CN117159561A - 一种具有抗肥胖功效的亚麻籽多糖发酵物及其制备方法与应用 - Google Patents
一种具有抗肥胖功效的亚麻籽多糖发酵物及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有抗肥胖功效的亚麻籽多糖发酵物，所述发酵物以亚麻籽多糖为底物，经肠道瘦肉梭菌发酵制得；以质量百分比计，所述发酵物含有褐藻素6.5～8.0wt％，棕榈酰乙酰胺6.0～7.0wt％，莴苣苦素6.5～8.0wt％，贯叶金丝桃素5.5～6.5wt％，醋酸炔诺酮6.0～7.0wt％。与现有技术相比，本发明使用肠道瘦肉梭菌发酵亚麻籽多糖制备亚麻籽多糖发酵物，提高了亚麻籽多糖中与抗肥胖作用相关的物质的含量，使得亚麻籽多糖发酵物的抗肥胖作用进一步增强，并通过改善肝脏的血脂代谢，降低全身的体脂水平。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域，特别涉及一种具有抗肥胖功效的亚麻籽多糖发酵物及其制备方法与应用。
背景技术
在过去几十年中，肥胖已成为全球范围内日益严重的公共卫生问题。肥胖能够大大提高许多慢性病比如2型糖尿病、冠心病和某些类型的癌症的患病风险，给家庭和社会带来巨大的医疗和经济负担。因此，对肥胖进行积极的干预十分必要。饮食和运动是对肥胖进行干预的常见手段，其中许多植物性食物中的天然活性成分比如植物多酚和非淀粉多糖等具有良好的肥胖干预效果。非淀粉多糖在人体内不能被直接吸收，而是进入大肠被肠道菌群发酵后产生不同代谢物，被肠上皮组织吸收后再发挥作用。
亚麻籽多糖是从亚麻籽中提取出来的一种非淀粉多糖，目前现有技术中亚麻籽多糖的制备方法包括以下步骤：以干燥亚麻籽壳为原料，采用热水浸提法得到亚麻籽粗多糖提取液，过滤出去亚麻籽壳，收集滤液，减压浓缩至一定体积；在上述滤液中加入三倍体积的无水乙醇，于4℃静置12h以上使得多糖沉淀完全，离心，沉淀为粗多糖；将粗多糖中的乙醇去除后在用蒸馏水复溶，采用木瓜蛋白酶脱除亚麻籽粗多糖中的游离及结合蛋白，酶处理后高温灭酶，离心除去变性酶沉淀，取上清液浓缩至适宜浓度后经冷冻干燥得到亚麻籽多糖。所述亚麻籽多糖具有良好的促进体脂代谢(抗肥胖)作用，因此具有应用于功能性食品的潜力。然而，通过直接提取而获得的亚麻籽多糖中与抗肥胖作用相关的有效成分含量有限，其抗肥胖功效也有限，且其具有非常强的亲水性和较高的粘度，在水溶液中容易结团，导致水分难以向结团的多糖内部迁移，从而使亚麻籽多糖溶解不充分，导致亚麻籽多糖应用于功能性食品时存在人体利用率不高的问题，限制了亚麻籽多糖在功能性食品等领域中的应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提出一种具有抗肥胖功效的亚麻籽多糖发酵物的制备方法。
本发明的第一个目的是提供一种具有抗肥胖功效的亚麻籽多糖发酵物，所述发酵物以亚麻籽多糖为底物，经肠道瘦肉梭菌发酵制得；以质量百分比计，所述发酵物含有褐藻素6.5～8.0wt％，棕榈酰乙酰胺6.0～7.0wt％，莴苣苦素6.5～8.0wt％，贯叶金丝桃素5.5～6.5wt％，醋酸炔诺酮6.0～7.0wt％。
与现有技术相比，本发明使用肠道瘦肉梭菌发酵亚麻籽多糖制备亚麻籽多糖发酵物，提高了亚麻籽多糖中与抗肥胖作用相关的物质的含量，使得亚麻籽多糖发酵物的抗肥胖作用进一步增强。
进一步地，以质量百分比计，所述发酵物含有褐藻素7.2～8.0wt％，棕榈酰乙酰胺6.5～7.0wt％，莴苣苦素7.2～8.0wt％，贯叶金丝桃素5.9～6.5wt％，醋酸炔诺酮6.3～7.0wt％。
进一步地，所述发酵物的黏度为4500～7500mpa.s。
进一步地，所述亚麻籽多糖为多糖混合物，其单糖组成包括L-阿拉伯糖、D-木糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-岩藻糖和L-半乳糖。
本发明的第二个目的是提供一种所述具有抗肥胖功效的亚麻籽多糖发酵物的制备方法，包括以下步骤：制备以亚麻籽多糖为底物的发酵培养基，将活化后的肠道瘦肉梭菌接种于所述发酵培养基中，进行发酵培养后，得到亚麻籽多糖发酵物。
进一步地，所述发酵培养基的成分包括10mg/mL亚麻籽多糖、2mg/mL酵母提取物、2mg/mL蛋白胨、0.5mg/mL胆汁盐、0.02mg/mL氯化血红素、2mg/mL NaHCO3、0.1mg/mL NaCl、0.01mg/mL CaCl2·6H2O、0.01mg/mL MgSO4·7H2O、0.04mg/mL K2HPO4、0.04mg/mL KH2PO4、0.01mg/mL维生素K1、2μL/mL Tween-80和0.5mg/mL水合半胱氨酸盐酸盐；所述发酵培养基通过混合所述发酵培养基的成分，调节pH至7±0.5后灭菌制得。
进一步地，所述的肠道瘦肉梭菌为Clostridium leptum Moore et al.。
进一步地，所述活化的方法为将肠道瘦肉梭菌接种至RCM液体培养基，于37℃培养24h；所述活化后的肠道瘦肉梭菌接种至RCM液体培养基，于32～42℃静置扩大培养20～36h，得到菌种种子液，调整菌种种子液的浓度并接种于所述发酵培养基中进行发酵培养；所述菌种种子液的浓度为105～107个/mL，接种量为体积百分比8～12％；所述发酵培养的条件为32～42℃厌氧发酵6～10h。
进一步地，所述扩大培养条件为37℃静置培养24h，所述发酵培养的条件为37℃厌氧发酵8h，所述菌种种子液的浓度为106个/mL，接种量为体积百分比10％。
本发明的第三个目的是提供所述具有抗肥胖功效的亚麻籽多糖发酵物在减肥方面的应用。
说明书附图
图1为本发明不同实施例制备的发酵物在25℃时的粘度。
图2为本发明造模期间肥胖大鼠的体重变化。
图3为本发明不同实施例干预肥胖大鼠期间肥胖大鼠的体重变化。
图4为本发明不同实施例干预肥胖大鼠6周后肥胖大鼠的血脂水平。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
由于亚麻籽多糖溶解性差导致其在人体的利用率有限，因此本发明拟通过一种手段对亚麻籽多糖进行深加工，实现部分降解亚麻籽多糖，改善其粘度和溶解性，同时保持甚至增加亚麻籽多糖中与抗肥胖相关的有效成分含量。
为了找到一种能够降解亚麻籽多糖且增加亚麻籽多糖发酵物中与抗肥胖相关的有效成分含量的菌株，我们进行了以下筛选过程：
首先，采用高脂饮食构建肥胖大鼠模型，用亚麻籽多糖干预肥胖大鼠6周后，分析肥胖大鼠的体重变化、体脂肪含量和血脂水平，并采用16S rDNA测序分析大鼠肠道菌群的结构，研究发现亚麻籽多糖的抗肥胖作用与梭状芽胞杆菌(Clostridium，以下简称梭菌)的丰度呈正相关性，因此梭菌可能是降解亚麻籽多糖的关键属。
然后采用梭菌属中的多种梭菌分别发酵亚麻籽多糖，所述梭菌包括丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、椰状梭菌(Clostridium cocleatum)、普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、耳蜗形梭菌(Clostridium cocleatum)和肠道瘦肉梭菌(Clostridium leptum)；用所得发酵物干预肥胖大鼠6周，分析肥胖大鼠的体重变化、体脂肪含量和血脂水平，同时采用非靶向代谢组学测量亚麻籽多糖及其发酵物中活性成分的含量，研究发现，肠道瘦肉梭菌能够降解亚麻籽多糖且增加亚麻籽多糖发酵物中与抗肥胖相关的有效成分含量。
以下具体介绍肠道瘦肉梭菌发酵亚麻籽多糖制备具有抗肥胖功效发酵物的方法。
其中，本发明中涉及的肠道瘦肉梭菌为Clostridium leptum Moore et al.1976(ATCC 29065)，购自德国DSM菌种保藏中心。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得，本发明中涉及的化学试剂均为分析纯。
实施例1
本发明具有抗肥胖功效的亚麻籽多糖发酵物的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备发酵培养基：按1g亚麻籽多糖：100mL水的配比将亚麻籽多糖与水混合，并加入酵母提取物(终浓度为2.0mg/mL)、蛋白胨(终浓度为2.0mg/mL)、胆汁盐(终浓度为0.5mg/mL)、血红素(终浓度为0.02mg/mL)、水合半胱氨酸盐酸盐(终浓度为0.5mg/mL)、碳酸氢钠(终浓度为2.0mg/mL)、氯化钠(终浓度为0.1mg/mL)、六水合氯化钙(终浓度为0.01mg/mL)、七水合硫酸镁(终浓度为0.01mg/mL)、磷酸氢二钾(终浓度为0.04mg/mL)、磷酸二氢钾(终浓度为0.04mg/mL)、维生素K1(终浓度为0.01mg/mL)和吐温80(终浓度为2.0μL/mL)，混合均匀，调节pH为7.2、高温高压灭菌(121℃灭菌30min)后得到发酵培养基。
(2)制备菌种种子液：将肠道瘦肉梭菌Clostridium leptum Moore et al.通过RCM液体培养基37℃活化24h培养后，再接种到新的RCM液体培养基中进行37℃静置扩大培养24h，调整菌液浓度为106个/mL，得到对应的菌种种子液。
(3)液体发酵：将步骤(2)得到的菌种种子液接种到步骤(1)得到的发酵培养基中，菌种种子液的接种体积为10％(v/v)，进行37℃单菌种振荡发酵培养6h得到发酵物。
发酵终点后发酵物粘度为7200mpa.s。所得发酵物用于动物实验灌胃肥胖模型大鼠，结果显示发酵物有轻微缓解体重增长作用。
实施例2
本实施例与实施例1相比，区别仅在于将步骤(3)中的37℃单菌种振荡发酵培养6h替换为37℃单菌种振荡发酵培养7h，其他方法步骤与实施例1相同。
发酵终点后发酵物粘度为6900mpa.s。所得发酵物用于动物实验灌胃肥胖模型大鼠，结果显示发酵物有轻微缓解体重增长作用。
实施例3
本实施例与实施例1相比，区别仅在于将步骤(3)中的37℃单菌种振荡发酵培养6h替换为37℃单菌种振荡发酵培养8h，其他方法步骤与实施例1相同。
发酵终点后发酵物粘度为5100mpa.s。所得发酵物用于动物实验灌胃肥胖模型大鼠，结果显示发酵物有显著缓解体重增长作用。
实施例4
本实施例与实施例1相比，区别仅在于将步骤(3)中的37℃单菌种振荡发酵培养6h替换为37℃单菌种振荡发酵培养9h，其他方法步骤与实施例1相同。
发酵终点后发酵物粘度为4800mpa.s。所得发酵物用于动物实验灌胃肥胖模型大鼠，结果显示发酵物有显著缓解体重增长作用。
实施例5
本实施例与实施例1相比，区别仅在于将步骤(3)中的37℃单菌种振荡发酵培养6h替换为37℃单菌种振荡发酵培养10h，其他方法步骤与实施例1相同。
发酵终点后发酵物粘度为4700mpa.s。所得发酵物用于动物实验灌胃肥胖模型大鼠，结果显示发酵物有显著缓解体重增长作用。
对比例1(与实施例1的区别在于接种后马上进行巴氏灭菌得混合培养物)
(1)制备发酵培养基：按1g亚麻籽多糖：100mL水的配比将亚麻籽多糖与水混合，并加入酵母提取物(终浓度为2.0mg/mL)、蛋白胨(终浓度为2.0mg/mL)、胆汁盐(终浓度为0.5mg/mL)、血红素(终浓度为0.02mg/mL)、水合半胱氨酸盐酸盐(终浓度为0.5mg/mL)、碳酸氢钠(终浓度为2.0mg/mL)、氯化钠(终浓度为0.1mg/mL)、六水合氯化钙(终浓度为0.01mg/mL)、七水合硫酸镁(终浓度为0.01mg/mL)、磷酸氢二钾(终浓度为0.04mg/mL)、磷酸二氢钾(终浓度为0.04mg/mL)、维生素K1(终浓度为0.01mg/mL)和吐温80(终浓度为2.0μL/mL)，混合均匀，调节pH为7.2、高温高压灭菌(121℃灭菌30min)后得到发酵培养基。
(2)制备菌种种子液：将肠道瘦肉梭菌Clostridium leptum Moore et al.通过RCM液体培养基37℃活化24h培养后，再接种到新的RCM液体培养基中进行37℃静置扩大培养24h，调整菌液浓度为106个/mL，得到对应的菌种种子液。
(3)液体发酵：将步骤(2)得到的菌种种子液接种到步骤(1)得到的发酵培养基中，菌种种子液的接种体积为10％(v/v)，接种后马上进行巴氏灭菌得混合培养物。
混合培养物粘度为9000mpa.s。所得混合培养物用于动物实验灌胃肥胖模型大鼠，结果显示对照例无缓解体重增长作用。
试验例1：发酵物粘度测试
以实施例1～5和对比例1制备的样品进行下面实验。
在25℃下用旋转粘度计测定发酵物的黏度，从而评估各实施例发酵效果情况。参阅图1，随着发酵时间的延长，发酵物的黏度下降越明显，表明肠道瘦肉梭菌能够利用亚麻籽多糖，时间越长利用率越高。
试验例2：与抗肥胖作用相关的物质的含量测定
采用AB SCIEX公司的超高效液相色谱串联飞行时间质谱UPLC-TripleTOF系统检测实施例1～5和对比例1制备的样品中与抗肥胖作用相关的物质的含量。
样品制备：将发酵液和提取液按1:4的体积比进行混合，于5℃、40KHz超声提取30min，将样品静置于-20℃，30min，然后4℃，13000×g离心15min，移取上清液，氮气吹干后用120μL复溶液复溶，于4℃、40KHz超声提取5min后4℃，13000×g离心15min，收集上清液至进样小瓶中；其中，提取液为乙腈和甲醇按体积比1：1混合得到，复溶液为乙腈和水按体积比1：1混合得到。
色谱条件：采用规格为100mm×2.1mm，孔径为1.8μm的BEH C18色谱柱检测样品，按表1中的程序进行梯度洗脱，柱温设置为40℃，进样量为10μL，流速为0.40mL/min；其中，流动相A为浓度为体积百分比0.1％的甲酸水溶液，流动相B为按体积比1：1混合得到的乙腈/异丙醇溶液且含体积百分比0.1％的甲酸。
表1梯度洗脱程序
质谱条件：采用正负离子扫描模式采集样品质谱信号，质量扫描范围m/z：50-1000。离子喷雾电压，正离子电压5000V，负离子电压4000V，去簇电压80V，喷雾气50psi，辅助加热气50psi，气帘气30psi，离子源加热温度500℃，20-60V循环碰撞能。
实施例1～5和对比例1制备的样品中与抗肥胖作用相关的物质的含量如表2所示。与对照组相比，实施例1～5组经不同时间发酵后，发酵物中具有抗肥胖作用的代谢物的含量显著上升，所述代谢物包括褐藻素、棕榈酰乙酰胺、莴苣苦素、贯叶金丝桃素和醋酸炔诺酮，且随着发酵时间越长的实施例组中具有抗肥胖作用的代谢物含量越高。
表2：各实验组样品中与抗肥胖作用相关的物质的质量百分比(％)
试验例3：抗肥胖功效测定
以实施例1～5和对比例1制备的样品进行下面实验。
将购自广东省医学实验动物中心的四周龄雄性SD大鼠分为空白组和模型组两大组，模型组喂食高脂饲料建立肥胖模型，空白组喂食普通饲料作为对照，造模期间每周记录每组大鼠的体重。肥胖模型建立后，将模型组细分为肥胖模型组、实施例1组、实施例2组、实施例3组、实施例4组、实施例5组和对照例组。肥胖模型组每日1次灌胃剂量为1mL/kg的无菌水，持续6周；对照组每日1次灌胃剂量为1mL/kg的对比例1制备的混合培养物，持续6周；实例1～5组每日1次分别灌胃剂量为1mL/kg的实施例1～5制备的发酵物，持续6周。灌胃期间每周记录每组大鼠的体重。6周后戊巴比妥钠麻醉安乐死大鼠，收集大鼠血清测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)含量。
参阅图2，经过为期8周的建立肥胖模型处理后，模型组大鼠的平均体重比空白组高20.1％，且具有显著性差异，表明肥胖模型建模成功。
参阅图3，与肥胖模型组相比，对照组大鼠的平均体重降低但不显著，而实施例1～5组的大鼠平均体重显著降低，且具有抗肥胖作用的代谢物含量越高的实施例组的大鼠平均体重越低，表明肠道瘦肉梭菌发酵亚麻籽多糖的发酵物具有降低肥胖大鼠体重的功效。在第6周时，实施例1组和实施例2组间的大鼠平均体重无显著性差异，实施例3～5组间大鼠的平均体重无显著性差异，但实施例1、2组大鼠的平均体重显著高于实施例3～5组大鼠的平均体重，表明发酵时间为8～10h的发酵物的抗肥胖效果极佳且无显著差异。
参阅图4，对照组大鼠与肥胖模型组大鼠的TC水平、TG水平、LDL-c水平和HDL-c水平无显著差异，而实施例1～5组大鼠的TC水平、TG水平与肥胖模型组大鼠相比均显著下降。实施例1、2组大鼠的LDL-c水平和HDL-c水平与肥胖模型组大鼠没有显著差异，而实施例3～5组大鼠的LDL-c水平与肥胖模型组大鼠相比显著下降，HDL-c水平与肥胖模型组大鼠相比显著上升，表明实施例1～5的发酵物具有改善肥胖大鼠血脂代谢的作用，且具有抗肥胖作用的代谢物含量越高的实施例组的大鼠TC水平、TG水平、LDL-c水平越低，HDL-c水平越高。另外，实施例3～5组大鼠的TC水平、TG水平、LDL-c水平和HDL-c水平无显著差异。
综合抗肥胖效果与成本来看，实施例3即发酵时间为8h的发酵物具有良好的抗肥胖效果。
本发明与现有技术相比有以下优点：本发明使用肠道瘦肉梭菌发酵亚麻籽多糖制备亚麻籽多糖发酵物，提高了亚麻籽多糖中与抗肥胖作用相关的物质的含量，使得亚麻籽多糖发酵物的抗肥胖作用进一步增强，并通过改善肝脏的血脂代谢，降低全身的体脂水平。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具有抗肥胖功效的亚麻籽多糖发酵物，其特征在于，所述发酵物以亚麻籽多糖为底物，经肠道瘦肉梭菌发酵制得；以质量百分比计，所述发酵物含有褐藻素6.5～8.0wt％，棕榈酰乙酰胺6.0～7.0wt％，莴苣苦素6.5～8.0wt％，贯叶金丝桃素5.5～6.5wt％，醋酸炔诺酮6.0～7.0wt％。
2.如权利要求1所述亚麻籽多糖发酵物，其特征在于，以质量百分比计，所述发酵物含有褐藻素7.2～8.0wt％，棕榈酰乙酰胺6.5～7.0wt％，莴苣苦素7.2～8.0wt％，贯叶金丝桃素5.9～6.5wt％，醋酸炔诺酮6.3～7.0wt％。
3.如权利要求2所述亚麻籽多糖发酵物，其特征在于，所述发酵物的黏度为4500～7500mpa.s。
4.如权利要求3所述亚麻籽多糖发酵物，其特征在于，所述亚麻籽多糖为多糖混合物，其单糖组成包括L-阿拉伯糖、D-木糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-岩藻糖和L-半乳糖。
5.一种如权利要求1所述具有抗肥胖功效的亚麻籽多糖发酵物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：制备以亚麻籽多糖为底物的发酵培养基，将活化后的肠道瘦肉梭菌接种于所述发酵培养基中，进行发酵培养后，得到亚麻籽多糖发酵物。
6.如权利要求5所述亚麻籽多糖发酵物的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包括10mg/mL亚麻籽多糖、2mg/mL酵母提取物、2mg/mL蛋白胨、0.5mg/mL胆汁盐、0.02mg/mL氯化血红素、2mg/mL NaHCO3、0.1mg/mL NaCl、0.01mg/mL CaCl2·6H2O、0.01mg/mLMgSO4·7H2O、0.04mg/mL K2HPO4、0.04mg/mL KH2PO4、0.01mg/mL维生素K1、2μL/mL Tween-80和0.5mg/mL水合半胱氨酸盐酸盐；所述发酵培养基通过混合所述发酵培养基的成分，调节pH至7±0.5后灭菌制得。
7.如权利要求6所述亚麻籽多糖发酵物的制备方法，其特征在于，所述的肠道瘦肉梭菌为Clostridium leptum Moore et al.。
8.如权利要求7所述亚麻籽多糖发酵物的制备方法，其特征在于，所述活化的方法为将肠道瘦肉梭菌接种至RCM液体培养基，于37℃培养24h；所述活化后的肠道瘦肉梭菌接种至RCM液体培养基，于32～42℃静置扩大培养20～36h，得到菌种种子液，调整菌种种子液的浓度并接种于所述发酵培养基中进行发酵培养；所述菌种种子液的浓度为105～107个/mL，接种量为体积百分比8～12％；所述发酵培养的条件为32～42℃厌氧发酵6～10h。
9.如权利要求8所述亚麻籽多糖发酵物的制备方法，其特征在于，所述扩大培养条件为37℃静置培养24h，所述发酵培养的条件为37℃厌氧发酵8h，所述菌种种子液的浓度为106个/mL，接种量为体积百分比10％。
10.权利要求1-9任一所述具有抗肥胖功效的亚麻籽多糖发酵物在减肥方面的应用。
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