CN1171640C - 肝癌超抗原免疫基因治疗剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种涉及基因工程技术的肝细胞癌(肝癌)超抗原免疫基因治疗剂的制备方法,制备肝癌特异性启动子和增强子调控序列介导的超抗原分子和共刺激分子在肝癌细胞进行靶向表达的治疗剂,特异性增强肝癌细胞的免疫原性和与免疫效应细胞的识别作用。将此治疗剂通过介入方式送到癌区,可有效杀伤肝癌细胞,治疗时可利用相关药物调控肝癌特异性启动子和增强子的活性来调节超抗原分子和共刺激分子的表达,并通过肝癌特异性启动子和增强子调控的自身产物水平判断治疗效果。同时利用肝癌特异性抗原、超抗原分子和共刺激分子在体外诱导自身T淋巴细胞进行过继免疫治疗,辅助癌区免疫治疗,以增强疗效、治疗转移病灶和预防复发。本发明的肝癌细胞超抗原免疫基因治疗剂具有以下特点:(1)安全性;(2)靶向性;(3)可控性;(4)灭癌高效性,是一种很有前景的肝癌免疫基因治疗剂。
Description
一、技术领域
本发明涉及基因工程技术,特别涉及一种肝癌超抗原免疫基因治疗剂的制备方法。
二、背景技术
三、发明内容
根据上述现有技术中所涉及的问题,本发明的目的是提供一种肝癌超抗原免疫基因治疗剂的制备方法。通过基因工程和细胞生物学手段在肝癌细胞表面建立甲胎蛋白(AFP,alpha-Fetoprotein)增强子和启动子特异性调控的利用超抗原分子葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal EnterotoxinA,SEA)和共刺激分子B7.1双信号免疫激活系统,使肝癌细胞特异性表达强抗原信号SEA的同时,赋予抗原信号共刺激分子B7.1,有效提高肝癌细胞诱导免疫排斥反应的能力。
为了实现上述目的,本发明所采取的技术方案是:从甲胎蛋白(AFP)高分泌的肝癌细胞中分离细胞基因组总DNA,设计特异性引物,通过PCR方法扩增AFP启动子和顺式增强子序列;分别从肠葡萄球菌场毒素A标准菌株FRI100基因组中通过PCR扩增SEA基因全序列和蛋白编码序列,定点突变葡萄球菌场毒素A(SEA)基因位点,同时从人B细胞通过反转录PCR分别扩增共刺激分子B7.1基因编码胞外区序列(B7.1exc)和跨膜区序列(B7.1tm);将上述片段克隆至载体pLXSN(Clontech公司产品,属逆转录病毒真核表达载体,非本研究专用载体)中,分别构建以AFP启动子和增强子为调控元件的B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm目的基因逆转录真核表达载体;将目的基因逆转录病毒载体在病毒包装细胞系PA317、φ2中进行包装;以包装好的缺陷病毒颗粒感染人肝癌细胞,表达出SEA-B7.1融合蛋白;以视黄素、地塞米松、雌激素等药物对SEA-B7.1的表达进行调控,同时通过检测AFP水平来判断治疗效果。
利用AFP特异性调控序列调控目的基因B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm的表达,通过设计特异性引物:5’GCAACTTAGGGACAAGT3’TGTTATTGGCAGTGG和5’GCTGGCTTCACAGACTTATG3’GGAGACCAGTTAGGAAGT,通过PCR方法扩增AFP启动子和顺式增强子序列,其序列如下:
AFP启动子序列
GCAACTTAGGGACAAGTCATCTCTTTGAATATTCTGTAGTTTGAGGAG
AATATTTGTTATATTTGCAAAATAAAATAAGTTTGCAAGTTTTTTTTTTC
TGCCCCAAAGAGCTCTGTGTCCTTGAACATAAAATACAAATAACCGCT
ATGCTGTTAATTATTGGCAAATGTCCCATTTTCAACCTAAGGAAATACC
ATAAAGTAACAGATATACCAACAAAAGGTTACTAGTTAACAGGCATTG
CCTGAAAAGAGTATAAAAGAATTTCAGCATGATTTTCCATATTGTGCT
TCCACCACTGCCAATAACA
AFP增强子序列
GCTGGCTTCACAGACTTATGAAAAAGTAAACGGAATCAGAATTACATCAAT
GCAAAAGCATTGCTGTGAACTCTGTACTTAGGACTAAACTTTGAGCAATAA
CACATATAGATTGAGGATTGTTTGCTGTTAGTATACAAACTCTGGTTCAAAG
CTCCTCTTTATTGCTTGTCTTGGAAAATTTGCTGTTCTTCATGGTTTCTCTTT
TCACTGCTATCTATTTTTCTCAACCACTCACATGGCTACAATAACTGTCTGC
AAGCTTATGATTCCCAAATATCTATCTCTAGCCTCAATCTTGTTCCAGAAGAT
AAAAAGTAGTATTCAAATGCACATCAACGTCTCCACTTGGAGGGCTTAAAG
ACGTTTCAACATACAAACCGGGGAGTTTTGCCTGGAATGTTTCCTAAAATG
TGTCCTGTAGCACATAGGGTCCTCTTGTTCCTTAAAATCTAATTACTTTTAG
CCCAGTGCTCATCCCACCTATGGGGAGATGAGAGTGAAAAGGGAGCCTGA
TTAATAATTACACTAAGTCAATAGGCATAGAGCCAGGACTGTTTGGGTAAA
CTGGTCACTTTATCTTAAACTAAATATATCCAAAACTGAACATGTACTTAGTT
ACTAAGTCTTTGACTTTATCTCATTCATACCACTCAGCTTTATCCAGGCCAC
TTATTTGACAGTATTATTGCGAAAACTTCCTAACTGGTCTCC,其特点是将所获得的调控序列置于目的基因上游,特异性调控目的基因的表达。
在肝癌细胞特异性表达超抗原分子SEA和共刺激分子B7.1。设计特殊引物,分别从肠葡萄球菌场毒素A标准菌株FRI100基因组中通过PCR扩增SEA基因全序列和蛋白编码序列,扩增引物分别为5’ATGAAAAAAACAGCATTTAC3’ACTTGTATATAAATAT和5’AGCGAGAAAAGCGAAGAA3’ACTTGTATATAAATATAT,以单点或组合的突变方式,定点突变葡萄球菌场毒素A(SEA)基因位点(H81、H187、H225、p227),设计特殊引物(5’ATGGGCCACACACGGAGGC3’TCCACTACCGTTATCAGGAAAATGCTCTTGC和5’(1)GGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGATAACCTGCTCCCATCC
(2)GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT3’TTATACAGGGCGTACACT)从人B细胞通过反转录PCR分别扩增共刺激分子B7.1基因编码胞外区序列(B7.1exc)和跨膜区序列(B7.1tm);分别构建获得B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm融合目的基因;
构建以AFP启动子和增强子为调控元件的B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm目的基因逆转录真核表达载体。
本发明通过基因工程和细胞生物学手段在肝癌细胞表面建立甲胎蛋白(AFP,alpha-Fetoprotein)增强子和启动子特异性调控的利用超抗原分子葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal Enterotoxin A,SEA)和共刺激分子B7.1双信号免疫激活系统,使肝癌细胞特异性表达强抗原信号SEA的同时,赋予抗原信号共刺激分子B7.1,通过介入方式导入癌区。
采用本发明可有效提高肝癌细胞诱导免疫排斥反应的能力;同时利用体外经60Co照射的转染SEA-B7.1的AFP高表达肝癌细胞诱导自身T淋巴细胞进行过继免疫治疗,辅助癌区免疫治疗,以增强疗效、治疗转移病灶和预防复发,以达到理想的治疗目的。
四、具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
依照本发明的技术方案,从甲胎蛋白(AFP)高分泌的肝癌细胞中分离细胞基因组总DNA,设计特异性引物:5’GCAACTTAGGGACAAGT 3’TGTTATTGGCAGTGG和5’GCTGGCTTCACAGACTTATG 3 ’GGAGACCAGTTAGGAAGT,通过PCR扩增反应,分别获得AFP启动子和顺式增强子序列,其序列如下:
AFP启动子序列
GCAACTTAGGGACAAGTCATCTCTTTGAATATTCTGTAGTTTGAGGAG
AATSATTGTTATATTTGCAAAATAAAATAAGTTTGCAAGTTTTTTTTTTC
TGCCCCAAAGAGCTCTGTGTCCTTGAACATAAAATACAAATAACCGCT
ATGCTGTTAATTATTGGCAAATGTCCCATTTTCAACCTAAGGAAATACC
ATAAAGTAACAGATATACCAACAAAAGGTTACTAGTTAACAGGCATTG
CCTGAAAAGAGTATAAAGAATTTCAGCATGATTTTCCATAYTGTGCT
TCCACCACTGCCAATAACA
AFP增强子序列
GCTGGCTTCACAGACTTATGAAAAAGTAAACGGAATCAGAATTACATCAAT
GCAAAAGCATTGCTGTGAACTCTGTACTTAGGACTAAACTTTGAGCAATAA
CACATATAGATTGAGGATTGTTTGCTGTTAGTATACAAACTCTGGTTCAAAG
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TTATTTGACAGTATTATTGCGAAAACTTCCTAACTGGTCTCC
设计特殊引物,分别从肠葡萄球菌场毒素A(SEA)标准菌株FRI100基因组中通过PCR扩增SEA基因全序列和蛋白编码序列,扩增引物分别为5’ATGAAAAAAACAGCATTTAC3’ACTTGTATATAAATAT和5’AGCGAGAAAAGCGAAGAA3’ACTTGTATATAAATATAT,以单点或组合的突变方式,定点突变葡萄球菌场毒素A(SEA)基因位点(H81、H187、H225、D227),设计特殊引物(5’ATGGGCCACACACGGAGGC3’TCCACTACCGTTATCAGGAAAATGCTCTTGC和5’(1)GGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGATAACCTGCTCCCATCC(2)GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT3’TTATACAGGGCGTACACT)从人B细胞通过反转录PCR分别扩增共刺激分子B7.1基因编码胞外区序列(B7.1exc)和跨膜区序列(B7.1tm);将上述片段克隆至载体pLXSN(Clontech公司产品,属逆转录病毒真核表达载体,非本研究专用载体)中,分别构建以AFP启动子和增强子为调控元件的B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm目的基因逆转录真核表达载体;;将目的基因逆转录真核表达载体转染至病毒包装细胞系PA317、φ2中进行包装(Miller AD &Buttimor C.(1986)Mol Cell Biol.6,2895-2902.Mann R,mulligan RC & baltimoreD.(1983)Cell 33,153-159.);包装细胞培养上清经分离纯化后获得缺陷病毒颗粒,并以这种缺陷病毒颗粒通过经皮穿刺注射、介入或静脉注射等方式注入瘤区,感染人肝癌细胞,表达出SEA-B7.1融合蛋白;通过视黄素、地塞米松、雌激素等药物调控AFP的表达,从而达到对SEA-B7.1的表达进行调控,同时通过检测AFP水平来判断治疗效果;药剂质控达到国家规定标准。
本发明的肝癌超抗原免疫基因治疗剂的制备方法具有以下优点:(1)安全性,即该治疗剂进入机体后只在处于分裂期的肝癌细胞进行表达,不伤及正常细胞;(2)靶向性,利用肝癌细胞特异性AFP启动子和增强子进行靶向调控;(3)可控性,通过视黄素、地塞米松、雌激素等药物调控AFP的表达,从而达到对目的基因表达进行调控;(4)灭癌高效性,利用超抗原分子SEA和共刺激分子B7.1双信号免疫激活系统,使肝癌细胞特异性表达强抗原信号SEA的同时,赋予抗原信号共刺激分子B7.1,有效提高肝癌细胞诱导免疫排斥反应的能力;同时利用体外诱导自身T淋巴细胞进行过继免疫治疗,辅助癌区免疫治疗,以增强疗效、治疗转移病灶和预防复发。
实施例(具体操作及应用):
(一)以AFP启动子和增强子为调控元件的治疗用的目的基因SEA和B7.1及其质粒的组建
1.选择AFP高分泌肝癌细胞,分离细胞基因组总DNA,设计特异性引物,通过PCR的方法扩增位于第4号染色体上AFP启动子和顺式增强子的序列,通过CAT(氯霉素转乙酰基酶)报告系统在CHO细胞中检测调控活性及能力;
2.套式PCR定点突变SEA的H81、H187、H225、D227等位点,采用单点或组合突变方式,突变产物插入pCDNA3.1载体中,转染CHO细胞,检测表达产物与MHCII分子的结合能力及免疫激活状况;
3.通过计算机软件二维和三维结构辅助分析线性和空间结构特征,选择B7.1基因和SEA基因的最佳连接方式,将SEA编码基因插入人B7.1基因编码胞外区序列和跨膜区序列之间或直接与B7.1跨膜序列连接,获得B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm融合目的基因,连接后的基因行序列测定;
4.将上述片段克隆至载体pLXSN(Clontech公司产品,属逆转录病毒真核表达载体,非本研究专用载体)中,分析和选择AFP增强子和启动子在编码基因上游LTR中的功能定位,构建以AFP启动子和增强子为调控元件的SEA-B7.1目的基因逆转录真核表达载体。
(二)基因导入系统的组建和工作细胞库的建立及质控
1.采用缺陷型逆转录病毒颗粒为导入系统,将目的基因逆转病毒载体在病毒包装细胞系PA317、2中进行包装,以NIH3T3细胞为待测细胞进行滴度测定;
2.建立相应的种子细胞库和工作细胞库,以标记挽救法和RT-PCR检测复制型病毒;
3.最终病毒制剂的质控,包括病毒滴度及最终制剂所含病毒量检测、内毒素检测、无菌试验、过敏试验和异常毒性试验等项目,达到国家有关规定标准;
(三)病毒介导的体内免疫基因治疗和T细胞进行过继性细胞免疫治疗
1.缺陷病毒颗粒通过经皮穿刺注射、介入或静脉注射等方式注入瘤区,感染人肝癌细胞,表达出SEA-B7.1融合蛋白;
2.通过外周血AFP水平来监测治疗水平,同时通过视黄素、地塞米松和雌激素等药物调节AFP的表达以调整治疗方案;
3.分离提取患者肝癌活检组织或外周血T淋巴细胞,扩大培养后,以目的基因高表达肝癌克隆株进行体外诱导后回输,巩固体内免疫基因治疗的疗效,同时治疗转移病灶并预防复发;
4.综合考虑治疗效果、单次和累计治疗剂量、急性和长期毒副作用、免疫耐受情况等因素,制定相应的联合免疫治疗方案。
Claims (3)
1.肝癌超抗原免疫基因治疗剂的制备方法,其特征在于:从甲胎蛋白AFP高分泌的肝癌细胞中分离细胞基因组总DNA,设计特异性引物,通过PCR方法扩增AFP启动子和顺式增强子序列;分别从肠葡萄球菌场毒素A标准菌株FRI100基因组中通过PCR扩增SEA基因全序列和蛋白编码序列,定点突变SEA基因位点,同时从人B细胞通过反转录PCR分别扩增共刺激分子B7.1基因编码胞外区序列B7.1exc和跨膜区序列B7.1tm;将上述片段克隆至Clontech公司生产的逆转录病毒真核表达载体pLXSN中,分别构建以AFP启动子和增强子为调控元件的B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm目的基因逆转录真核表达载体;将目的基因逆转录病毒载体在病毒包装细胞系PA317、φ2中进行包装;以包装好的缺陷病毒颗粒感染人肝癌细胞,表达出SEA-B7.1融合蛋白;以视黄素、地塞米松、雌激素等药物对SEA-B7.1的表达进行调控,同时通过检测AFP水平来判断治疗效果;
利用AFP特异性调控序列调控目的基因B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm的表达,通过设计特异性引物:5’CGCAACTTAGGGACAAGT 3’TGTTATTGGCAGTGG和5’GCTGGCTTCACAGACTTATG 3’GGAGACCAGTTAGG AAGT,通过PCR方法扩增AFP启动子和顺式增强子序列,其序列如下:
AFP启动子序列
GCAACTTAGGGACAAGTCATCTCTTTGAATATTCTGTAGTTTGAGGAG
AATATTTGTTATATTTGCAAAATAAAATAAGTTTGCAAGTTTTTTTTTTC
TGCCCCAAAGAGCTCTGTGTCCTTGAACATAAAATACAAATAACCGCT
ATGCTGTTAATTATTGGCAAATGTCCCATTTTCAACCTAAGGAAATACC
ATAAAGTAACAGATATACCAACAAAAGGTTACTAGTTAACAGGCATTG
CCTGAAAAGAGTATAAAAGAATTTCAGCATGATTTTCCATATTGTGCT
TCCACCACTGCCAATAACA
AFP增强子序列
GCTGGCTTCACAGACTTATGAAAAAGTAAACGGAATCAGAATTACATCAAT
GCAAAAGCATTGCTGTGAACTCTGTACTTAGGACTAAACTTTGAGCAATAA
CACATATAGATTGAGGATTGTTTGCTGTTAGTATACAAACTCTGGTTCAAAG
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ACGTTTCAACATACAAACCGGGGAGTTTTGCCTGGAATGTTTCCTAAAATG
TGTCCTGTAGCACATAGGGTCCTCTTGTTCCTTAAAATCTAATTACTTTTAG
CCCAGTGCTCATCCCACCTATGGGGAGATGAGAGTGAAAAGGGAGCCTGA
TTAATAATTACACTAAGTCAATAGGCATAGAGCCAGGACTGTTTGGGTAAA
CTGGTCACTTTATCTTAAACTAAATATATCCAAAACTGAACATGTACTTAGTT
ACTAAGTCTTTGACTTTATCTCATTCATACCACTCAGCTTTATCCAGGCCAC
TTATTTGACAGTATTATTGCGAAAACTTCCTAACTGGTCTCC,其特点是将所获得的调控序列置于目的基因上游,特异性调控目的基因的表达。
2.据权利要求1所述的肝癌超抗原免疫基因治疗剂的制备方法,其特征是在肝癌细胞特异性表达超抗原分子SEA和共刺激分子B7.1。设计特殊引物,分别从肠葡萄球菌场毒素A标准菌株FRI100基因组中通过PCR扩增SEA基因全序列和蛋白编码序列,扩增引物分别为5’ATGAAAAAAACAGCATTTAC3’ACTTGTATATAAATAT和5’AGCGAGAAAAGCGAAGAA3’ACTTGTATATAAATATAT,以单点或组合的突变方式,定点突变SEA基因位点,包括H81、H187、H225、D227,设计特殊引物5’ATGGGCCACACACGGAGGC3’TCCACTACCGTTATCAGGAAAATGCTCTTGC和5’(1)GGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGATAACCTGCTCCCATCC(2)GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT3’TTATACAGGGCGTACACT,从人B细胞通过反转录PCR分别扩增共刺激分子B7.1基因编码胞外区序列B7.1exc和跨膜区序列B7.1tm;分别构建获得B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm融合目的基因及以AFP启动子和增强子为调控元件的B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm目的基因逆转录病毒真核表达载体。
3.据权利要求1所述的肝癌超抗原免疫基因治疗剂的制备方法,通过基因工程和细胞生物学手段在肝癌细胞表面建立AFP增强子和启动子特异性调控的超抗原分子SEA和共刺激分子B7.1双信号免疫激活系统,使肝癌细胞特异性表达强抗原信号SEA的同时,赋予抗原信号共刺激分子B7.1,通过介入方式导入癌区;同时利用体外经60Co照射的转染SEA-B7.1的AFP高表达肝癌细胞诱导自身T淋巴细胞进行过继免疫治疗,辅助癌区免疫治疗。
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