGCAGTTA)互补配对形成。si-circ1681-2由SEQ ID NO：6(GUCUAACAUCUGCGACUCUTT)和SEQ ID NO：7(AGAGUCGCAGAUGUUAGACTT)互补配对形成。
(3)取5μL LipofectamineTM2000转染试剂，加入到另一含有250μL 培养基的Ep管中，轻柔混匀，室温孵育5min。
(4)混合步骤(2)和(3)中液体，室温孵育20min，加入步骤(1)的6孔板中，补充培养基至2mL，于培养箱中进行转染。4～6h后移除混合物，加入2mL完全培养基。
(5)培养48h后胰酶消化细胞，进行后续实验。
2.RT-qPCR检测细胞中circ1681表达水平
采用实施例2中记载的qRT-PCR扩增的方法检测转染后的细胞中circ1681表达水平。
结果表明，图6中A显示si-circ1681-1(SI-1)和si-circ1681-2(SI-2)处理的细胞较对照组相比，circ1681表达水平有显著的降低(P<0.001)，说明si-circ1681-1(SI-1)和si-circ1681-2(SI-2)有效敲减了细胞中circ1681表达水平。
3.细胞生长曲线
(1)转染后的细胞消化、计数，10000个/孔接种于含有1mL完全培养基的24孔板中，置于细胞培养箱培养。
(2)每隔24h消化1组并进行计数，连续6天。以时间为横坐标，细胞个数为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
4.平板克隆
(1)转染后的细胞消化、计数，1000个/孔接种于含有2mL完全培养基的6孔板中。
(2)置于细胞培养箱中培养8～10天，每隔2～3天换液1次。
(3)待细胞形成肉眼可见细胞群落时，弃去培养基并用PBS洗涤，加入1mL 4％多聚甲醛固定30min后弃去，加入1mL结晶紫染色液染色15min。移除染液，流水清洗至无紫色染液滴下，晾干。
(4)拍照，计数每孔细胞克隆数目。
5.Transwell迁移实验
(1)转染后的细胞胰酶消化，用基础培养基重悬细胞并计数，调整细胞密度为2.5×105个/mL，取200μL加入到Tranwell小室中。
(2)Tranwell小室置于加入600μL完全培养基的24孔板中，置于细胞培养箱培养24h。
(3)弃去培养基并用PBS洗涤，加入1mL 4％多聚甲醛固定30min后弃去，加入1mL结晶紫染色液染色15min。
(4)用棉签小心擦去未迁移的细胞，显微镜下拍照。
6.基质胶侵袭实验
(1)实验前一天，将Matrigel基质胶从-20℃提前放入4℃冰箱过夜，使其从固体状态融化为液体状态。
(2)冰上配制20％Matrigel基质胶，取50μL平铺于小室上层，放置于37℃，30min待基质胶凝固。
(3)转染后的细胞胰酶消化，用基础培养基重悬细胞并计数，调整细胞密度为5×105个/mL，取200μL加入到Tranwell小室中。
(4)Tranwell小室置于加入600μL完全培养基的24孔板中，置于细胞培养箱培养48h。
(5)弃去培养基并用PBS洗涤，加入1mL 4％多聚甲醛固定30min后弃去，加入1mL结晶紫染色液染色15min。
(6)用棉签小心擦去未侵袭的细胞，显微镜下拍照。
7.细胞凋亡实验
(1)转染后的细胞用不含EDTA的胰酶消化。
(2)用冰冷的PBS洗涤细胞2次后，加入1×结合缓冲液，调整细胞浓度为1×106个/mL。
(3)取100μL细胞悬液于流式管中，加入10μL碘化丙啶(20μg/mL)和5μLAnnexinAlexa Fluor 647，混匀。
(4)室温避光孵育15min，加入400μLPBS，用流式细胞仪进行检测。
8.实验结果
细胞生长曲线、克隆形成、迁移、侵袭和凋亡实验结果见图6。SI-1和SI-2转染的NSCLC细胞增殖速度、平板克隆、迁移和侵袭能力远低于对照组(图6中B-E)，流式细胞术结果表明敲减circ1681促进了细胞凋亡(图6中F)。以上结果表明，敲减circ1681能够在体外抑制NSCLC细胞增殖、转移，促进细胞凋亡，circ1681有望成为NSCLC治疗的新靶点。
实施例4
抑制circ1681表达对裸鼠皮下荷瘤的影响
取生长状态良好的A549细胞，分别转染对照和circ1681的siRNA(SI-1)，消化转染后的细胞并计数，按1×107个/只的细胞数注射到4-6周龄雌性裸鼠皮下，构建裸鼠皮下荷瘤模型。
结果显示，circ1681敲减后裸鼠体内肿瘤体积和生长速度均小于对照组(图7中A-B)。Ki-67免疫组化染色的结果显示，Ki-67表达阳性细胞比例降低(图7中C)，提示敲减circ1681后肿瘤细胞增殖能力受到抑制。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.环状RNA circ1681作为生物标志物在制备早期筛查或诊断非小细胞肺癌的试剂或试剂盒中的应用。
2.一种用于检测非小细胞肺癌的生物标志物circ1681的试剂，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的反向引物。
3.权利要求2所述用于检测非小细胞肺癌的生物标志物circ1681的试剂在制备早期筛查或诊断非小细胞肺癌的试剂盒中的应用。
4.circ1681作为治疗靶点在制备预防和/或治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述药物为包含抑制或敲除circ1681的表达的活性成分的药物。
6.一种抑制或敲除circ1681的表达的试剂在制备预防和/或治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述试剂包括抑制circ1681表达的siRNA、shRNA和sgRNA中的一种或几种。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，抑制circ1681表达的siRNA包括si-circ1681-1和/或si-circ1681-2；
所述si-circ1681-1是由核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示序列互补配对得到；
所述si-circ1681-2是由核苷酸序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示序列互补配对得到。
9.根据权利要求4～8中任意一项所述应用，其特征在于，所述药物为抑制非小细胞肺癌增殖、迁移、侵袭、生长和/或促进非小细胞肺癌凋亡的药物。
10.根据权利要求1、3、4、6～8中任意一项所述应用，其特征在于，所述环状RNAcirc1681的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
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