CN117159513A - 一种镰叶芹二醇在制备抗菌药物中的应用、抗菌药物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了镰叶芹二醇在制备抗菌药物中的应用、抗菌药物,所述菌包括抗枯草芽胞杆菌、产气杆菌、青枯假单胞菌和根癌农杆菌中的一种或几种,属于抗菌药物技术领域。药理研究结果表明,镰叶芹二醇对枯草芽胞杆菌、产气杆菌、青枯假单胞菌和根癌农杆菌均具有良好的抗菌作用,且对枯草芽胞杆菌抑制活性接近广谱抗菌药物氧氟沙星,本发明提供的应用为镰叶芹二醇在抗枯草芽胞杆菌、产气杆菌、青枯假单胞菌和根癌农杆菌的抗菌药物的制备提供了科学严谨的实验证据,为临床用药开发奠定了工作基础,具有良好的经济效益和临床指导价值。
Description
技术领域
本发明属于抗菌药物技术领域,具体涉及一种镰叶芹二醇在制备抗菌药物中的应用、抗菌药物。
背景技术
镰叶芹二醇(Falcarindiol),其分子式为C17H24O2,英文名为Falcarindiol,英文系统命名为(3R,8S,Z)-heptadeca-1,9-dien-4,6-diyne-3,8-diol,是一种从胡萝卜中得到的聚乙炔,属于嘧啶类化合物。镰叶芹二醇具有多种生物活性,例如抗肿瘤、抗炎和抗菌效果。现有技术(Laetitia Meot-Duros,et al.New antibacterial and cytotoxicactivities of falcarindiol isolated in Crithmum maritimum L.leaf extract[J].Food and Chemical Toxicology.2010,48(2),553-557)公开了镰叶芹二醇的抗部分革兰氏阴性菌、部分革兰氏阳性菌及白色念珠菌的活性。然而,目前的现有技术中并无镰叶芹二醇对枯草芽胞杆菌、产气杆菌、青枯假单胞菌和根癌农杆菌的抗菌活性的报道。
发明内容
有鉴于此,本发明目的在于提供一种镰叶芹二醇在制备抗菌药物中的应用、抗菌药物,本发明提供了镰叶芹二醇对枯草芽胞杆菌、产气杆菌、青枯假单胞菌和根癌农杆菌的抗菌活性的新用途,为开发抗枯草芽胞杆菌、产气杆菌、青枯假单胞菌和根癌农杆菌的抗菌药物提供了依据。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明提供了镰叶芹二醇在制备抗菌药物中的应用,所述菌包括枯草芽胞杆菌、产气杆菌、青枯假单胞菌和根癌农杆菌中的一种或几种。
优选的,所述镰叶芹二醇的提取方法,包括以下步骤:
将白前花胡根与乙醇水溶液混合,进行醇提后浓缩,得到醇提取浸膏;
将所述醇提取浸膏溶解于水中后有机溶剂萃取,将所得有机相进行浓缩,得到萃取浸膏;所述有机溶剂包括二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇中的一种或几种;
将所述萃取浸膏进行第一硅胶柱色谱分离,得到组分Fr.6;所述第一硅胶柱色谱分离采用的洗脱剂包括石油醚-乙酸乙酯,所述石油醚-乙酸乙酯中石油醚和乙酸乙酯的体积比为25:1~0:1;
将所述组分Fr.6进行第二硅胶色谱柱分离,得到组分B;所述第二硅胶色谱柱分离采用的洗脱剂包括纯甲醇和/或甲醇水溶液,所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为40~99%;
将所述组分B依次进行凝胶柱色谱分离和半制备色谱分离,得到镰叶芹二醇;
所述凝胶柱色谱分离采用的洗脱剂包括氯仿-甲醇混合溶液,所述氯仿-甲醇混合溶液中氯仿的体积分数为50%;
所述半制备色谱分离采用的洗脱剂包括甲醇水溶液,所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为40~60%。
优选的,所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为80~95%;所述白前花胡根的干重和乙醇水溶液的总体积之比为1kg:5~10L。
优选的,所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为85~90%。
优选的,所述醇提的温度为50~80℃;所述醇提的次数为3~5次;单次醇提的时间为1~2h。
优选的,所述醇提取浸膏的质量和有机溶剂的总体积比为1kg:3~5L。
优选的,所述第一硅胶柱色谱分离的洗脱方式为梯度洗脱,所述梯度洗脱过程中石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1和0:1。
本发明提供了一种抗菌药物,包括镰叶芹二醇和药学上可接受的辅料。
优选的,所述抗菌药物中镰叶芹二醇质量百分含量为0.02~0.03%。
优选的,所述抗菌药物的剂型包括注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、膏剂和栓剂中的一种或几种。
本发明提供了一种镰叶芹二醇在制备抗菌药物中的应用,所述菌包括枯草芽胞杆菌、产气杆菌、青枯假单胞菌和根癌农杆菌中的一种或几种。药理研究结果表明,镰叶芹二醇对枯草芽胞杆菌、产气杆菌、青枯假单胞菌和根癌农杆菌均具有良好的抗菌作用,且对枯草芽胞杆菌抑制活性接近广谱抗菌药物氧氟沙星,为镰叶芹二醇在抗枯草芽胞杆菌、产气杆菌、青枯假单胞菌和根癌农杆菌的抗菌药物的制备提供了科学严谨的实验证据,为临床用药开发奠定了工作基础,具有良好的经济效益和临床指导价值。
本发明提供了一种抗菌药物,包括镰叶芹二醇和药学上可接受的辅料。本发明提供的抗菌药物具有良好的抗枯草芽胞杆菌、产气杆菌、青枯假单胞菌和根癌农杆菌效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为提取得到的镰叶芹二醇的1H-NMR谱图;
图2为提取得到的镰叶芹二醇的13C-NMR谱图;
图3为提取得到的镰叶芹二醇的液相色谱图及色谱峰信息。
具体实施方式
本发明提供了镰叶芹二醇在制备抗菌药物中的应用,所述菌包括抗枯草芽胞杆菌、产气杆菌、青枯假单胞菌和根癌农杆菌中的一种或几种。
在本发明中,如无特殊说明,所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品。
在本发明中,所述镰叶芹二醇的提取方法,优选包括以下步骤:
将白前花胡根与乙醇水溶液混合,进行醇提后浓缩,得到醇提取浸膏;
将所述醇提取浸膏溶解于水中后有机溶剂萃取,将所得有机相进行浓缩,得到萃取浸膏;所述有机溶剂包括二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇中的一种或几种;
将所述萃取浸膏进行第一硅胶柱色谱分离,得到组分Fr.6;
将所述组分Fr.6依次进行第二硅胶色谱柱分离,得到组分B;
将所述组分B依次进行凝胶柱色谱分离和半制备色谱分离,得到镰叶芹二醇。
本发明将白前花胡根与乙醇水溶液混合,进行醇提后浓缩,得到醇提取浸膏。在本发明中,所述白前花胡根优选为干燥根,所述白前花胡根在使用前优选先粉碎至粒径为1~2mm。在本发明中,所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数优选为80~95%,更优选为85~90%,最优选为86~88%;所述白前花胡根的干重和乙醇水溶液的总体积之比优选为1kg:5~10L,更优选为1kg:6~9L,最优选为1kg:7~8L。在本发明中,所述醇提的温度优选为50~80℃,更优选为55~75℃,最优选为60~70℃;所述醇提的次数优选为3~5次,更优选为4次;单次醇提的时间优选为1~2h,更优选为1.2~1.8h,最优选为1.5~1.7h。在本发明中,所述浓缩优选为减压浓缩;所述减压浓缩的压力优选为0.05~0.08MPa,更优选为0.06~0.07MPa,最优选为0.065~0.068MPa;所述减压浓缩的温度优选为40~60℃,更优选为45~55℃,最优选为50~53℃。
得到醇提取浸膏后,本发明将所述醇提取浸膏溶解于水中后有机溶剂萃取,将所得有机相进行浓缩,得到萃取浸膏。在本发明中,所述水优选为热水,所述热水的温度优选为30~60℃,更优选为35~55℃,最优选为40~50℃;所述醇提取浸膏的质量与水的体积之比优选为1kg:1~3L,更优选为1kg:2L。在本发明中,所述有机溶剂优选包括二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇中的一种或几种,更优选为二氯甲烷;所述醇提取浸膏的质量和有机溶剂的总体积比优选为1kg:3~5L,更优选为1kg:3.5~4.5L,最优选为1kg:4~4.3L。在本发明中,所述萃取的次数为3~5次,更优选为4次。在本发明中,所述浓缩优选为减压浓缩;所述减压浓缩的压力优选为0.05~0.08MPa,更优选为0.06~0.07MPa,最优选为0.065~0.068MPa;所述减压浓缩的温度优选为40~60℃,更优选为45~55℃,最优选为50~53℃。
得到萃取浸膏后,本发明将所述萃取浸膏进行第一硅胶柱色谱分离,得到组分Fr.6。在本发明中,所述第一硅胶柱色谱分离采用的洗脱剂优选包括石油醚-乙酸乙酯;所述石油醚-乙酸乙酯中石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为25:1~0:1;所述第一硅胶柱色谱分离优选的洗脱方式为梯度洗脱,所述梯度洗脱过程中石油醚和乙酸乙酯的体积比优选依次为25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1和0:1。在本发明中,所述第一硅胶柱色谱分离采用的硅胶粒径优选为200~300目。在本发明中,所述第一硅胶柱色谱分离过程中优选还包括薄层色谱检测,合并显色相似的洗脱部位,得到6个组分,依次记为组分Fr.1、组分Fr.2、组分Fr.3、组分Fr.4、组分Fr.5和组分Fr.6,将所述组分Fr.6进行进一步分离。
得到组分Fr.6后,本发明将所述组分Fr.6进行第二硅胶色谱柱分离,得到组分B。在本发明中,所述第二硅胶色谱柱分离采用的色谱柱优选为C18反相硅胶色谱柱;所述第二硅胶色谱柱分离采用的洗脱剂优选包括纯甲醇和/或甲醇水溶液;所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数优选为40~99%。在本发明中,所述第二硅胶柱色谱分离优选的洗脱方式为梯度洗脱,所述梯度洗脱过程采用的洗脱剂优选依次为40%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、60%甲醇水溶液、70%甲醇水溶液、80%甲醇水溶液、90%甲醇水溶液和纯甲醇。在本发明中,所述第二硅胶色谱柱分离优选得到4个组分,依次记为组分A、组分B、组分C和组分D,将所述组分B进行进一步分离。
得到组分B后,本发明将所述组分B依次进行凝胶柱色谱分离和半制备色谱分离,得到镰叶芹二醇。在本发明中,所述凝胶柱色谱分离采用的色谱柱优选为Sephadex LH-20凝胶色谱柱;所述凝胶柱色谱分离采用的洗脱剂优选包括氯仿-甲醇混合溶液,所述氯仿-甲醇混合溶液中氯仿的体积分数优选为50%。在本发明中,所述半制备色谱分离优选为半制备型高效液相色谱层析;所述半制备色谱分离采用的洗脱剂优选包括甲醇水溶液,所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数优选为40~60%,更优选为45~55%,最优选为50~53%。在本发明中,所述制备型高效液相色谱层析或半制备型高效液相色谱层析采用的填料优选为C18反相硅胶。
在本发明中,所述镰叶芹二醇的纯度优选≥99.8%,更优选≥99.9%,最优选为100%。本发明提供的镰叶芹二醇的提取方法提取得到的镰叶芹二醇纯度高,产物收率高,工艺简单,适宜工业化生产。
本发明提供了一种抗菌药物,包括镰叶芹二醇和药学上可接受的辅料。在本发明中,所述抗菌药物中镰叶芹二醇质量百分含量优选为0.02~0.03%。本发明对于所述药学上可接受的辅料没有特殊限定,采用本领域技术人员熟知的药学上可接受的辅料即可。在本发明中,所述抗菌药物的剂型优选包括注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、膏剂和栓剂中的一种或几种。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
将2.0kg干燥的白花前胡根粉碎成粒径为1~2mm的粗粉,加入用90v/v%乙醇水溶液混合均匀,在50℃条件下提取4次,每次提取2h,合并提取液,在0.06MPa、48℃条件下减压浓缩至无醇味,得到醇提取浸膏,备用。其中,白花前胡根和乙醇水溶液(总量)的固液比为1kg:10L。
将所述醇提取浸膏溶解于45℃的热水中,用二氯甲烷萃取3次,在0.06MPa、45℃条件下减压浓缩至无溶剂流出,得到萃取浸膏。其中,醇提取浸膏的质量与热水的体积之比为1kg:3L;醇提取浸膏的质量与二氯甲烷的总体积之比为1kg:3L。
将所述萃取浸膏用甲醇溶解,与40~80目硅胶混合拌样,干法上样,硅胶柱色谱分离(硅胶的粒径为200~300目),采用石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1和0:1的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱,经薄层色谱进行检测,合并显色相似的洗脱部位,通过旋转蒸发仪和真空泵减压浓缩,得到6段组分,记为组分Fr.1、组分Fr.2、组分Fr.3、组分Fr.4、组分Fr.5和组分Fr.6,减压浓缩的温度为45℃,压力0.06Mpa;
将所述组分Fr.6经过C18反相硅胶柱色谱分离,依次采用40%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、60%甲醇水溶液、70%甲醇水溶液、80%甲醇水溶液、90%甲醇水溶液和纯甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱,得到组分A、组分B、组分C和组分D;
将所述组分B依次经过Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离(50v/v%氯仿-甲醇混合溶液洗脱)和NP7005C二元半制备液相色谱分离(80v/v%甲醇水溶液洗脱),通过旋转蒸发仪和真空泵减压浓缩,得到镰叶芹二醇(0.4g,收率为0.02%),减压浓缩的温度为45℃,压力0.06Mpa。
本实施例提取得到的镰叶芹二醇为黄色油状,经5%硫酸乙醇显色呈灰色,证明其可能为聚乙炔类化合物。
图1为提取得到的镰叶芹二醇的1H-NMR谱图,图2为提取得到的镰叶芹二醇的13C-NMR谱图。由图1~2得到1H-NMR和13C-NMR数据,如表1所示。
表1镰叶芹二醇的1H-NMR(CD3OD,600MHz)和13C-NMR(CD3OD,150MHz)数据
由图1~2和表1可知,本发明提取得到的化合物为镰叶芹二醇,其结构式如式I所示:
图3为提取得到的镰叶芹二醇的液相色谱图及色谱峰信息,其中,3.098min的峰为液相溶剂峰,7.231min的峰为镰叶芹二醇的峰。由图3可知,本发明提取得到的镰叶芹二醇的纯度为100%。
实施例2
实施例1所得的镰叶芹二醇对青枯假单胞菌、根癌农杆菌、产气杆菌、枯草芽孢杆菌的抗菌活性测试,具体步骤如下:
将上述菌种分别接种于培养基上,37℃培养24h后,从平板中刮取菌落,以LB液体培养基活化18~24h,活化好的菌种用麦氏比浊管测定细菌浓度,配制成1×106CFU/mL的细菌稀释液。
采用倍半稀释法,对镰叶芹二醇进行抗菌活性测试:向无菌96孔板的第一排加入190μLMH肉汤培养基,其余每孔加入100μLMH肉汤;向第一排每孔加入10μL镰叶芹二醇的药液(溶于DMSO中,第一排每孔药液中镰叶芹二醇的浓度为100μmol/L,向后依次倍半稀释),且每个药液三个平行,充分混匀后,从第一排吸100μL转入第二排,混匀后,从第二排吸取100μL加入第三排,如此重复直至最后一排,最后一排取100μL弃去;向96孔板中每孔补加100μL配好的菌悬液(1×106CFU/mL);在37℃培养24小时,以肉眼观察,药物最低浓度孔无细菌生长者,即为受试菌的最即为受试菌的最低抑制浓度,并以市售氧氟沙星作为对比,具体结果见表2。
表2镰叶芹二醇和氧氟沙星对受试菌的最低抑制浓度(MIC值)
由表2可知,本发明提取得到的镰叶芹二醇对枯草芽胞杆菌、产气杆菌、青枯假单胞菌和根癌农杆菌均具有良好的抑菌作用,且对枯草芽胞杆菌抑制活性接近阳性对照氧氟沙星。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述,但它仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部实施例,人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例,这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.镰叶芹二醇在制备抗菌药物中的应用,所述菌包括抗枯草芽胞杆菌、产气杆菌、青枯假单胞菌和根癌农杆菌中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述镰叶芹二醇的提取方法,包括以下步骤:
将白前花胡根与乙醇水溶液混合,进行醇提后浓缩,得到醇提取浸膏;
将所述醇提取浸膏溶解于水中后有机溶剂萃取,将所得有机相进行浓缩,得到萃取浸膏;所述有机溶剂包括二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇中的一种或几种;
将所述萃取浸膏进行第一硅胶柱色谱分离,得到组分Fr.6;所述第一硅胶柱色谱分离采用的洗脱剂包括石油醚-乙酸乙酯,所述石油醚-乙酸乙酯中石油醚和乙酸乙酯的体积比为25:1~0:1;
将所述组分Fr.6进行第二硅胶色谱柱分离,得到组分B;所述第二硅胶色谱柱分离采用的洗脱剂包括纯甲醇和/或甲醇水溶液,所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为40~99%;
将所述组分B依次进行凝胶柱色谱分离和半制备色谱分离,得到镰叶芹二醇;
所述凝胶柱色谱分离采用的洗脱剂包括氯仿-甲醇混合溶液,所述氯仿-甲醇混合溶液中氯仿的体积分数为50%;
所述半制备色谱分离采用的洗脱剂包括甲醇水溶液,所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为40~60%。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为80~95%;所述白前花胡根的干重和乙醇水溶液的总体积之比为1kg:5~10L。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为85~90%。
5.根据权利要求2、3或4所述的应用,其特征在于,所述醇提的温度为50~80℃;所述醇提的次数为3~5次;单次醇提的时间为1~2h。
6.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述醇提取浸膏的质量和有机溶剂的总体积比为1kg:3~5L。
7.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述第一硅胶柱色谱分离的洗脱方式为梯度洗脱,所述梯度洗脱过程中石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1和0:1。
8.一种抗菌药物,其特征在于,包括镰叶芹二醇和药学上可接受的辅料。
9.根据权利要求8所述的抗菌药物,其特征在于,所述抗菌药物中镰叶芹二醇质量百分含量为0.02~0.03%。
10.根据权利要求8或9所述的抗菌药物,其特征在于,所述抗菌药物的剂型包括注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、膏剂和栓剂中的一种或几种。
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