CN116808215A - 一种linc02159作为治疗靶点在制备防治非小细胞肺癌的药物中的应用 - Google Patents

一种linc02159作为治疗靶点在制备防治非小细胞肺癌的药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116808215A
CN116808215A CN202310446043.1A CN202310446043A CN116808215A CN 116808215 A CN116808215 A CN 116808215A CN 202310446043 A CN202310446043 A CN 202310446043A CN 116808215 A CN116808215 A CN 116808215A
Authority
CN
China
Prior art keywords
linc02159
lung cancer
small cell
cell lung
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310446043.1A
Other languages
English (en)
Inventor
王茂叶
王天琦
杨秋蓉
许静
于丹
张徐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu University
Original Assignee
Jiangsu University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu University filed Critical Jiangsu University
Priority to CN202310446043.1A priority Critical patent/CN116808215A/zh
Publication of CN116808215A publication Critical patent/CN116808215A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供了LINC02159作为治疗靶点在制备防治非小细胞肺癌的药物中的应用，属于生物医学技术领域。本发明通过研究发现LINC02159是一个与非小细胞肺癌发生发展密切相关的基因；相比于癌旁组织，LINC02159在非小细胞肺癌组织中高表达。通过对LINC02159的表达进行抑制，可以显著抑制非小细胞肺癌体外、体内的细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭等恶性进程，促进细胞凋亡。本发明为非小细胞肺癌的治疗提供了一个新的药物治疗靶点，有利于后续的药物研发、临床治疗，为非小细胞肺癌患者提供科学化、精准化和个性化的诊断和治疗方案。

Description

一种LINC02159作为治疗靶点在制备防治非小细胞肺癌的药 物中的应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及LINC02159作为治疗靶点在制备防治非小细胞肺癌的药物中的应用。
背景技术
肺癌是严重危害人类生命健康的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居恶性肿瘤前列。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是临床上最常见的肺癌亚型，但是一些患者早期症状不明显，确诊时已处于晚期，失去最佳治疗机会。NSCLC的治疗手段主要有手术切除、放化疗、靶向治疗、免疫治疗等，虽然有多种治疗方案的选择，但是由于肺癌确诊较晚、异质性较强，肺癌患者的总体生存率依旧较低，因此，迫切需要寻找新的NSCLC诊断标志物和治疗靶点。
在人类基因组中能编码蛋白的RNA仅占2％，其余为非编码RNA，长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA。研究发现lncRNA能够在表观遗传学调控、转录调控和转录后调控等多种层面调控基因的表达，并且参与肿瘤发生、增殖、转移、耐药等多种恶性过程。随着高通量技术在生命科学领域的普遍应用，越来越多的新型lncRNA被发现，但是lncRNA在肿瘤中的作用还有待完善。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种LINC02159作为治疗靶点在制备防治非小细胞肺癌的药物中的应用，通过抑制LINC02159的表达能有效抑制非小细胞肺癌的细胞增殖、迁移、侵袭，促进非小细胞肺癌的细胞凋亡，从而达到治疗非小细胞肺癌的目的。
本发明提供了一种长链非编码RNALINC02159作为治疗靶点在制备防治非小细胞肺癌的药物中的应用。
优选的，所述长链非编码RNA LINC02159通过正调控方式影响非小细胞肺癌的发生发展。
本发明提供了一种长链非编码RNALINC02159表达抑制剂在制备防治非小细胞肺癌的药物中的应用。
优选的，所述长链非编码RNA LINC02159表达抑制剂包括靶向LINC02159的siRNA。
优选的，所述靶向LINC02159的siRNA包括以下一种或几种：si-LINC02159-1、si-LINC02159-2和si-LINC02159-3；
所述si-LINC02159-1是由核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的正义链1和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反义链1组成；
所述si-LINC02159-2是由核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的正义链2和核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的反义链2组成；
所述si-LINC02159-3是由核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的正义链3和核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的反义链3组成。
优选的，所述药物具有以下至少一项抑癌作用：
1)抑制非小细胞肺癌细胞增殖；
2)抑制非小细胞肺癌细胞迁移；
3)抑制非小细胞肺癌细胞侵袭；
4)促进非小细胞肺癌细胞凋亡；
5)抑制非小细胞肺癌体内生长。
优选的，所述非小细胞肺癌细胞包括以下至少一种细胞：A549、H1299和PC9。
本发明提供了一种长链非编码RNALINC02159作为诊断标志物在制备诊断非小细胞肺癌的试剂或试剂盒中的应用。
优选的，检测所述长链非编码RNALINC02159的试剂包括核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的反向引物。
优选的，所述长链非编码RNALINC02159的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供了一种长链非编码RNALINC02159作为治疗靶点在制备防治非小细胞肺癌的药物中的应用。本发明首次证明LINC02159参与非小细胞肺癌中的调控，并且通过抑制LINC02159的表达，抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移、侵袭和体内肿瘤生长，同时促进非小细胞肺癌细胞凋亡。LINC02159为非小细胞肺癌治疗提供了一个新的药物靶点，有助于后续的药物研发、临床治疗等，具有重要的科学意义。
本发明还提供了一种长链非编码RNALINC02159作为诊断标志物在制备诊断非小细胞肺癌的试剂或试剂盒中的应用。本发明针对非小细胞肺癌和癌旁组织进行lncRNA表达谱分析，发现LINC02159在非小细胞肺癌高表达，并通过临床样本和细胞系验证组织、细胞水平上LINC02159表达量情况，结果表明，与癌旁组织相比，LINC02159在非小细胞肺癌组织中显著高表达；且与人支气管上皮细胞HBE相比，LINC02159在非小细胞肺癌细胞系中高表达。这表明所述LINC02159可作为诊断标志物在制备诊断非小细胞肺癌的试剂或试剂盒中的应用。
附图说明
图1为非小细胞肺癌和癌旁组织的lncRNA的聚类分析热图；
图2为NSCLC中LINC02159表达水平示意图，其中A为非小细胞肺癌组织及其配对癌旁组织中LINC02159的表达水平，B为人支气管上皮样细胞(HBE)和非小细胞肺癌细胞(A549、H1299、PC9)中LINC02159表达水平示意图；
图3为抑制LINC02159表达对非小细胞肺癌细胞生物学特性的影响结果示意图，其中A为LINC02159敲减效率，B为细胞生长曲线结果示意图，C为平板克隆结果示意图，D为迁移结果示意图，E为侵袭结果示意图，F为细胞凋亡结果示意图；
图4为抑制LINC02159表达对裸鼠皮下荷瘤的影响结果示意图，其中A为裸鼠皮下荷瘤示意图，B为裸鼠皮下荷瘤重量和体积的定量分析结果示意图，C为肿瘤组织HE染色及免疫组织化学结果示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种长链非编码RNALINC02159作为诊断标志物在制备诊断非小细胞肺癌的试剂或试剂盒中的应用。
在本发明中，所述长链非编码RNALINC02159的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1(gcuaaugcuguauauauggcuuacguucaggcucuccugugcccagagagagaauaaagccauguugaaaccguccacaauugcuuaaguguuuuuccagcuaccgccacucgccugacuccccuuggaccucaguuagaaccugacauuuggcgccaugaacagauccugagauuuagaagcaguggcgcccuucuuguggcaacauuuggcugcaugugguugggccaucaacaaauccaagguccaacagccuggauuaucugcgagauuccugggaguuaucuggucagguugacaugcuccaacugcauuguggacugggcccacaccuucacugaggugaccaauguuuccaacuguuggaucugcaccauccuuccaggagcagcugcagauggcuugccuuggcacauacauucagcaucugcagagaaauggacauggcuggagacuuugagucccauggccgacaccuggaaugcgacagggcaagcugcagacaaagaauuccgcaagacccauagcaugccugccccaucuugccuguagcauuuaugaugggaggggcuggcuaguggggaaauauguaguacccccagcucagggacggcagugcauagaggaacacugggguaacaccacugugggauggcuacccugcaaggccuguguaaacauaacacaugucaccacaccgaagguaugguggaacaugcggccccacccaaggucaggcccugauggauuuuaugaccccugggaguuuaugggucauugaggacacaggguguccuuaccuaccagcagacuggccuggacguuguaccugaguuuggccuuacguaccuggcacuguucucccugcuuugcccagaugccagaauaacugggaggugcuaugcucucacuuuuugugagugcgaugaggccccuggugguucuucaccuuggaagugacuaucccuggaguggguaucauaacuguaaaagcagaaguuacugcuuuugcagagcacaccgcucgggcucugaaucacacccgaggggcccuccuccugucaauugaugcaguugaucagaucaggaaggugguguugcaaaaccgaauggccuuagacauaguaacugcugcccaaggaggcaucuguacccuuuuaggaacacaauguuguaccuuuaucccugacagucagcagaacauaacagcagcccuucaaggggucucaugggagaauaaguuucuagggagccuuacugaugaaccccugcagagaaggaggggcaucccuaggcucuggccuaugcugggccccaauaguuauaaauagcguaacugggauccuaguagcuguugcucucuguauuguuauuguggguuauagauucagggcucugcuguaugggcacaugucucugcccggaggacacucuuggccuagggaguggaggguaaggaaaauggcugcacuuuagucaggaauaagcugaggcagccuuccaaagcagcauaacucaguggguuuggagcacaggugcacagcccugcacauuauguaaccacaccaugugaggugcauuaggugaucacacacgugcgcucauguuuugcucagaaccacuauugucuguaaaagguaugguuacccuacuaaagcuguacauauggcucacccccaggcucacucaugcccagacucacucgcacuuagagagaguaaagccaagucaaaacugucuacgauuccuugaguguuucuccagcuacccgccacucaccccaccaacuccccucggaccccaguuaaaaccugacaccaccccuuucccuguaagaggagugcauuccugcccacugccaugcagcuuucuauguccccagugggaggcccaugcaucccugucccaucggcuuuuggcuuugaccaaaggaacaaaagcagacaugacagaggccacauccaaguagaaacucuaagaggcaggacagguguccacaguacuccuggucuuucuuucugcuaugagaauagcauaucccacuuaggaagcuguuccuucagcuuaagucccugaaugggaaacugcugcagccaaagaaagcuucagucaaugcauagucucccuuuaauaaaccuugugguagaaa)所示。鉴于实验结果显示长链非编码RNA LINC02159在非小细胞肺癌和癌旁组织中显著差异表达，并且LINC02159表现为极高的上调表达，并且采用临床样本经qRT-PCR验证，与癌旁组织和人支气管上皮细胞相比，非小细胞肺癌组织、细胞中LINC02159表达量显著提高。这表明通过检测长链非编码RNALINC02159的表达量能够有效诊断非小细胞肺癌，具有良好的特异性和灵敏性，可以作为检测标志物来制备诊断非小细胞肺癌的试剂或试剂盒。
在本发明中，检测所述长链非编码RNALINC02159的试剂优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO:8(CCACCCCTTTCCCTGTAAGAG)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:9(TTGGTCAAAGCCAAAAGCCG)所示的反向引物。同时检测时还包括内参基因检测引物。所述内参基因优选为U6。所述内参基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:10(CTCGCTTCGGCAGCACA)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:11(AACGCTTCACGAATTTGCGT)所示的反向引物。
在本发明中，所述试剂或试剂盒还优选包括qPCR检测用反应缓冲液和/或逆转录用试剂。本发明对所述qPCR检测用反应缓冲液和/或逆转录用试剂的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的qPCR检测用反应缓冲液和/或逆转录用试剂即可。在本发明实施例中，所述qPCR检测用反应缓冲液购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。所述逆转录用试剂优选购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
鉴于所述LINC02159的表达抑制，能够有效抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移、侵袭和体内瘤体生长，同时促进细胞凋亡，因此，本发明提供了一种长链非编码RNALINC02159作为治疗靶点在制备防治非小细胞肺癌的药物中的应用。
在本发明中，所述长链非编码RNALINC02159优选通过正调控方式影响非小细胞肺癌的发生发展。实验证明非小细胞肺癌组织中长链非编码RNA LINC02159表达量显著上调，并且通过转基因手段抑制LINC02159表达，能够有效抑制非小细胞肺癌的发生和发展。因此，本发明提供了LINC02159作为治疗靶点在防治非小细胞肺癌中应用。
本发明提供了一种长链非编码RNALINC02159表达抑制剂在制备防治非小细胞肺癌的药物中的应用。
在本发明中，所述长链非编码RNALINC02159表达抑制剂优选包括靶向LINC02159的siRNA。所述靶向LINC02159的siRNA优选包括以下一种或几种：si-LINC02159-1、si-LINC02159-2和si-LINC02159-3；所述si-LINC02159-1优选是由核苷酸序列如SEQ ID NO:2(ggccuguguaaacauaacatt)所示的正义链1和核苷酸序列如SEQ ID NO:3(uguuauguuuacacaggcctt)所示的反义链1组成；所述si-LINC02159-2优选是由核苷酸序列如SEQ ID NO:4(cagcccugcacauuauguatt)所示的正义链2和核苷酸序列如SEQ ID NO:5(uacauaaugugcagggcugtt)所示的反义链2组成；所述si-LINC02159-3优选是由核苷酸序列如SEQ ID NO:6(cgcacuuaga gagaguaaatt)所示的正义链3和核苷酸序列如SEQ ID NO:7(uuuacucucucuaagugcgtt)所示的反义链3组成。上述3条siRNA与同时设计的相同靶基因的siRNA相比，靶向敲减效率较高，有利于抑制非小细胞肺癌细胞中LINC02159的表达，从而提高药物治疗效果。所述siRNA序列合成于上海吉玛制药技术有限公司。
在本发明中，所述药物优选具有以下至少一项抑癌作用：
1)抑制非小细胞肺癌细胞增殖；
2)抑制非小细胞肺癌细胞迁移；
3)抑制非小细胞肺癌细胞侵袭；
4)促进非小细胞肺癌细胞凋亡；
5)抑制非小细胞肺癌体内生长。
在本发明实施例中，在细胞水平上验证抑制LINC02159表达对NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭具有抑制作用，对NSCLC凋亡具有促进作用。所述非小细胞肺癌细胞优选包括以下至少一种细胞：A549、H1299和PC9。同时本发明还开展了动物水平验证实验，以裸鼠皮下荷瘤模型为实验对象，通过敲减LINC02159后，肿瘤体积变小、重量减轻。可见动物水平上通过敲减LINC02159后，裸鼠皮下瘤增殖减缓、凋亡增加。可见，本发明在细胞水平和动物水平均得到LINC02159表达抑制剂在制备防治非小细胞肺癌的药物中的应用，为非小细胞肺癌的治疗提供了新的技术手段。
下面结合实施例对本发明提供的LINC02159作为治疗靶点在制备防治非小细胞肺癌的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
应当理解，本发明所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。此外，本发明中提及的细胞株、试剂均有商品供应，它们仅作举例，对本发明不做任何限制作用，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。
实施例1
非小细胞肺癌和癌旁组织的lncRNA表达谱示意图
收集3对非小细胞肺癌和癌旁组织，委托上海欧易生物医学科技有限公司进行转录组测序，并通过转录本重建、过滤已知蛋白编码转录本、编码能力预测、lncRNA表达水平分析等生物信息分析流程对lncRNA表达谱分析，以p<0.05、|log2FC|>1为阈值，用热图展示肿瘤组和对照组lncRNA表达差异(图1)，共筛选出173个差异表达的lncRNA，其中84个在NSCLC组织中表达上调，89个下调，LINC02159(SEQ ID NO:1)是在非小细胞肺癌上调倍数排名靠前的。
实施例2
LINC02159在临床样本和细胞水平的表达情况
1.实验方法
(1)提取细胞RNA
1)取生长状况良好的细胞，用PBS洗涤2次，弃上清。
2)加入1mL TRIzol裂解液，冰上放置5min。
3)加入200μL氯仿，涡旋混匀15s，室温静置15min。
4)4℃，12000g离心15min，小心吸取上层水相至一新的Ep管中，加入与吸取体积相等的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min。
5)4℃，12000g离心10min，可见白色絮状沉淀。小心弃去上清，加入1mLDEPC水配置的75％乙醇，充分洗涤沉淀。
6)4℃，7400g离心5min，尽量弃去乙醇，置于超净工作台中小心风干，当沉淀呈半透明薄膜状时，加入适量DEPC水充分溶解RNA。
7)用NanoDropTMOne/OneC微量紫外-可见光分光光度计测量RNA浓度，RNA于超低温冰箱中保存。
(2)逆转录PCR(试剂盒购自Vazyme，货号为R312)
1)去除基因组DNA
在RNase-free离心管中配制表1所示混合液：
表1逆转录体系1
RNase free ddH2O 补充至10μL
5×gDNA wiper Mix 2μL
总RNA 1μg
用移液器轻轻吹打混匀。42℃，2min。
2)配制第一链cDNA合成反应液
在RNase-free离心管中配制如下混合液：
表2逆转录体系2
用移液器轻轻吹打混匀。37℃，15min；85℃，5sec；4℃保存。
(3)qPCR(试剂盒购自Vazyme，货号为Q511)
1)在qPCR管中配制如下混合液：
表3qPCR体系配制
2×AceQUniversalSYBRqPCRMasterMix 10μL
正向引物(10μM) 0.4μL
反向引物(10μM) 0.4μL
cDNA 2μL
RNase-freeddH2O 7.2μL
表4引物序列
LINC02159正向引物 5’-CCACCCCTTTCCCTGTAAGAG-3’(SEQ ID NO:8)
LINC02159反向引物 5’-TTGGTCAAAGCCAAAAGCCG-3’(SEQ ID NO:9)
U6正向引物 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(SEQ ID NO:10)
U6反向引物 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(SEQ ID NO:11)
2)按表4条件进行qPCR反应：
表4qPCR条件
2.实验结果
在50对非小细胞肺癌组织及配对癌旁组织中检测LINC02159的表达情况，qRT-PCR结果表明，LINC02159在非小细胞肺癌组织中显著高表达(图2中A)；与人支气管上皮细胞HBE相比，LINC02159在非小细胞肺癌细胞系中高表达(图2中B)。
实施例3
抑制LINC02159表达对NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响
1.实验方法
(1)细胞转染
1)取生长状况良好的细胞(A549和PC9)，于转染前18-24h接种于6孔板，使转染前的细胞汇合度达到30％-50％。
2)取5μL siRNA，加入到含有250μL培养基的Ep管中，轻柔混匀。其中siRNA为si-LINC02159-1(S1)、si-LINC02159-2(S2)或si-LINC02159-3(S3)；所述si-LINC02159-1由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3互补配对形成。si-LINC02159-2由SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5互补配对形成。所述si-LINC02159-3由SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7互补配对形成。
3)取5μL LipofectamineTM2000转染试剂，加入到另一含有250μL培养基的Ep管中，轻柔混匀，室温孵育5min。
4)混合步骤2)和3)中液体，室温孵育20min，加入步骤1)的6孔板中，补充培养基至2mL，于培养箱中进行转染。4～6h后移除混合物，加入2mL完全培养基。
5)培养48h后胰酶消化细胞，进行后续实验。
(2)细胞生长曲线
1)转染后的细胞消化、计数，10000个/孔接种于含有1mL完全培养基的24孔板中，置于细胞培养箱培养。
2)每隔24h消化1组并进行计数，连续6天。以时间为横坐标，细胞个数为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
(3)平板克隆
1)转染后的细胞消化、计数，1000个/孔接种于含有2mL完全培养基的6孔板中。
2)置于细胞培养箱中培养8～10天，每隔2～3天换液1次。
3)待细胞形成肉眼可见细胞群落时，弃去培养基并用PBS洗涤，加入1mL 4％多聚甲醛固定30min后弃去，加入1mL结晶紫染色液染色15min。移除染液，流水清洗至无紫色染液滴下，晾干。
4)拍照，计数每孔细胞克隆数目。
(4)Transwell迁移实验
1)转染后的细胞胰酶消化，用基础培养基重悬细胞并计数，调整细胞密度为2.5×105个/mL，取200μL加入到Tranwell小室中。
2)Tranwell小室置于加入600μL完全培养基的24孔板中，置于细胞培养箱培养24h。
3)弃去培养基并用PBS洗涤，加入1mL 4％多聚甲醛固定30min后弃去，加入1mL结晶紫染色液染色15min。
4)用棉签小心擦去未迁移的细胞，显微镜下拍照。
(5)基质胶侵袭实验
1)实验前一天，将Matrigel基质胶从-20℃提前放入4℃冰箱过夜，使其从固体状态融化为液体状态。
2)冰上配制20％Matrigel基质胶，取50μL平铺于小室上层，放置于37℃，30min待基质胶凝固。
3)转染后的细胞胰酶消化，用基础培养基重悬细胞并计数，调整细胞密度为5×105个/mL，取200μL加入到Tranwell小室中。
4)Tranwell小室置于加入600μL完全培养基的24孔板中，置于细胞培养箱培养48h。
5)弃去培养基并用PBS洗涤，加入1mL 4％多聚甲醛固定30min后弃去，加入1mL结晶紫染色液染色15min。
6)用棉签小心擦去未侵袭的细胞，显微镜下拍照。
(6)细胞凋亡实验(试剂盒购自福麦斯，货号为FMSAV647)
1)转染后的细胞用不含EDTA的胰酶消化。
2)用冰冷的PBS洗涤细胞2次后，加入1×结合缓冲液，调整细胞浓度为1×106个/mL。
3)取100μL细胞悬液于流式管中，加入10μL碘化丙啶(20μg/mL)和5μLAnnexinAlexa Fluor 647，混匀。
4)室温避光孵育15min，加入400μLPBS，用流式细胞仪进行检测。
2.实验结果
细胞生长曲线、克隆形成、迁移、侵袭和凋亡实验结果见图3。结果显示，对于A549细胞，si-LINC02159-3靶向敲低效果最高好，对于PC9细胞si-LINC02159-1靶向敲除效率最高(图3中A)，所以最后选择了si-LINC02159-1和si-LINC02159-3进行后续实验。si-LINC02159-1和si-LINC02159-3转染的NSCLC细胞的增殖速度、平板克隆、迁移和侵袭能力远低于对照组(图3中B-E)，流式细胞术结果表明敲减LINC02159促进了细胞凋亡(图3中F)。以上结果表明，敲减LINC02159能够在体外抑制NSCLC细胞增殖、转移，促进细胞凋亡，LINC02159有望成为NSCLC治疗的新靶点。
实施例4
抑制LINC02159表达对裸鼠皮下荷瘤的影响
取生长状态良好的A549细胞中分别转染对照和LINC02159的siRNA(si-LINC02159-3)，消化转染后的细胞并计数，按1×107个/只的细胞数注射到4-6周龄雌性裸鼠皮下，构建裸鼠皮下荷瘤模型。
与注射转染对照的A549细胞的裸鼠相比，敲减LINC02159使模型中肿瘤体积显著变小、重量显著减轻(图4中A-B)。肿瘤组织免疫组化分析结果表明，敲减LINC02159后，裸鼠皮下瘤增殖指标明显减缓、凋亡指标明显增加(图4中C)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种长链非编码RNA LINC02159作为治疗靶点在制备防治非小细胞肺癌的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述长链非编码RNA LINC02159通过正调控方式影响非小细胞肺癌的发生发展。
3.一种长链非编码RNA LINC02159表达抑制剂在制备防治非小细胞肺癌的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述长链非编码RNA LINC02159表达抑制剂包括靶向LINC02159的siRNA。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述靶向LINC02159的siRNA包括以下一种或几种：si-LINC02159-1、si-LINC02159-2和si-LINC02159-3；
所述si-LINC02159-1是由核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的正义链1和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反义链1组成；
所述si-LINC02159-2是由核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的正义链2和核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的反义链2组成；
所述si-LINC02159-3是由核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的正义链3和核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的反义链3组成。
6.根据权利要求3～5中任意一项所述应用，其特征在于，所述药物具有以下至少一项抑癌作用：
1)抑制非小细胞肺癌细胞增殖；
2)抑制非小细胞肺癌细胞迁移；
3)抑制非小细胞肺癌细胞侵袭；
4)促进非小细胞肺癌细胞凋亡；
5)抑制非小细胞肺癌体内生长。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述非小细胞肺癌细胞包括以下至少一种细胞：A549、H1299和PC9。
8.一种长链非编码RNA LINC02159作为诊断标志物在制备诊断非小细胞肺癌的试剂或试剂盒中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，检测所述长链非编码RNA LINC02159的试剂包括核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的反向引物。
10.根据权利要求1～5和7～9中任意一项所述应用，其特征在于，所述长链非编码RNALINC02159的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
CN202310446043.1A 2023-04-24 2023-04-24 一种linc02159作为治疗靶点在制备防治非小细胞肺癌的药物中的应用 Pending CN116808215A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310446043.1A CN116808215A (zh) 2023-04-24 2023-04-24 一种linc02159作为治疗靶点在制备防治非小细胞肺癌的药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310446043.1A CN116808215A (zh) 2023-04-24 2023-04-24 一种linc02159作为治疗靶点在制备防治非小细胞肺癌的药物中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116808215A true CN116808215A (zh) 2023-09-29

Family

ID=88128256

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310446043.1A Pending CN116808215A (zh) 2023-04-24 2023-04-24 一种linc02159作为治疗靶点在制备防治非小细胞肺癌的药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116808215A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108531596B (zh) 一种lncRNA作为生物标志物在胃癌诊治中的应用
CN112011620B (zh) circ-SLC38A1作为靶点在抑制膀胱癌细胞药物中的应用
CN110804613A (zh) 一种靶向抑制lncRNA-00861基因表达的siRNA在肝癌治疗中的应用
CN116024211A (zh) tRNA衍生物tRF-His-008在诊断、治疗肾癌中的应用
CN112410432B (zh) Linc02474作为结直肠癌诊断标志物和治疗靶点的应用
CN108220446B (zh) Linc01356作为分子标志物在胃癌中的应用
Zhang et al. MicroRNA-378a-3p downregulation as a novel biomarker with poor clinical outcomes in cervical cancer
CN111172290B (zh) 肝细胞癌诊断和治疗的miRNA
CN104147616B (zh) 双链rna或其修饰物在制备肿瘤抑制剂中的应用
CN113637763B (zh) miRNA生物标志物在黑色素瘤早期诊断和治疗中的用途
CN112575080A (zh) 一种长链非编码rna分子在诊断和/或治疗食管鳞癌中的用途
CN113549697B (zh) 一种胃癌热化疗敏感标志物及其应用
CN116808215A (zh) 一种linc02159作为治疗靶点在制备防治非小细胞肺癌的药物中的应用
CN110607368B (zh) miRNA3926-1基因作为胰腺癌诊断和疗效标志物的应用
CN110628791B (zh) 一种tRNA修饰酶基因在非小细胞肺癌中的应用
CN110862989A (zh) lncRNA-YIYA siRNA的设计及其在肝癌治疗中的应用
CN110577952A (zh) 一种长非编码rna在诊断和治疗乳腺癌中的应用
CN117187394A (zh) 一种非小细胞肺癌的生物标志物及应用
CN112280859B (zh) 一种乳腺癌标志物及应用
CN111118154B (zh) Linc01272在制备肿瘤检测试剂和/或治疗药物中的应用
CN114592063B (zh) 一种分子标志物circTICRR及其应用
CN112575081B (zh) 一种长链非编码rna分子在诊断和/或治疗三阴性乳腺癌中的用途
CN110946872B (zh) miR-4491在制备治疗乳腺癌的药物中的应用
CN108103200B (zh) 一种与胃癌相关的生物标志物及其应用
CN118028296A (zh) 一种抑制C19orf33基因的siRNA及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination