CN102038958A - 一种纳米粒子组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多聚阳离子(H1)载体和表达人类白细胞介素-2质粒自组装成的纳米粒子(H1/phIL2)及其在制备治疗、控制或预防癌症的药物中的应用，所述多聚阳离子(H1)载体为环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸三元组装式聚阳离子载体。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于预防或治疗癌症的纳米粒子组合物，特别是涉及表达人类白细胞介素-2细胞因子或者表达人类干扰素α细胞因子的质粒和纳米聚阳离子载体(H1)的纳米粒子组合物及其应用。
背景技术
随着生物医学技术的发展，利用生物制剂治疗肿瘤的生物治疗方案正在兴起。与化疗相比较，对于晚期肿瘤患者来说，生物治疗是一种更具生理性、可耐受性和有效性。目前，应用最广泛的肿瘤生物治疗制剂是重组的细胞因子。细胞因子是一组低分子量的调节蛋白，具有多效性、受体特异性和短暂性的功能特点，是免疫系统的信号调节网络。临床和实验资料已经证实，多种细胞因子能刺激机体抗肿瘤免疫反应，打破肿瘤引起的免疫耐受，从而产生抗肿瘤效果。
白细胞介素-2(interleukin-2)IL-2是一个15000-kDa的α螺旋细胞因子，人类IL-2基因定位于4号染色体4q26-q27，其蛋白编码系列是由462个碱基组成mRNA。自1976年，IL-2首次被发现以来，其生物学功能已经被广泛的研究。内源性IL-2主要是由激活的辅助T淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞产生。它和T细胞表面的特异性受体相结合，快速而又短暂的激活T淋巴细胞，刺激其增殖和成熟，对T细胞调节的免疫反应具有关键性作用。1980年后，随着体外重组的IL-2细胞因子的大规模生产和应用，它的抗肿瘤机制被进一步的阐明。这些包括：刺激T细胞的增值、激活细胞杀伤T细胞，刺激自然杀伤细胞(NK)细胞的增值和细胞杀伤活性，显著增强B细胞、巨噬细胞的免疫功能，能诱导杀伤细胞LAK细胞和激活肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)等等。这些使IL-2成为一个极有价值的抗肿瘤候选药物。1990年后，多种细胞因子，包括：干扰素α(interferon-α)、IL-2、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-4、IL-6、IL-12、IL-18等，被用于恶性黑色素瘤、肾癌患者的临床测试。其中，高剂量的IL-2和IFNα显示了最好的抗肿瘤效果。据此，1998年美国食物和药物管理部批准了高剂量的IL-2细胞因子和IFNα作为中、晚期恶性黑色素瘤或肾癌患者的治疗药物。2004年随访的资料确认，部分IL-2治疗的恶性黑色素瘤患者产生持续了临床反应(Atkins MB.Cytokine-based therapy and biochemotherapy foradvanced melanoma.Clin Cancer Res 2006 Apr 1；12(7Pt2)：2353s-2358s)。
然而，不幸的是，由于细胞因子在体内的半衰期很短，要达到治疗效果需要大剂量的重复注射IL-2细胞因子。例如，美国食物和药物管理部批准的使用IL-2细胞因子治疗晚期恶性黑色素瘤的标准治疗方案是：治疗前5天和治疗开始后的15到19天，每位患者每8小时接受一次静脉推注60000到72000U/Kg的IL-2细胞因子。这种高剂量的IL-2治疗方案在病人身上产生了严重的毒副作用，比如：低血压、毛细血管渗漏综合症，心肌炎，短暂性肾功能不全和导管相关性败血症等。
为了克服这些直接注射细胞因子引起的毒副反应，通过基因治疗方法，传递编码IL-2细胞因子的基因到患者体内，利用患者自身的细胞来持续、高效地合成、分泌IL-2细胞因子。既能减少反复高剂量注射引起的严重毒副反应，同时又能达到抗肿瘤的目的。实现这一设想主要包括两方面的内容。一是克隆治疗基因的系列；二是高效、安全地传递治疗基因。1983年，Taniguchi等已经克隆了编码人类IL-2的基因序列并且表达了具有生物活性的IL-2细胞因子。因此，实现这一治疗方案的关键在于研发一种靶向、安全、有效地传递技术。
目前传递治疗基因的载体主要包括病毒和非病毒两类。一般来说，病毒类载体在表达强度和时空性方面比非病毒类载体更优越。以腺病毒(Adv)为载体转导IL-2基因的治疗方案，已经在多个实验动物模型上显示了良好的抗肿瘤效果。最近，Dummer等报道了他们经肿瘤内注射表达IL-2基因的腺病毒治疗多种晚期癌症的I/II临床测试结果。他们发现，重复瘤内注射腺病毒介导的IL-2显示了17％的目标反应(Dummer R，Rochlitz C，Velu T，Acres B，Limacher JM，Bleuzen P，et al.Intralesional adenovirus-mediated interleukin-2 gene transferfor advanced solid cancers and melanoma.Mol Ther 008；16：985-94)。然而，由病毒载体表面蛋白引发的非期待的宿主免疫反应和潜在的生物安全性问题一直限制着病毒载体的临床应用。这促使很多基因治疗学家将目光转移到非病毒载体。化学合成的非病毒载体主要包括正电子脂质体和聚合物。他们具有非免疫原性、相对安全、容易修饰、制作价格低、方法简便等优点。Galanis等报道，I/II期临床测试中，正电子脂质体携带表达IL-2的质粒通过瘤内注射能治疗恶性黑色素瘤。然而，目前所用的非病毒载体的基因传递效率仍然低于腺病毒载体。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种纳米粒子组合物，采用聚阳离子载体，具有低的毒性和高的转染效率。本发明还提出上述纳米粒子组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是在制备治疗皮肤癌药物中的应用。
在本申请文件中，本发明所用术语基因的“同源序列”指与该基因具有至少75％的核苷酸序列一致性，而且基本上不影响所编码蛋白的功能。基因的同源序列也可以是该基因的片段，只要其编码的蛋白功能基本没有改变。
本发明所用术语“预防或治疗癌症”指所用组合物可以预防癌症的转移或复发，减轻、缓解、控制、改善或治愈原发性癌症或转移性癌症或其相关的症状；也可以延长癌症患者的寿命或活存时间，降低死亡率。
本发明所述术语“氮/磷比”中的“氮”是指多聚阳离子中含有的氨基分子数。“磷”是指质粒脱氧核糖核酸(DAN)中的磷酸根分子含量，常规来说，1ug的质粒DNA含有3nmol的磷酸根。
本发明所述术语pfu(plaque formation unit)为病毒感染滴度，是有感染性的“活”的腺病毒的总量，即腺病毒的活性单位。测定方法是将腺病毒样品经过一系列梯度稀释后，感染293细胞并培养，通过计算细胞病变空斑数得到腺病毒样品中PFU/ml值。
发明人合成一种以环糊精为交联骨架，连接低分子量的聚乙烯亚胺(PEI)，偶合具有肿瘤靶向特异性的小分子药物叶酸的聚阳离子载体(命名为H1)。H1已经被证明在液体环境中能包裹、浓缩表达目的基因的质粒成一种在100纳米左右的纳米颗粒。在多种肿瘤细胞系，这种纳米颗粒显示了低毒、高效和靶向特异性的基因传递能力。尤其在小鼠黑色素瘤细胞系B16-F10上，这种纳米粒子显示了高的转染效率和低的毒性。在B16-F10细胞嫁接的小鼠模型上，通过肿瘤内注射，这种纳米粒子显示了比得上腺病毒载体的基因表达效率。而且经多次瘤内注射，并没有发现明显的毒性反应。
因此本发明的内容包括：
一种纳米粒子组合物，包括质粒和载体；所述质粒为表达人类细胞因子的质粒，所述载体为环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸三元组装式聚阳离子载体，其结构式为：
式中，n为环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸的单元结构，m1为聚乙烯亚胺中的仲氨基单元，m2为聚乙烯亚胺中的叔氨基单元，其中n的值与环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸聚阳离子的分子量有关，m1、m2的值与聚乙烯亚胺的分子量有关。
所述表达人类细胞因子质粒为表达人类白细胞介素-2细胞因子的质粒或者表达人类干扰素α的质粒。
上述纳米粒子组合物在制备预防或治疗癌症的药物中的应用。
尤其是上述纳米粒子组合物在制备预防或治疗恶性黑色素瘤的药物中的应用。
以及一种纳米粒子组合物的制备方法，包括以下步骤：(1)构建表达人类细胞成长因子的质粒；(2)构建环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸三元组装式聚阳离子载体；(3)将步骤(1)、(2)中得到的质粒和载体分别溶解到2.5-5％的葡萄糖溶液中，再按照5-40∶1的氮/磷比将所得溶液混合，形成直径在100纳米左右的纳米粒子组合物。
上述的纳米粒子组合物的制备方法中，所述表达人类细胞生长因子的质粒为表达人类IL-2质粒或表达人类IFN-α质粒。
本发明与现有技术相比所具有的有益效果是：发明人通过创造性劳动，构建了表达人类细胞因子的质粒，并将该质粒与一种环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸三元组装式纳米多聚阳离子(H1)载体按一定的浓度比例，在2.5-5％浓度的葡萄糖溶液中混合，自组装成粒径大小为100纳米左右的纳米粒子组合物，来发挥预防或治疗癌症作用。本发明的组合物不易降解，作用时间长，效果稳定，从而能够有效激活机体的肿瘤特异性免疫反应，从而预防和/或治疗癌症的生长、浸润、转移以及复发。本发明的纳米粒子组合物可用于预防或治疗原发性癌症、转移性癌症，尤其是治疗原发性癌症。与现有技术中采用普通Adv-hIL2的治疗效果比较，利用本发明的H1/phIL2纳米粒子，能在体内持续、稳定表达人类白细胞介素2细胞因子，有相同的抗肿瘤效果，并且可反复注射，更安全。发明人已通过动物实验证明，H1/phIL-2纳米颗粒的抗肿瘤机制主要在于刺激CD4阳性T细胞，CD8阳性T细胞和NK细胞的增值和激活细胞毒型T淋巴细胞和NK细胞的细胞杀伤活性。该纳米粒子在具有抗癌功能的新型基因治疗药物的应用主要通过激活宿主免疫系统，尤其是细胞免疫的抗肿瘤功能，从而达到预防或治疗恶性黑色素瘤的作用。
附图说明
图1为含有hIL2基因的质粒图谱；
图2为纳米粒子组合物的特征图，其中图2A为纳米粒子组合物的粒径大小，图2B为纳米粒子组合物的表面电荷特征；
图3为H1/phIL2组合物体外转染B16-F10黑色素瘤细胞的逆转录PCR结果；
图4为肿瘤周围注射H1/phIL2纳米粒子混合物的基因表达效率；
图5为H1/phIL2在免疫活性小鼠C57/BL 6皮下黑色素瘤模型上的治疗效果图，其中图5A为相关药物治疗后荷瘤鼠的生存时间曲线图；图5B为相关药物治疗后荷瘤鼠的肿瘤生长曲线；
图6为H1/phIL2和Adv-hIL2免疫活性小鼠C57/BL 6皮下黑色素瘤模型上的治疗效果比较图，其中图6A为荷瘤鼠生存时间，图6B为肿瘤生长曲线；
图7为不同的治疗药物引起的荷瘤鼠免疫系统变化的研究结果图，其中，图7A为外周血CD4，cD8和NK淋巴细胞亚群的百分率；图7B为外周血细胞因子数量；图7C为脾脏T淋巴细胞和B淋巴细胞增值活性；图7D为脾脏NK细胞自然杀伤活性。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合试验结果对本发明实现及其效果作进一步详细说明。
本发明的第一个方面，构建表达人类IL2细胞因子的质粒(phIL2)。表达人hIL2细胞因子基因的编码序列被亚克隆到包含CAG启动子、土拨鼠肝炎病毒转录后调节原件(post-transcriptional regulatoryelement of woodchuck hepatitis virus，WPRE)、小牛生长激素(BovineGrowth Hormone，BGH)polyA组成开放读码框架的质粒上。并且在此开放读码框架两侧有倒转末端重复系列(Inverted terminal repeats，ITRs)转录原件。如图1所示，通过测序和检测细胞转染实验确定了该质粒高效表达人类IL2细胞因子。
本发明的第二个方面，合成由环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸三元组装式聚阳离子H1，其结构式为：
n为环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸的单元结构，m1为聚乙烯亚胺中的仲氨基单元，m2为聚乙烯亚胺中的叔氨基单元。其中n的值与环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸聚阳离子的分子量有关。m1，m2的值与聚乙烯亚胺的分子量有关。
上述三元组装式聚阳离子载体的合成方法，可以参见中国专利申请《一种聚阳离子转基因载体及其合成方法》，申请号：200810059345.9，申请日：2008年1月25日。
本发明的第三个方面，分别将H1和phIL2溶解到2.5-5.0％的葡萄糖溶液中，按照5-40∶1的氮/磷比进行混合，形成直径在100纳米左右的纳米粒子组合物。如图2A和图2B所示。从图2A中可以看出：在氮/磷比为10/1到40/1范围内，H1和phIL2质粒DNA组合物的粒子直径大小在100纳米左右。从图2B中可以看出：在氮/磷比为5/1到30/1范围内，H1和phIL2质粒DNA组合物的表面电荷在0到6毫伏之间。
本发明的第四个方面，确定治疗给药方案。
基于下文“预实验”中得到的结果，本发明拟定了每两天在肿瘤周围注射一次H1/phIL2纳米粒子组合物并持续给药2周的实验治疗方案。即：使用上述第三方面描述的H1/phIL2纳米组合物按照不同的剂量，每两天一次，注射到肿瘤组织周围治疗肿瘤。通过研究发现，H1能浓缩、包装质粒DNA成100纳米左右的纳米粒子药物，使用H1/phIL2纳米粒子在体外转染B16-F1黑色素瘤细胞系，确定编码hIL2细胞因子的mRNA有高效的表达。如图3所示，H1/phIL2组合物外转染B16-F1黑色素瘤细胞48小时后，逆转录PCR结果显示，编码hIL2细胞因子的mRNA在该细胞高效表达，证实被发明的H1/phIL2组合物能在细胞内转录表达人类白细胞介素2细胞因子。
实施例
1、试验模型的建立：建立黑色素瘤动物模型。
采用小鼠黑色素瘤B16-F1细胞(2×105个细胞/只，一次性注射)种植于免疫活性小鼠C57BL/6皮下。7天后可见注射部位有一约5×5mm2的隆起，即确认成瘤。
2、试验H1/phIL2纳米组合物对黑色素瘤的预防或治疗作用
(1)预试验：用于研究基因的表达时间，部位和持续时间，确定最佳的治疗策略。
建立黑色素瘤细胞动物模型后，将已成瘤的小鼠随机分成3组(N＝3)：单独注射50ug表达荧光素酶基因的质粒组(pLuc)；注射H1和表达荧光素酶基因的质粒低剂量组(DNA 25ug)；注射H1和表达荧光素酶基因的质粒组(DNA 50ug)。在瘤周注射上述药物后，于24小时，48小时，72小时利用活体生物图像技术，检测荧光素酶的表达强度。同时，在第一次注射后72小时，在同一只小鼠再次注射相同剂量的纳米药物，并在24小时后检测荧光素酶的表达强度。
利用活体生物荧光检测系统(In Vivo imaging)，在B16-F1嫁接的C57/BL 6小鼠上，在不同时间点，监测经瘤周注射H1和表达荧光素酶基因质粒组合物(H1/pLuc，DNA 50ug，N/P 20∶1)的基因表达效率和分布。试验的统计结果如图4所示，在相同条件下，H1携带的质粒的表达效率显著高于单独的质粒的表达效率。在H1/pLuc(DNA 50ug，N/P20∶1)处理组，单位时间内的生物荧光信号强度是H1/pLuc(DNA 25ug，N/P 20∶1)处理组的2.6倍。在注射后24小时达到高峰，并且随着时间的延长而降低。在第一次注射后第三天，相同剂量的纳米组合物被第二次注射(图中向下的箭头所示)。在第二次注射后48小时，相同强度的生物荧光信号又产生。从图4中可以结论：小鼠活体成像实验结果显示，肿瘤周围注射H1和表达荧光素酶基因(Luciferase)报告基因的质粒组合物后24小时是基因表达的最高峰，随后逐步降低。当第二次注射相同数量的纳米粒子组合物后，基因表达效率又可以恢复，并且基因表达的效率和持续时间，显著的依赖于注射的纳米组合物剂量。
(2)治疗实验一
依据预实验结果，拟定每隔两天注射一次药物，并且持续给药到小鼠死亡或者当肿瘤体积达到2000立方毫米的实验方案。首先建立黑色素瘤细胞动物模型，确认成瘤后立即给药，将已成瘤的小鼠随机分成5组(N＝9)：①注射2.5％葡萄糖对照组；②注射50ug的p IL2质粒对照组；③注射H1和表达EGFP(DNA 50ug，N/P 20∶1)质粒组合物对照组；④注射H1和表达hIL2(DNA 25ug，N/P 20∶1)质粒组合物低剂量治疗组；⑤注射H1和表达hIL2(DNA 50ug，N/P 20∶1)质粒组合物高剂量治疗组。
分别在治疗后一周和两周，每组提取3只小鼠的外周血检测各种淋巴细胞亚群百分率和细胞因子变化。提取小鼠脾脏淋巴细胞并分离脾脏NK细胞测试淋巴细胞增值活性和NK细胞杀伤活性。
如图5A和图5B所示，与对照组(包括：①单独的注射2.5％葡萄糖溶液对照组；②单独的注射相同剂量pIL2质粒对照组；③注射相同剂量的H1/pEGFP纳米粒子对照组)相比较，治疗组(包括④注射H1/phIL2，DNA50ug/次；和⑤注射H1/phIL2，DNA 25ug/次)能显著的抑制肿瘤生长，并且高剂量治疗组优于低剂量治疗组。低剂量治疗组荷瘤鼠存活时间从对照组的平均21天延长到45天。在高剂量治疗组，有40％的荷瘤鼠的存活时间超过60天。
如图7A所示，流式细胞仪测试结果显示，在治疗一周后，治疗组外周血的T辅助细胞，细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK)细胞的数量显著地高于对照组，其中NK细胞增加最为显著。而且在CD8阳性T淋巴细胞和NK细胞增加，显著地依赖于H1/phIL2的剂量。同时，治疗组外周血的细胞因子，例如白介素2，白介素4，干扰素，肿瘤坏死因子，白介素4和白介素17等也显著地高于对照组。
如图7B所示，外周血细胞因子检测结果显示，在H1/phIL2治疗组，IL-2、IL-6、γ-干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)，IL-4和IL-17都显著性地增加。
如图7C所示，脾脏淋巴细胞增值活性实验结果显示，H1/phIL2治疗组对脂多糖(LPS)和刀豆蛋白A(ConA)的刺激活性明显的高于对照组。如图7D所示，脾脏NK细胞杀伤活性实验结果显示，H1/phIL2治疗组的脾脏NK细胞对YAC-1细胞的杀伤活性显著性地高于对照组。这些结果说明，瘤周注射H1/phIL2后，显著地刺激了实验鼠的免疫系统，使其免疫细胞和器官都处于高度的激活和增生状态。尤其是细胞调节的免疫反应，例如T淋巴细胞和NK细胞处于高度激活的状态。其中，NK细胞的活性和增值状态在治疗后两周仍然保持，这说明，hIL2具有更强的调节NK细胞的功能，也可能说明在此动物模型中，NK细胞承担了更为重要的抗肿瘤作用。此外，治疗组显示了较低调节性T细胞百分率。调节性T细胞目前被认为是一种肿瘤抑制宿主免疫攻击的细胞，在多种肿瘤患者，调节性T细胞常常高于正常人。这些说明，高剂量的hIL-2也可以抑制调节性T细胞的增加。这些结果与已经报到的白细胞介素2具有刺激T细胞，NK细胞增值和激活细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞的细胞杀伤活性等功能相一致。
(3)治疗实验二
为了比较H1/phIL2和Adv-hIL2的治疗效果，发明人设计了此实验。建立黑色素瘤细胞动物模型，确认成瘤后立即给药，将已成瘤的小鼠随机分成5组(N＝5)：①注射PBS对照组；②注射Adv-EGFP(2×108，pfu)对照组；③单次注射Adv-hIL2(2×108，pfu)对照组；④每两天注射一次H1和表达hIL2(DNA 50ug，N/P 20/1)质粒组合物治疗组；⑤每两天注射一次Adv-hIL2(2×108，pfu)对照组。
如图6所示，H1/pIL2(DNA 50ug)治疗组的抑瘤效果好于单次注射Adv-hIL2(2×108，pfu)对照组，略差于每周两次注射Adv-hIL2(2×108，pfu)对照组。H1/pIL2(DNA 50ug)治疗组的荷瘤鼠存活时间长于单次注射Adv-hIL2(2×108，pfu)治疗组，超过60天的荷瘤鼠存活百分率低于多次注射Adv-hIL2(2×108，pfu)对照组。
上述实验研究结果充分证明：注射本发明所述的H1/phIL2纳米颗粒药物，可以刺激免疫细胞和器官的增值，促进Th1和Th2细胞因子的分泌，增加细胞调节的免疫反应的活性，激活宿主免疫系统的抗肿瘤活性，从而有效地抑制黑色素瘤实验动物模型的生长，延长荷瘤鼠的存活时间。
因此，本发明的纳米组合物可用于预防或治疗实体肿瘤的生长、浸润、转移以及复发中。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。例如：上述实施方案中所述的表达人类细胞因子白细胞介素-2的质粒可以被表达人类细胞因子干扰素α(phIFN-α)的质粒所替换，从而产生H1/phIFN-α的纳米粒子。H1/pIFN-α纳米粒子完全可以在体内高效表达。多个临床测试结果已经显示，高剂量细胞因子干扰素α(IFN-α)也可以特异性的激活机体的抗肿瘤免疫反应，从而起到抑瘤效果辅助治疗。美国FDA也批准了高剂量的细胞因子干扰素α(IFN-α)作为恶性黑色素瘤的辅助治疗药物(HensinTsao，M.D.，Ph.D.，Michael B.Atkins，M.D.，and Arthur J.Sober，M.D.Management of Cutaneous Melanoma.The New England Journal ofMedicine，2004；351：998-1012)。据此，我们可以简单推导出H1/phIFN-α也可以用于恶性黑色素瘤的治疗，所以，包含H1载体和表达细胞因子干扰素α(IFN-α)质粒的组合物及其药物用途，也应该包括在本发明的保护范围当中。
Claims (8)
1.一种纳米粒子组合物，其特征在于：包括质粒和载体；所述质粒为表达人类细胞因子的质粒，所述载体为环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸三元组装式聚阳离子载体，其结构式为：
式中，n为环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸的单元结构，m1为聚乙烯亚胺中的仲氨基单元，m2为聚乙烯亚胺中的叔氨基单元，其中n的值与环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸聚阳离子的分子量有关，m1、m2的值与聚乙烯亚胺的分子量有关。
2.如权利要求1所述的纳米粒子组合物，其特征在于：所述表达人类细胞因子质粒为表达人类白细胞介素-2细胞因子的质粒。
3.如权利要求1所述的纳米粒子组合物，其特征在于：所述表达人类细胞因子质粒为表达人类干扰素α细胞因子的质粒。
4.如权利要求1所述的纳米粒子组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)构建表达人类细胞生长因子的质粒；
(2)构建环糊精-聚乙烯亚胺-叶酸三元组装式聚阳离子载体；
(3)将步骤(1)、(2)中得到的质粒和载体分别溶解到2.5-5％的葡萄糖溶液中，再按照5-40∶1的氮/磷比将所得溶液混合，形成直径在100纳米左右的纳米粒子组合物。
5.如权利要求4所述的纳米粒子组合物的制备方法，其特征在于：所述表达人类细胞因子质粒为表达人类白细胞介素-2细胞因子的质粒或者为表达人类干扰素α细胞因子的质粒。
6.如权利要求1所述的纳米粒子组合物在制备预防或治疗癌症的药物中的应用。
7.如权利要求1所述的纳米粒子组合物在制备预防或治疗原发性癌症或转移性癌症的药物中的应用。
8.如权利要求2或3所述的纳米粒子组合物在制备预防或治疗黑色素瘤的药物中的应用。
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2009
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