CN117158521A - 一种富含苹果多酚的混菌发酵产品及发酵制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种富含苹果多酚的混菌发酵产品及发酵制备方法。该方法采用两种兼性厌氧菌，即植物乳杆菌和酿酒酵母作为发酵菌种对苹果泥进行发酵处理，并采用膜过滤和柱色谱系统进行过滤和富集纯化，有效提高了苹果果实发酵产物中的苹果多酚含量，所得混菌发酵产品的总酚含量＞3.5g/L，有利于提高苹果果实发酵产物的抗氧化等生物活性，用于制备功能食品或化妆品。

Description

一种富含苹果多酚的混菌发酵产品及发酵制备方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种富含苹果多酚的混菌发酵产品及发酵制备方法。

背景技术

苹果是我国第一大水果，也是我国目前最具优势的农产品之一。它的种植范围十分广泛，中国辽宁、河北、山西、山东、陕西均已形成产业化，规模化，年产量和种植面积均居世界首位。苹果果实中含有的生物活性物质苹果多酚,具有很强的抗氧化性、清除体内自由基、抑菌、抗衰老、抗肿瘤、抗过敏等功能，广泛应用于医学、食品、制革和日用化工等领域,随着天然功能性成分研究的兴起,苹果多酚已成为研究热点,国内外学者纷纷从各领域多角度开展研究工作。苹果多酚，文献中也称为苹果总酚，是苹果中具有苯环并结合有多个羟基化学结构物质的总称，主要包括黄烷-3-醇类、黄酮醇类化合物、羟基苯甲酸类、二氢查耳酮、花色苷类等五大类，其中包括绿原酸、咖啡酸、儿茶素、原花青素等多种生物活性物质，在食品和化妆品领域都有广泛的应用。

苹果多酚纯品为淡黄褐色粉末,略带苹果风味,稍有苦味,易溶于水和乙醇。苹果中多酚物质的组成及含量常因品种、成熟度、种植条件和贮藏条件及时间、组织内不同部位而存在较大差异。苹果果实中含有的多酚物质不是游离存在的，是与多糖、蛋白等物质结合共存，必须对其结合力进行破坏才能将苹果多酚充分的提取出来。传统苹果多酚的提取工艺包括有机溶剂直接浸提和外力辅助溶剂浸提两类，一般是将苹果组织浸没与乙醇、乙酸乙酯等溶剂，或经超声、微波等外力协助，用有机溶剂对多酚物质进行富集，后除去溶剂，再经一定的纯化手段，得到苹果多酚纯品(苹果多酚的生物功能和提取方法综述，赵荣敏，石家庄职业技术学院学报，2019，31(2)51-53)。以上工艺能达到较高的提取收率，但需使用大量有机溶剂作为提取媒介，对环境形成潜在污染，且残留有机溶剂可能对相关食品化妆品的使用者造成伤害，对研发人员提出了开发新的提取分离技术的要求。

传统苹果产品的发酵制备多采用单一菌种发酵，如乳酸菌、酵母菌等。但发酵用菌株的选择及工艺的选择与产品用途有关。例如，CN201911016767.2提供了饮料用的发酵苹果浆，是苹果浆加入异抗坏血酸并采用复合酶酶解后采用植物乳杆菌发酵的产物。利用菌株代谢产生的短链脂肪酸、粘多糖等提高营养均衡性和抑菌性，减少防腐剂的使用。苟拥军等为提高发酵苹果浆的抗氧化功效，考察了植物乳杆菌发酵苹果浆的工艺，表明植物乳杆菌发酵提高了苹果浆游离态苹果多酚、没食子酸、绿原酸和芦丁含量提高，抗氧化作用提高(苟拥军,王雪,刘梁,等.植物乳杆菌发酵苹果浆的工艺优化及其抗氧化能力[J].农产品加工·学刊,2020)。李国薇考察了酵母菌种对苹果酒发酵液和鲜酒的品质影响，苹果榨汁后经果胶酶和SO₂处理，接种4％酵母菌发酵，发现“酵母菌种对苹果酒酿造过程中各理化指标、各多酚含量和抗氧化活性的总体变化趋势无明显影响；对苹果鲜酒的多酚组成、抗氧化活性无规律性影响。”(李国薇.苹果品种及酵母菌种对苹果酒品质特性影响的研究[D].西北农林科技大学,2013.)。杜袁莹考察了苹果汁发酵过程中苹果多酚单体的变化情况，考察的菌株包括)戊糖乳杆菌、乳酸片球菌、德氏乳杆菌乳酸亚种、野生链球菌、戊糖片球菌及两歧双歧杆菌，发现德氏乳杆菌乳酸亚种,戊糖乳杆菌以及两歧双歧杆菌为苹果汁发酵的优势菌株，其中乳酸发酵作用能够引发苹果汁多酚单体含量呈现升降交替变化；不同菌株发酵会产生不同的代表性多酚单体物。两歧双歧杆菌发酵的代表性酚类物为没食子酸；德氏乳杆菌乳酸亚种菌株发酵的代表物为鞣花酸(杜袁莹.益生菌发酵苹果汁酚类物质变化及降脂功效[D].西北农林科技大学,2019)。

由于单一菌种发酵发酵液成分相对单一、口感单一、风味欠佳。为解决这些问题，近年来，两种或两种以上微生物混合发酵植物浸提液备受学者关注，希望能够利用混合发酵中的协同增效作用，最大可能的改善浸提液的营养成分、风味等属性。曾莉等采用酵母菌和乳酸菌复合发酵木瓜酵素，并对其生物活性进行测定，结果显示混菌发酵的木瓜发酵液具有较高的总酚、总黄酮含量和优异的抗氧化能力。(曾莉,赵治巧,樊睿,等.酵母菌和乳酸菌复合发酵木瓜酵素生物活性分析[J].基因组学与应用生物学,2021,40(3):1121-1129)。李维妮考察了多菌协同发酵对苹果汁感官评估指标及多酚等香气成分的影响，考察的菌株包括嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、乳双歧杆菌和副干酪乳杆菌，发现菌种比例1:1:1:1、接种量2％、发酵时间24h，发酵温度37℃利于菌群生长，总酚含量较发酵前明显提高，但绿原酸、没食子酸等多酚含量均显著降低。

通过上述分析可以发现，乳杆菌发酵苹果浆的研究较多，其中植物乳杆菌配合酶解工艺有利于提高产物的游离苹果多酚含量，但需要额外的酶解工艺；其他乳杆菌发酵苹果浆仅对特定苹果多酚有一定影响，混合乳杆菌发酵苹果汁对部分有益多酚的含量升高似乎不利。而酵母菌单独发酵苹果浆对产物抗氧化作用的影响未发现可供参考的规律。

发明内容

针对传统苹果多酚发酵制备及提取技术存在的一系列问题，本发明的目的有二，首先是提供一种富含苹果多酚的混菌发酵产品，该产品的苹果多酚含量较高，适于制备具备抗氧化作用的饮料类食品或抗氧化作用的护肤类化妆品。其次是提供种富含苹果多酚的混菌发酵产品的发酵制备方法。该制备方法及所得的富含苹果多酚的混菌发酵产品减少了有机溶剂的使用。

为实现上述目的，采用的方案如下：

为提高苹果果实发酵产品的苹果多酚含量，本发明在发酵工艺和富集工艺两个方面进行了改进。

在混菌协同发酵中，乳杆菌和酵母菌是混菌发酵的方法之一，二者也是苹果发酵制品制备的常用菌。在发酵工艺的改进中，考察了混菌发酵工艺，不采用单菌发酵或多种乳杆菌混菌发酵，避免多种乳杆菌混菌发酵时绿原酸、没食子酸等有益多酚含量减少的弊端。而采用两种兼性厌氧细菌-植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为发酵菌种。作为兼性厌氧菌，两种菌株均适于在低氧及无氧环境下生长，而低氧及无氧环境可减少苹果多酚在发酵过程的损失。

在富集工艺改进中，采用膜过滤和柱色谱进行富集纯化，除去菌体及蛋白质、多糖等大分子，并减少苹果总酚之外的小分子杂质，进一步提高混菌发酵产品的纯度。

通过上述改进，本发明得到一种富含苹果多酚的混菌发酵产品，其相较于现有的苹果发酵产品而言，突出的特点是，以植物乳杆菌和酿酒酵母混合菌作为发酵用益生菌发酵而得。其中，植物乳杆菌是发酵制备苹果总酚的主要贡献菌，酿酒酵母与植物乳杆菌组成复合菌共同进行混菌协同发酵。因此，植物乳杆菌和酿酒酵母混合菌中植物乳杆菌和酿酒酵母的比例大于1:1，优选为2:1。

该富含苹果多酚的混菌发酵产品是苹果果实粉碎为苹果泥并经灭菌发酵后，进一步进行粗滤、超滤、柱色谱纯化而得。

经发酵、富集纯化，该富含苹果多酚的混菌发酵产品测得的酚含量＞3.5g/L。赋予代号为M-EITC S750发酵原液，可直接作为抗氧化饮料或化妆品使用，也可作为原料与其他产品混合配制具备更多功效的饮料或化妆品。

根据前述富含苹果多酚的混菌发酵产品所用菌株的特点及目标产物的理化性质等，对产品的制备工艺进行了改进，得到前述富含苹果多酚的混菌发酵产品的制备方法，包括如下步骤：

1)苹果泥制备及前处理：取成熟苹果果实粉碎至果泥状得苹果泥，加水搅拌均匀，转移至发酵罐，蒸汽加热至沸腾，灭菌；

2)菌种前处理：取益生菌接种至培养基，培养活化；

3)接种与发酵：将活化的益生菌接种至步骤1)的发酵罐中发酵制备发酵液；其中所述苹果泥与水的体积比为1:0.5～1:3；所述益生菌为植物乳杆菌和酿酒酵母混合菌，所述植物乳杆菌和酿酒酵母混合菌中植物乳杆菌和酿酒酵母的比例大于1:1；步骤3)所述接种的接种量为1％～10％；所述发酵的培养温度为20℃～37℃、初始pH为5.0±1.0℃、葡萄糖添加量为1％～2％(g/L)。

步骤1)至3)为前处理及发酵步骤。其中苹果泥与水的体积比优选为1:1。其中植物乳杆菌和酿酒酵母混合菌中植物乳杆菌和酿酒酵母的优选比例为2:1。其中步骤3)接种与发酵步骤的接种量优选为2％～5％，该接种量范围内菌株生长状态均理想，且利于苹果多酚的产出；步骤3)的接种量进一步优选为5％。其中步骤3)的发酵时间可为24h～60h，根据微生物学常识及发酵工艺常识，本领域人员可根据步骤3)的接种量及菌株生长曲线等合理选择不同接种量下的发酵时间，如接种量为5％时，步骤3)的发酵时间可为24h-48h；接种量为2％时步骤3)的发酵时间可为36h～60h。其中步骤3)的发酵培养温度进一步优选为28℃±7℃，由于发酵过程的温度实际为波动状态，在较好的温度控制条件下，再进一步优选的发酵培养温度为28℃±3℃。葡萄糖是发酵中添加的碳源，步骤3)的葡萄糖添加量优选为1％。

该制备方法进一步包含如下富集纯化步骤：

4)发酵液后处理：将步骤3)所得发酵液过滤除残渣，得发酵清液，加入维生素C，调节pH，加入超滤膜超滤，所得外液为滤过液。

5)滤过液处理处理：将步骤4)所得滤过液采用柱色谱系统进行富集纯化得混菌发酵产品。

其中步骤4)的维生素C可发挥抗氧化作用，利于抑制富集纯化过程中多酚的损失。优先的维生素C用量按照质量体积比计算为1％(g/L，即1g/100L)。发酵过程中发酵液pH往往降低，步骤4)可视具体情况采用常用pH调节剂如NaOH等调节pH，优选的将调pH为6.0±0.5。步骤4)的超滤膜可除去菌体及大分子蛋白质、多糖等非目标物质，优选的超滤膜为截留分子量5000Da的超滤膜，循环处理至内液体积＜5L。

其中步骤5)的柱色谱系统优选采用大孔吸附树脂纯化，尤其是XAD7PH型大孔树脂装载于色谱。色谱纯化优选采用丙酮体系进行洗脱，收集80％丙酮洗脱流份得混菌发酵产品。

本发明创造性的提供一种富含苹果多酚成分的产品以及其制备手段，可以有效富集苹果多酚，且减少有机溶剂的用量，是一种高效环保，具有成本优势的制备技术。本发明所得的M-EITC S750发酵液是一种以植物乳杆菌和酿酒酵母作为发酵菌种，对苹果泥进行混菌发酵制得的产品，采用国内产量丰富的苹果作为发酵底物，引入两种兼性厌氧细菌-植物乳杆菌和酿酒酵母进行混菌发酵，在发酵过程中微生物利用碳源氮源的同时，切断各类多酚物质与多糖、蛋白成分的共价与非共价结合，使多酚物质充分游离于发酵液中，将所得发酵液进行提取纯化，获得富含多酚物质，具有生物活性的发酵产物。

本发明有如下有益效果：

(1)本发明使用环境友好的发酵工艺将苹果多酚与多糖、蛋白等物质分离，再经过树脂提取技术富集多酚，工艺过程极大减少有机溶剂用量，生产过程安全环保，产品有机溶剂残留少，可安全应用于食品及化妆品领域；

(2)本发明能够显著提高苹果多酚的提取销量，使发酵液原液中的总酚含量大于3.5g/L，显著提高收率，降低生产成本。

具体实施方式

本发明公开了一种富含苹果多酚的发酵液及其制备方法，使用植物乳杆菌和酿酒酵母对苹果泥进行混菌发酵，所得发酵液再经膜处理和大孔树脂提取富集，得到富含苹果多酚的发酵原液，总酚含量＞3.5g/L。

以下通过较佳的实施例对该制备方法进行详细描述。需要特别指出的是，本领域技术人员可以借鉴本发明主要技术路线和实施例的内容，在不脱离本发明内容的范围内，对所述制备方法适当改动和变更，来实现同等或类似的技术效果。所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，应被视为包括在本发明保护范围之内。

实施例1苹果泥制备及前处理

称取30Kg成熟富士苹果果实，用XB-660型工业果蔬破碎机粉碎至果泥状，加水30kg，充分搅拌均匀，转入100L发酵罐中，蒸汽加热至沸腾，保持1h。将发酵罐密封，转入灭菌模式，设定灭菌温度121℃，灭菌压力0.13Mpa，灭菌30min。

实施例2菌种前处理

按如下处方配制MRS培养基：蛋白胨10g/L、牛肉浸粉5g/L、酵母浸粉4g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾2g/L、醋酸钠5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、七水硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.005g/L、琼脂20g/L，调节pH为6.5，温度121℃，灭菌20min备用。

按如下处方配制PDA培养基：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，115℃，灭菌20min备用。

在无菌操作台将植物乳杆菌(ATCC14917)接种于MRS培养基中，置摇床上35℃、140rpm培养24h活化。

在无菌操作台将酿酒酵母(WLP775)接种于PDA培养基中，置摇床上32℃、140rpm培养24h活化。

实施例3接种与发酵

将实施例2活化好的植物乳杆菌和酿酒酵母接种至实施例1的发酵罐中，按照如下参数进行发酵培养：

接种比例：植物乳杆菌：酿酒酵母＝2:1；

接种总量：5％；

培养温度：控制温度为28℃±3℃。

初始pH：5.0；

转速：150rpm；

葡萄糖添加量(g/L)：1％，即1g/100L；

发酵时间：48h。

实施例4发酵液后处理

所得发酵液板框过滤除去残渣，得到浅褐色发酵清液，以质量体积浓度(g/L)加入1％的维生素C(即1g/100L)，调节pH＝6.0±0.5，加入5000Da超滤膜处理系统，控制料液温度40±5℃，压力0.2Mpa，循环处理至内液体积＜5L，所得外液即为滤过液。

实施例5大孔树脂前处理

将乙醇浸泡XAD7PH型大孔树脂装载于色谱柱，柱径50mm，装柱高度60cm，用去离子水反复冲洗除去乙醇，再用5％氢氧化钠溶液、去离子水、5％盐酸溶液、去离子水依次各冲洗8BV，待用。

实施例6滤过液处理

实施例4的滤过液调节pH＝4.0，过1mm滤芯，以2BV/H流速加载至实施例5的大孔吸附树脂色谱柱，按照以下的表1流程洗脱：

表1色谱柱洗脱流程

洗脱液	流速	洗脱体积
			去离子水	6BV/H	6BV
5％乙醇	4BV/H	4BV
			5％丙酮	4BV/H	4BV
80％丙酮	2BV/H	6BV
			去离子水	6BV/H	12BV

收集80％丙酮洗脱流份，减压浓缩除去丙酮，调节pH＝6.5±0.5，即得到富含苹果多酚的M-EITC S750发酵原液。

实施例7总酚含量测定

将实施例6所得M-EITC S750发酵原液，按照Folin-Ciocalteu(F-C)比色法测定总酚含量，以不同浓度没食子酸标准品绘制标准曲线，测定实施例6所得M-EITC S750发酵原液中的总酚含量。结果显示，获得发酵原液总体积40L，总酚含量＞3.5g/L，颜色澄清，无异味，具有极佳的经济性和实用价值。

实施例8苹果果泥发酵及富集纯化

参照实施例1至实施例7的制备方法，调整所述苹果泥与水的体积比为1:0.5，植物乳杆菌：酿酒酵母＝3:1，接种量为2％，葡萄糖添加量为2％，发酵时长60h。发酵及富集纯化结束测定发酵原液总酚含量，结果量＞3.5g/L。

实施例9单菌发酵考察

参照实施例1和实施例2准备苹果泥和植物乳杆菌，按照以下发酵参数进行发酵培养，参照实施例4～7进行发酵液后处理并进行发酵液总酚测定，如表2结果所示，不同接种量及发酵参数情况下，发酵液中总酚提取量均低于前述混菌发酵结果。

表2植物乳杆菌苹果泥发酵条件及总酚含量

Claims (10)

1.一种富含苹果多酚的混菌发酵产品，由苹果果实粉碎为苹果泥经灭菌后，采用益生菌发酵制备而得，其特征在于，所述益生菌为植物乳杆菌和酿酒酵母混合菌。

2.根据权利要求1所述的富含苹果多酚的混菌发酵产品，其特征在于，所述植物乳杆菌和酿酒酵母混合菌中植物乳杆菌和酿酒酵母的比例大于1:1。

3.根据权利要求1所述的富含苹果多酚的混菌发酵产品，其特征在于，所述苹果泥发酵后依次进行粗滤、超滤、大孔吸附树脂纯化处理，所述混菌发酵产品的总酚含量＞3.5g/L。

4.权利要求1所述混菌发酵产品的发酵制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

1)苹果泥制备及前处理：取成熟苹果果实粉碎至果泥状得苹果泥，加水搅拌均匀，转移至发酵罐，蒸汽加热至沸腾，灭菌；

2)菌种前处理：取益生菌接种至培养基，培养活化；

3)接种与发酵：将活化的益生菌接种至步骤1）的发酵罐中发酵制备发酵液；

其特征在于，所述苹果泥与水的体积比为1:0.5~1:3；所述益生菌为植物乳杆菌和酿酒酵母混合菌，所述植物乳杆菌和酿酒酵母混合菌中植物乳杆菌和酿酒酵母的比例大于1:1；步骤3）所述接种的接种量为1%~10%；所述发酵的培养温度为20℃~37℃、初始pH为5.0±1.0℃、葡萄糖添加量为1g/100L ~2g/100L。

5.根据权利要求4所述的发酵制备方法，其特征在于，所述苹果泥与水的体积比为1:1。

6.根据权利要求4所述的发酵制备方法，其特征在于，所述植物乳杆菌和酿酒酵母混合菌中植物乳杆菌和酿酒酵母的比例为2:1；步骤3）所述接种的接种量为2%～5%。

7.根据权利要求4所述的发酵制备方法，其特征在于，所述发酵的培养温度为28℃±3℃、葡萄糖添加量为1%。

8.根据权利要求4至7任一项所述的发酵制备方法，其特征在于，进一步包含如下步骤：

4) 发酵液后处理：将步骤3）所得发酵液过滤除残渣，得发酵清液，加入维生素C，调节pH，加入超滤膜超滤，所得外液为滤过液;

5) 滤过液处理处理：将步骤4）所得滤过液采用柱色谱系统进行富集纯化得混菌发酵产品。

9.根据权利要求8所述的发酵制备方法，其特征在于，所述步骤4）的维生素C的加入量为1g/100L；发酵液调pH为6.0±0.5；所述超滤膜为5000Da超滤膜，循环处理至内液体积＜5L。

10.根据权利要求8所述的发酵制备方法，其特征在于，所述步骤5）的柱色谱系统为大孔树脂，使用丙酮体系进行洗脱，收集80%丙酮洗脱流份得混菌发酵产品。