CN117169354A - 一种同时测定余甘子和枳椇子混合提取物中多种成分含量的方法 - Google Patents
一种同时测定余甘子和枳椇子混合提取物中多种成分含量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种同时测定余甘子和枳椇子混合提取物中多种成分含量的方法，其采用高效液相色谱、质谱联用法同时对余甘子枳椇子混合物提取物中的没食子酸、二氢杨梅素、柯里拉京、花旗松素、鞣花酸五种活性成分进行定性、定量测定。本发的分析方法可对5种不同类别化学结构成分同时进行定性定量测定，具有专属性强，操作方便，灵敏度高，准确度高的优点，既能对目标化合物达到成分鉴定的作用，又能对其含量进行准确测定，可以为枳椇子和余甘子混合物的主要活性成分的测定及产品开发提供技术支持。
Description
【技术领域】
本发明涉及功能食品多组分检测技术领域，具体涉及一种同时测定余甘子和枳椇子混合提取物中多种成分含量的方法。
【背景技术】
随着消费者健康意识的不断提升，人们更关注并倾向选择富含功能性成分的食品，功能性食品是食品和药品的桥梁，人们可以通过功能性食品来改善提高健康水平。而枳椇子和余甘子作为天然的植物源性食品原料，均为药食同源的中药。枳椇子中主要抗氧化成分为黄酮类成分，其中二氢杨梅素成分在药材抗氧化活性方面贡献最大，同时二氢杨梅素可增加酒精代谢并降低酒精介导的脂质失调，从而起到保肝作用，并具有明显的降血糖作用。余甘子含有大量的多酚、萜类、多糖、黄酮类等功能活性成分，其中多酚含量占余甘子干粉的百分含量比为20％。这与余甘子具备抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抑菌防腐、降脂减肥和提高免疫力活性等多种保健作用密切相关。
以枳椇子和余甘子为原料复配的产品具有解酒保肝，清热生津，抗氧化性，抗糖尿病，抗肿瘤等多种保健功能。但枳椇子和余甘子组合提取物中化学成分复杂，包括多酚类和黄酮类物物质，传统的检测技术HPLC-DAD由于检测器的局限性，无法同时对枳椇子和余甘子组合提取物中的多种活性成分进行定性定量测定。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题，在于提供一种同时测定余甘子和枳椇子混合提取物中多种成分含量的方法，该分析方法专属性强、灵敏且准确可靠，既能通过测定目标化合物的一级、二级质谱信息达到成分鉴定的作用，又能对其含量进行准确测定，对枳椇子和余甘子混合物中主要活性成分的测定及产品开发提供技术支持。
本发明是这样实现的：
一种同时测定余甘子和枳椇子混合提取物中多种成分含量的方法，采用高效液相色谱、质谱联用法同时对余甘子枳椇子混合物提取物中多种活性成分进行定性、定量测定，步骤如下：
步骤1、余甘子和枳椇子混合提取物制备：
余甘子、枳椇子药材用粉碎机进行粉碎，过40目筛网即得余甘子、枳椇子粉末；将余甘子粉末和枳椇子粉末按质量比1:0、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、0:1进行混合，制得混合提取原料；
准确称取10g混合提取原料，量取150ml浓度为60％的乙醇溶液于锥形瓶内，充分浸润后，超声提取1h，30℃恒温振荡过夜；对提取液进行抽滤，使用旋转蒸发仪在70℃、转速120r/min的条件下旋蒸除去乙醇和水分，得到混合提取浸膏；
往上述制备的浸膏中加入20倍体积的90％乙醇，静置醇沉24h，以4000转/min离心15min，取上清液抽滤2次得到除去多糖的混合提取液；使用旋转蒸发仪在50℃、转速90r/min的条件下旋蒸除去乙醇，将获得溶液放于-80℃冰箱冷冻16h，使用冷冻干燥机干燥样品，制得余甘子和枳椇子混合提取物；
步骤2、待测液配置：
准确称取余甘子枳椇子混合提取物0.1g，置于100ml容量瓶内；加入适量甲醇使其充分溶解，随后加甲醇至刻度，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得1mg/ml的余甘子枳椇子混合提取物待测液；
步骤3、混合对照品溶液配置：
分别精密称取没食子酸对照品250.00mg、二氢杨梅素80.00mg、柯里拉京4.00mg、花旗松素10.0mg、鞣花酸36.00mg分别置于10ml容量瓶内，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，为对照品贮备液。再精密吸取上诉对照品贮备液用甲醇稀释成每1ml含没食子酸5.00mg、二氢杨梅素1.60mg、柯里拉京0.08mg、花旗松素0.20mg、鞣花酸0.72mg的溶液，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得混合对照品；
步骤4、测定法：
采用高效液相色谱、质谱联用法同时对余甘子枳椇子混合物提取物待测液中没食子酸、二氢杨梅素、柯里拉京、花旗松素、鞣花酸五种活性成分进行定性、定量测定，其中，
色谱条件：Thermo BDS HYPERSIL C18色谱柱(250mm×4.6mm，5.0μm)；流动相A为甲醇，流动相B为0.2％磷酸水，梯度洗脱程序：0→30min，1％A→10％A；30→40min，10％A→20％A；40→50min，20％A→25％A；50→80min，25％A→30％A；80→90min，30％A→64％A；90→100min，64％A→80％A；进样量10μL；柱温：30℃；检测波长：285nm；流速：1.0mL/min；
质谱条件：ES-:毛细管电压:2.5kv；锥孔电压：30V；离子源温度：150℃；脱溶剂温度温度：350℃；脱溶剂气流：650L/Hr。
进一步地，所述步骤4测定法中包括精密度试验：精密吸取混合对照品溶液10μL，按所述色谱条件进行分析，连续重复进样6次，测定峰面积，计算得到没食子酸、二氢杨梅素、柯里拉京、花旗松素、鞣花酸保留时间的RSD。
进一步地，所述步骤4测定法中包括重复性试验：取余甘子枳椇子混合提取物6份，按照步骤2的方法制备待测液，按所述色谱条件进行进样检测，记录没食子酸、二氢杨梅素、柯里拉京、花旗松素、鞣花酸的峰面积，计算得到各成分的平均含量及RSD。
进一步地，所述步骤4测定法中包括稳定性试验：取余甘子枳椇子混合提取物，按照步骤2的方法制备待测液，分别在制备后的0、3、6、9、12、24h，按所述色谱条件进行进样检测，记录没食子酸、二氢杨梅素、柯里拉京、花旗松素、鞣花酸的峰面积并计算RSD。
进一步地，所述步骤4测定法中包括线性关系考察：精密吸取步骤3制得的混合对照品溶液，等比稀释成6个系列浓度；按照所述色谱条件进行分析，以对照品浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归。
进一步地，所述步骤4测定法中包括加样回收率实验：精密称取多份已知含量的余甘子枳椇子混合提取物，按照步骤2的方法制备待测液，按照高、中、低3个浓度精密加入没食子酸、二氢杨梅素、柯里拉京、花旗松素、鞣花酸的对照品，配制成回收率试验供试品溶液；再按所述色谱条件进样10μL测定，计算得到5个成分的平均回收率及RSD。
本发明具有如下优点：
本发明采用液相色谱-串联质谱法对枳椇子和余甘子提取物样品进行全谱扫描，根据离子信息推断相应的特征物，再将推断出的特征物与标椎物质进行比对，确定特征标志物；对样品进行前处理后，设定了液相色谱和质谱的特定条件，采用UHPLC--MS/MS技术进行定量分析，根据特征标志物含量鉴别5种活性成分。没食子酸、二氢杨梅素、柯里拉京、花旗松素、鞣花酸在本发明限定的适用浓度范围内线性关系良好。
即本发明所建立的分析方法可对5种不同类别化学结构成分同时进行定性定量测定，这5种成分包括了多类和黄酮类化合物，具有专属性强，操作方便，灵敏度高，准确度高的优点。本发明方法既能通过测定目标化合物的一级、二级质谱信息达到成分鉴定的作用，又能对其含量进行准确测定，可以为枳椇子和余甘子混合物的主要活性成分的测定及产品开发提供技术支持。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1为本发明实施例混合对照品溶液中5种化学成分的高效液相色谱图，其中1为没食子酸；2为二氢杨梅素；3为柯里拉京；4为花旗松素；5为鞣花酸。
图2为本发明实施例余甘子和枳椇子混合提取物的高效液相色谱图，其中1为没食子酸；2为二氢杨梅素；3为柯里拉京；4为花旗松素；5为鞣花酸。
图3为本发明的五种化合物的一级质谱图，其中A为化合物一；B为化合物二；C为化合物三；D为化合物四；E为化合物五。
图4为本发明的五种化合物的二级质谱图，其中A为化合物一；B为化合物二；C为化合物三；D为化合物四；E为化合物五。
【具体实施方式】
下面将结合附图1-4和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：HPLC-MS同时测定余甘子枳椇子混合提取物中5种成分含量的方法：
1.仪器与试剂
1.1原料与试剂
余甘子、枳椇子均购自豪州仙太生物药业有限公司；没食子酸对照品(批次：J05GS153704；纯度≥98.5％)、二氢杨梅素对照品(批次：Y08J12K136911；纯度≥98％)、柯里拉京对照品(批次：A02GB143893；纯度≥98％)、鞣花酸对照品(批次：N08GS166905；纯度≥96％)均购自上海源叶生物科技有限公司；花旗松素对照品(大连美仑生物技术有限公司，批次：F0221A；纯度＞98％)；甲醇、磷酸均为色谱醇；乙醇为分析纯；水为去离子水。
1.2仪器
Waters H-Class Xevo TQ-S micro超高效液相三重四极杆质谱联用仪；岛津LC-20AD液相色谱仪；色谱柱：Thermo BDS HYPERSIL C18色谱柱(250mm×4.6mm，5.0μm)；赛多利斯SQP(0.01mg)电子天平；SENCO RE-201旋转蒸发仪；新芝SB-5200D超声波清洗机；赛得利斯SHA-C水浴恒温振荡器。
2.方法与结果
2.1供试品制备
2.1.1余甘子和枳椇子混合提取物制备余甘子、枳椇子药材用粉碎机进行粉碎，过40目筛网即得余甘子、枳椇子粉末。将余甘子粉末和枳椇子粉末按质量比1:0、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、0:1进行混合，制得混合提取原料。准确称取10g混合提取原料，量取150ml浓度为60％的乙醇溶液于锥形瓶内，充分浸润后，超声提取1h，30℃恒温振荡过夜。对提取液进行抽滤，使用旋转蒸发仪在70℃、转速120r/min的条件下旋蒸除去乙醇和大部分水分，得到混合提取浸膏。往上述制备的浸膏中加入20倍体积的90％乙醇，静置醇沉24h，以4000转/min离心15min，取上清液抽滤2次得到除去多糖的混合提取液。使用旋转蒸发仪在50℃、转速90r/min的条件下旋蒸除去乙醇，将获得溶液放于-80℃冰箱冷冻约16h，使用冷冻干燥机干燥样品，制得余甘子枳椇子混合提取物。
2.1.2待测液配置准确称取余甘子枳椇子混合提取物0.1g，置于100ml容量瓶内。加入适量甲醇使其充分溶解，随后加甲醇至刻度，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得0.5mg/ml的余甘子枳椇子混合提取物待测液。
2.1.3混合对照品溶液配置分别精密称取没食子酸对照品250.00mg、二氢杨梅素80.00mg、柯里拉京4.00mg、花旗松素10.0mg、鞣花酸36.00mg分别置于10ml容量瓶内，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，为对照品贮备液。再精密吸取上诉对照品贮备液用甲醇稀释成每1ml含没食子酸5.00mg、二氢杨梅素1.60mg、柯里拉京0.08mg、花旗松素0.20mg、鞣花酸0.72mg的溶液，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得混合对照品溶液。
2.2液相色谱-质谱条件
色谱条件：Thermo BDS HYPERSIL C18色谱柱(250mm×4.6mm，5.0μm)；流动相A为甲醇，流动相B为0.2％磷酸水，梯度洗脱程序：0→30min，1％A→10％A；30→40min，10％A→20％A；40→50min，20％A→25％A；50→80min，25％A→30％A；80→90min，30％A→64％A；90→100min，64％A→80％A。进样量10μL；柱温：30℃；检测波长：285nm；流速：1.0mL/min。混合对照品及余甘子枳椇子混合提取物的HPLC色谱图(见图1、图2)。
质谱条件：ES-:毛细管电压:2.5kv；锥孔电压：30V；离子源温度：150℃；脱溶剂温度温度：350℃；脱溶剂气流：650L/Hr。一级扫描模式：MS Scan ES-(全扫)；全扫范围m/z：50-1200。二级扫描模式的质谱分析参数(见表1)。余甘子、枳椇子混合提取物的五种成分一级质谱、二级质谱图(见图3和图4)。
表1 5种化合物的二级质谱分析参数
2.3余甘子枳椇子混合提取物中五种主要化合物的分析
化合物一的母离子碎品片为m/z 169.11[M-H]-，推测分子式为C7H6O5，该离子失去一分子COOH产生m/z 124.77[M-COOH]-的子离子碎片，m/z
169.11、m/z 124.77的离子碎片分别在化合物一的一级，二级质谱中被检出，根据没食子酸对照品高效液相色谱、质谱数据，推断化合物一为没食子酸。
化合物二的母离子碎品片为m/z 319.15[M-H]-,推测分子式为C15H12O8，该离子失去一分子C6H3O3产生m/z 193.03[M-C6H3O3]-的子离子碎片，失去一分子C9H2O4产生m/z124.99[M-C9H2O4]-的子离子碎片。m/z 319.15、m/z
193.03、m/z 124.99的离子碎片分别在化合物二的一级，二级质谱中被检出，根据二氢杨梅素对照品高效液相色谱、质谱数据，推断化合物二为二氢杨梅素。
化合物三的母离子碎品片为m/z 633.24[M-H]-,推测分子式为C27H24O18，该离子连续损失没食子酰基和H2O得到m/z 462.84[M-H-152-H2O]-的子离子碎片，失去一个含己糖的没食子酰单位得到碎片离子m/z 300.64
[M-H-152-180]-的子离子碎片，m/z 633.24、m/z 462.84、m/z 300.64、m/z275.05的离子碎片分别在化合物三的一级，二级质谱中被检出，根据柯里拉京对照品高效液相色谱、质谱数据，推断化合物三为柯里拉京。
化合物四的母离子碎品片为m/z 303.02[M-H]-,推测分子式为C15H12O7，该离子失去一分子H2O得到m/z 285.03[M-H-H2O]-的子离子碎片，再失去一分子CO得到m/z 256.56[M-H-H2O-CO]-的子离子碎片,而该离子失去一分子C3H2O3和C2H4O4则得到m/z 124.52[M-H-C3H2O3-C2H4O4]-的子离子碎片。m/z 303.02、m/z 285.03、m/z 256.56、m/z 124.52的离子碎片分别在化合物四的一级，二级质谱中被检出，根据花旗松素对照品高效液相色谱、质谱数据，推断化合物四为花旗松素。
化合物五的母离子碎品片为m/z 301.25[M-H]-,推测分子式为C14H6O8，该离子失去一分子H2O得到m/z 283.55[M-H2O]-的子离子碎片，进一步失去五分子CO得到m/z 144.90[M-H2O-5(CO)]-的子离子碎片。母离子失去一分子CO2得到m/z 256.56[M-CO2]-的子离子碎片301.25、m/z 283.55、m/z 256.56、m/z 144.90的离子碎片分别在化合物五的一级，二级质谱中被检出，根据鞣花酸对照品高效液相色谱、质谱数据，推断化合物五为鞣花酸。
2.4精密度试验
准确称取一份按照“供试品制备”项的方法制备的供试品，按照“待测液配置”项的方法制备待测液，精密吸取待测液10μL，按上述色谱条件进行分析，连续重复进样6次，测定峰面积，计算得到没食子酸、二氢杨梅素、柯里拉京、花旗松素、鞣花酸的峰面积(n＝6)RSD分别为0.77％、0.84％、1.63％、1.43％、1.56％，表明仪器精密度良好。
2.5重复性试验
准确称取一份按照“供试品制备”项的方法制备的供试品，按照“待测液配置”项的方法制备6份待测液，分别精密吸取待测液10μL，按“2.3”项色谱条件进行进样检测，记录没食子酸、二氢杨梅素、柯里拉京、花旗松素、鞣花酸的峰面积，计算得到各成分的平均含量分别为0.3026mg/ml、0.1445mg/ml、0.008711mg/ml、0.01093mg/ml、0.06024mg/ml，RSD(n＝6)分别为0.90％、1.16％、2.21％、2.02％、1.28％，表明该方法重复性良好。
2.6稳定性试验
准确称取一份按照“供试品制备”项的方法制备的供试品，按照“待测液配置”项的方法制备一份待测液，分别在制备后的0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h，按“2.3”项色谱条件进行进样检测，记录没食子酸、二氢杨梅素、柯里拉京、花旗松素、鞣花酸的峰面积并计算RSD(n＝7)分别为1.08％、1.17％、2.07％、1.52％、1.47％，说明待测品溶液在24h稳定性良好。
2.7线性关系考察
精密吸取“混合对照品溶液配置”项下的混合对照品溶液，等比稀释成6个系列浓度。按照上述“测定法”项色谱条件进行分析，以对照品浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，拟合线性方程、线性范围及相关系数(见表2)所示，结果表明，线性关系良好。
表2余甘子枳椇子提取物中5种成分的线性关系考察结果
2.8加样回收率实验
精密称取已知含量的同一批按照“供试品制备”项的方法制备的供试品各50.00mg，分别“待测液配置”项的方法制备浓度为5.0mg/ml的待测液，精密吸取8.0ml待测液加入10ml容量瓶中。按“混合对照品溶液配置”项的方法制备每1ml含没食子酸2.7600mg、二氢杨梅素0.8720mg、柯里拉京0.0452mg、花旗松素0.0645mg、鞣花酸0.2720mg的对照品溶液。分别精密吸取2.5ml、5.0ml、7.5ml对照品溶液加入10ml容量瓶中，加入甲醇定容至10ml。精密吸取上述制备的低、中、高3个浓度的对照品溶液2ml分别加入上述装有8.0ml待测液的容量瓶中制备成回收率试验供试品溶液。按上述色谱条件进样10μL测定，计算得到5个成分的平均回收率及RSD，结果见表3。
表3加样回收实验(n＝9)
2.9样品含量测定
取余甘子枳椇子混合提取物7批，按照“供试品制备”项的供试品制备方法制备供试品溶液，每批平行3份(n＝3)，按照“待测液配置”制备待测液，按照上述“测定法”项色谱条件下，进样分析，记录5种化学成分的峰面积并计算化学成分含量，结果见表4。
表4不同配比的余甘子、枳椇子混合原料中各活性成分提取率
综上，本发明采用液相色谱-串联质谱法对枳椇子和余甘子提取物样品进行全谱扫描，根据离子信息推断相应的特征物，再将推断出的特征物与标椎物质进行比对，确定特征标志物；对样品进行前处理后，设定了液相色谱和质谱的特定条件，采用UHPLC--MS/MS技术进行定量分析，根据特征标志物含量鉴别5种活性成分。没食子酸、二氢杨梅素、柯里拉京、花旗松素、鞣花酸在本发明限定的适用浓度范围内线性关系良好。
即本发明所建立的分析方法可对5种不同类别化学结构成分同时进行定性定量测定，这5种成分包括了多类和黄酮类化合物，具有专属性强，操作方便，灵敏度高，准确度高的优点。本发明方法既能通过测定目标化合物的一级、二级质谱信息达到成分鉴定的作用，又能对其含量进行准确测定，可以为枳椇子和余甘子混合物的主要活性成分的测定及产品开发提供技术支持。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
Claims (6)
1.一种同时测定余甘子和枳椇子混合提取物中多种成分含量的方法，其特征在于：采用高效液相色谱、质谱联用法同时对余甘子枳椇子混合物提取物中多种活性成分进行定性、定量测定，步骤如下：
步骤1、余甘子和枳椇子混合提取物制备：
余甘子、枳椇子药材用粉碎机进行粉碎，过40目筛网即得余甘子、枳椇子粉末；将余甘子粉末和枳椇子粉末按质量比1:0、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、0:1进行混合，制得混合提取原料；
准确称取10g混合提取原料，量取150ml浓度为60％的乙醇溶液于锥形瓶内，充分浸润后，超声提取1h，30℃恒温振荡过夜；对提取液进行抽滤，使用旋转蒸发仪在70℃、转速120r/min的条件下旋蒸除去乙醇和水分，得到混合提取浸膏；
往上述制备的浸膏中加入20倍体积的90％乙醇，静置醇沉24h，以4000转/min离心15min，取上清液抽滤2次得到除去多糖的混合提取液；使用旋转蒸发仪在50℃、转速90r/min的条件下旋蒸除去乙醇，将获得溶液放于-80℃冰箱冷冻16h，使用冷冻干燥机干燥样品，制得余甘子和枳椇子混合提取物；
步骤2、待测液配置：
准确称取余甘子枳椇子混合提取物0.1g，置于100ml容量瓶内；加入适量甲醇使其充分溶解，随后加甲醇至刻度，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得1mg/ml的余甘子枳椇子混合提取物待测液；
步骤3、混合对照品溶液配置：
分别精密称取没食子酸对照品250.00mg、二氢杨梅素80.00mg、柯里拉京4.00mg、花旗松素10.0mg、鞣花酸36.00mg分别置于10ml容量瓶内，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，为对照品贮备液。再精密吸取上诉对照品贮备液用甲醇稀释成每1ml含没食子酸5.00mg、二氢杨梅素1.60mg、柯里拉京0.08mg、花旗松素0.20mg、鞣花酸0.72mg的溶液，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得混合对照品溶液；
步骤4、测定法：
采用高效液相色谱、质谱联用法同时对余甘子枳椇子混合物提取物待测液中没食子酸、二氢杨梅素、柯里拉京、花旗松素、鞣花酸五种活性成分进行定性、定量测定，其中，
色谱条件：ThermoBDSHYPERSILC18色谱柱(250mm×4.6mm，5.0μm)；流动相A为甲醇，流动相B为0.2％磷酸水，梯度洗脱程序：0→30min，1％A→10％A；30→40min，10％A→20％A；40→50min，20％A→25％A；50→80min，25％A→30％A；80→90min，30％A→64％A；90→100min，64％A→80％A；进样量10μL；柱温：30℃；检测波长：285nm；流速：1.0mL/min；
质谱条件：ES-:毛细管电压:2.5kv；锥孔电压：30V；离子源温度：150℃；脱溶剂温度温度：350℃；脱溶剂气流：650L/Hr。
2.根据权利要求1所述的一种同时测定余甘子和枳椇子混合提取物中多种成分含量的方法，其特征在于：所述步骤4测定法中包括精密度试验：精密吸取混合对照品溶液10μL，按所述色谱条件进行分析，连续重复进样6次，测定峰面积，计算得到没食子酸、二氢杨梅素、柯里拉京、花旗松素、鞣花酸保留时间的RSD。
3.根据权利要求1所述的一种同时测定余甘子和枳椇子混合提取物中多种成分含量的方法，其特征在于：所述步骤4测定法中包括重复性试验：取余甘子枳椇子混合提取物6份，按照步骤2的方法制备待测液，按所述色谱条件进行进样检测，记录没食子酸、二氢杨梅素、柯里拉京、花旗松素、鞣花酸的峰面积，计算得到各成分的平均含量及RSD。
4.根据权利要求1所述的一种同时测定余甘子和枳椇子混合提取物中多种成分含量的方法，其特征在于：所述步骤4测定法中包括稳定性试验：取余甘子枳椇子混合提取物，按照步骤2的方法制备待测液，分别在制备后的0、3、6、9、12、24h，按所述色谱条件进行进样检测，记录没食子酸、二氢杨梅素、柯里拉京、花旗松素、鞣花酸的峰面积并计算RSD。
5.根据权利要求1所述的一种同时测定余甘子和枳椇子混合提取物中多种成分含量的方法，其特征在于：所述步骤4测定法中包括线性关系考察：精密吸取步骤3制得的混合对照品溶液，等比稀释成6个系列浓度；按照所述色谱条件进行分析，以对照品浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归。
6.根据权利要求1所述的一种同时测定余甘子和枳椇子混合提取物中多种成分含量的方法，其特征在于：所述步骤4测定法中包括加样回收率实验：精密称取多份已知含量的余甘子枳椇子混合提取物，按照步骤2的方法制备待测液，按照高、中、低3个浓度精密加入没食子酸、二氢杨梅素、柯里拉京、花旗松素、鞣花酸的对照品，配制成回收率试验供试品溶液；再按所述色谱条件进样10μL测定，计算得到5个成分的平均回收率及RSD。
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