CN117136983B - 一种利用旧金山乳杆菌发酵酸面团高产乙酸乙酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用旧金山乳杆菌发酵酸面团高产乙酸乙酯的方法，该方法包括：向旧金山乳杆菌菌液中加入乙醇，混合后，得到混合物；再将混合物加入至面粉中，揉匀后，进行发酵，得到高产乙酸乙酯的酸面团；所述菌株为旧金山乳杆菌(Fructilactobacillus sanfranciscensis)CCTCC NO:M2022514。本发明在采用特定的旧金山乳杆菌菌株进行发酵的同时，向发酵面团中添加低浓度的乙醇，有效提高了酸面团中乙酸乙酯的含量，实现了酸面团中酯类物质含量的提高，并有效提升了馒头的风味品质。
Description
技术领域
本发明涉及食品发酵技术领域，尤其涉及一种利用旧金山乳杆菌发酵酸面团高产乙酸乙酯的方法。
背景技术
酸面团(又称老面、酵子等)是传统天然发酵剂，其中发挥作用的微生物主要是乳酸菌和酵母。乳酸菌占据主导地位，而旧金山乳杆菌更是酸面团中的优势菌种，最具代表性，被认为是酸面团中的“土著”的菌种。它的存在对面团发酵具有重要意义，赋予发酵面制品优良的风味，质地和营养品质。旧金山乳杆菌发酵制作的面包具有怡人、温和的酸性风味，具有不同于其它酸面团乳酸菌的风味物质构成，显示了其在酸面团乳酸菌中的独特性和不可替代性。
旧金山乳杆菌(Fructilactobacillus sanfranciscensis)为异型发酵乳酸菌，代谢产物除乳酸外，还包括酯类、醇类、有机酸等多种风味物质，其中酯类物质主要是乙酸乙酯和乳酸乙酯等乙酯类，大量研究表明乙酯类物质是乳酸菌发酵面团的一类重要代谢产物，它们大多具有花香、果香等令人愉悦的香气，其香味清淡，散逸快并且逸散远。同时可与其他风味物质协同增效，是酸面团发酵馒头和面包中的重要风味成分。不同酯的存在可以对不同口味产生协同效应，这意味着酯也可以影响远低于其各自阈值浓度的风味。此外，大多数酯的浓度都在临界值附近，这一事实意味着浓度的微小变化可能会对风味产生巨大的影响。但是，目前对乙酯类物质的研究更多着眼于奶酪、红酒等发酵食品，对于发酵面制品中包括酯类物质在内的风味物质的研究多停留在种类和数量的描述上，大部分风味物质的产生途径及其来源微生物仍不确定。
一般来讲，酯的合成通过以下四个反应进行：酯化(酸和醇的反应)、醇解(酯和醇的反应)、酸解(酯和酸的反应)和酯交换(两个酯的反应)。乳酸菌中酯类的合成主要是通过酯化反应和醇解反应实现。目前有关乳酸菌酯类合成机制的研究也是集中于奶酪和葡萄酒风味有关的乳酸菌，根据已有的研究，乳酸菌中酯类物质的合成过程具有一定的共性。
有研究表明，对酯类物质的产量进行有效调控是提升食品风味的可行手段。目前的商业化生产中提高食品风味的方法主要是通过原料、辅料配方、微生物发酵、烘焙条件和添加香精香料五种。随着消费者对天然健康食品的日益青睐及国家监管部门对食品添加剂的控制日趋严格，酸面团发酵法则是用来提升馒头质构及风味的一条科学可靠的途径。
综上所述，对酸面团发酵过程中酯类物质的产量进行有效调控，能够更好地发挥旧金山乳杆菌等乳酸菌对馒头风味的提升作用。因此，供一种发酵酸面团中高产乙酸乙酯的方法，为调控乙酸乙酯在酸面团中的产生，提升馒头等发酵面食的风味品质提供了理论依据。
发明内容
本发明提供了一种利用旧金山乳杆菌发酵酸面团高产乙酸乙酯的方法，该方法能够有效提高酸面团中乙酸乙酯的含量，从而实现酸面团中酯类物质含量的提高，进而提升馒头的风味品质。
具体技术方案如下：
本发明提供了一种利用旧金山乳杆菌发酵酸面团高产乙酸乙酯的方法，包括：向旧金山乳杆菌菌液中加入乙醇，混合后，得到混合物；再将混合物加入至面粉中，揉匀后，进行发酵，得到高产乙酸乙酯的酸面团；所述菌株为旧金山乳杆菌(Fructilactobacillussanfranciscensis)CCTCC NO:M2022514，保藏日期为2022年4月28日。
上述旧金山乳杆菌均保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。本发明采用不同类型和不同浓度的乙酸乙酯合成前体物质进行试验，发现低浓度的乙醇能够有效提高酸面团中乙酸乙酯的含量；当然，这也与采用的旧金山乳杆菌菌株有较大关系，只有上述菌株才有较好效果。
只有低浓度的乙醇才能够有效提高酸面团中乙酸乙酯的含量，而添加高浓度乙醇不能显著地提升乙酸乙酯的产量；进一步地，所述乙醇在菌液中的终浓度为1～3mM。
进一步地，所述发酵的温度为29～31℃；所述发酵时间为12～24h。
所述旧金山乳杆菌菌液与面粉的质量比为1：1～2；所述旧金山乳杆菌菌液中菌种浓度为106～107cfu/mL。菌种浓度越高，产生的风味物质越多，产量越高，酸面团发酵的更好。
进一步地，所述旧金山乳杆菌菌液的制备方法为：
(1)将旧金山乳杆菌添加至扩大培养基中培养至对数期，离心，收集菌体；
(2)采用生理盐水或纯水冲洗步骤(1)收集到的菌体，再离心，收集离心后的菌体，重悬于生理盐水或纯水中，得到旧金山乳杆菌菌液。
扩大培养可以获得更多的发酵菌数，培养结束后清洗菌体，避免培养基对风味的干扰。
进一步地，所述生理盐水的质量浓度为0.9～1％；步骤(1)和步骤(2)中，所述离心的转速为6000r/min；时间为10min。
进一步地，以质量百分数计，所述扩大培养基的配方为：1～2％麦芽糖，0.2～0.4％酵母粉，0.5～0.7％胰蛋白胨，0.02～0.04％吐温80，1.0～2.0％鲜酵母提取物，pH5.6；其中，鲜酵母提取物的配制方法为：质量分数为15～25％的酵母溶于蒸馏水中，120～122℃高压灭菌12～17min，冷却后于4℃静置过夜，离心取上清，-80℃保存。
本发明还提供了如上所述的方法制备的高产乙酸乙酯的酸面团。
本发明还提供了如上所述的高产乙酸乙酯的酸面团在制备馒头中的应用。
所述馒头的制备方法为：取所述的发酵方法制备的酸面团，向其中加入面粉，揉匀后，进行二次发酵，发酵后放入沸水锅中蒸至20～25min，得到馒头成品。
进一步地，所述二次发酵的温度为29～31℃，发酵时间为1-2h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明在采用特定的旧金山乳杆菌菌株进行发酵的同时，向发酵面团中添加低浓度的乙醇水溶液，有效提高了酸面团中乙酸乙酯的含量，实现了酸面团中酯类物质含量的提高，并有效提升了馒头的风味品质。
附图说明
图1为实施例1中加入不同前体物质以及不同浓度的前体物质时旧金山乳杆菌的乙酸乙酯产量结果图；
其中，E为2mM乙醇水溶液，EA为2mM乙醇和2mM乙酸的混合水溶液；ET为2mM乙醇和2mM三乙酸甘油酯的混合水溶液，E*10为20mM乙醇，EA*10为20mM乙醇和20mM乙酸的混合水溶液；ET*10为20mM乙醇和20mM三乙酸甘油酯的混合水溶液；空白对照为不加任何前体物质。
图2为实施例2中旧金山乳杆菌Bj2、Sx14、Hw、Ah1、Lst、Ts14加入低浓度乙醇后，乙酸乙酯的产量结果图。
图3为实施例1中旧金山乳杆菌培养不同时间加入不同前体物质乙酸乙酯产量结果图；
其中，E为加入2mM乙醇，EA为加入2mM乙醇和乙酸；ET为加入2mM乙醇和三乙酸甘油酯；GT为只加入三乙酸甘油酯；空白对照为不加任何前体物质。
图4为实施例3中旧金山乳杆菌发酵面团乙酸乙酯产量曲线图。
图5为实施例4中旧金山乳杆菌Bj2、Sx14、Hw、Ah1、Lst、Ts14发酵面团时加入低浓度乙醇后，乙酸乙酯的产量结果图。
图6为实施例5不同处理方式的馒头用风味分析仪(GC-IMS)测定挥发性风味物质结果图；
其中“jm”为酵母对照组“-”为在发酵酸面团时未加入乙醇，“+”为在发酵酸面团时加入乙醇。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
下列实施例中提及的：旧金山乳杆菌Bj2，即：旧金山乳杆菌(Fructilactobacillus sanfranciscensis))CCTCC NO:M2022514，简称Bj2；旧金山乳杆菌Hw，即：旧金山乳杆菌(Fructilactobacillus sanfranciscensis))CCTCC NO:M2022513。
实施例1
以2％(v/v)的接种量将活化两代后的旧金山乳杆菌Bj2接种于SDB液体培养基中；
(1)分别向培养基中加入终浓度为2mM乙醇水溶液，20mM乙醇水溶液，2mM乙醇水溶液和2mM乙酸水溶液，20mM乙醇水溶液和20mM乙酸水溶液，2mM乙醇和2mM三乙酸甘油酯组成的混合水溶液，20mM乙醇和20mM三乙酸甘油酯组成的混合水溶液，培养12h和24h后，在4℃，6000r/min下离心10min，收集上清，得到菌液；
(2)取1mL菌液加入2mL正己烷中，充分萃取，过0.22μm滤膜，收集到气相小瓶中，用GC-MS测定；
(3)GC条件：色谱柱为HP-INNOWAX(60m×0.32mm，1.0μm)，载气为氦气，进样模式为不分流；柱箱升温程序经优化为：初始温度40℃，保持0min，以3℃/min升至80℃，保持0min，再以5℃/min升至110℃，保持0min，再以50℃升至200℃，保持2min；MS条件：接口温度280℃；连接杆温度150℃；电子电离源，电子能量70eV，离子源温度230℃，采集方式为MS2扫描，质量扫描范围m/z 29～350。
结果见图1、图3和表1。
表1为加入不同浓度乙醇，酯酶活性测定结果表；其中，加入低浓度2mM乙醇时酯酶活性有所提高，随着乙醇浓度逐渐升高，酯酶活性下降，更进一步说明了低浓度乙醇能够提高乙酸乙酯产量。
表1不同乙醇浓度下菌株Bj2的酯酶酶活
结果显示，旧金山乳杆菌培养时，加入2mM乙醇能够明显提高乙酸乙酯产量，当浓度扩大至20mM时，与空白对照没有差异，所以结果显示加入低浓度乙醇才能够提高乙酸乙酯产量，在加入低浓度2mM乙醇时，旧金山乳杆菌酯酶活性也最高。另外，旧金山乳杆菌培养12h和24h时，培养24h乙酸乙酯产量更高。
实施例2
(1)以2％(v/v)的接种量将活化两代后的旧金山乳杆菌Bj2、Sx14、Hw、Ah1、Lst、Ts14接种于SDB液体培养基中；
(2)分别向培养基中加入2mM乙醇；培养24h后，在4℃，6000r/min下离心10min，收集上清；
(3)分别取1mL菌液加入2mL正己烷中，充分萃取，过0.22μm滤膜，收集到气相小瓶中，用GC-MS测定，GC-MS测定条件同实施例1；
结果见图2。旧金山乳杆菌Bj2、Sx14、Hw、Ah1、Lst、Ts14在加入低浓度乙醇后，旧金山乳杆菌Bj2乙酸乙酯产量最高。
实施例3
(1)以2％(v/v)的接种量将活化两代后的Fructilactobacillussanfranciscensis Bj2接种于SDB液体培养基中，培养24h后，在4℃，6000r/min下离心10min，收集菌体。
(2)使用0.9％生理盐水或纯水冲洗，重悬后加入面粉，搅拌均匀，于30℃培养0h、4h、8h、12h、24h、30h、36h。
(3)取3g样品放入顶空进样瓶中，固相微萃取30min后，用HS-SPME-GC-MS测定旧金山乳杆菌发酵不同时间点产乙酸乙酯含量。
(4)萃取条件：将样品75℃平衡30min，将老化好的萃取头插入样品瓶的上空，75℃顶空萃取30min后进样。每次萃取前，将萃取头在250℃条件下老化10min。
结果见图4。当旧金山乳杆菌发酵面团时，发酵12h的时候乙酸乙酯含量最高。
实施例4
(1)以2％(v/v)的接种量将活化两代后的旧金山乳杆菌Bj2、Sx14、Hw、Ah1、Lst、Ts14接种于SDB液体培养基中，培养24h后，在4℃，6000r/min下离心10min，收集菌体。
(2)使用0.9％生理盐水或纯水冲洗，重悬后，得到菌种浓度为106cfu/mL的菌液，向菌液中加入乙醇至终浓度为2mM，混合后，得到混合物；再将混合物加入至面粉中，旧金山乳杆菌菌液与面粉的质量比为1：1，搅拌均匀，于30℃培养12h。
(3)分别取3g样品放入顶空进样瓶中，固相微萃取30min后，用HS-SPME-GC-MS测定不同旧金山乳杆菌发酵产乙酸乙酯含量。
结果见图5，旧金山乳杆菌Bj2、Sx14、Hw、Ah1、Lst、Ts14加入低浓度乙醇发酵面团后，旧金山乳杆菌Bj2、Ts14乙酸乙酯产量最高，进一步说明了旧金山乳杆菌Bj2是产乙酸乙酯优势菌株。
实施例5旧金山乳杆菌发酵面团在馒头中的应用
以2％(v/v)的接种量将活化两代后的F.sanfranciscensis Bj2接种于SDB液体培养基中，培养24h后，在4℃，6000r/min下离心10min，收集菌体。使用0.9％生理盐水或纯水冲洗，得到菌种浓度为106cfu/mL的菌液，加入低浓度乙醇(2mM)，混匀后，加入面粉(旧金山乳杆菌菌液与面粉的质量比为1：1)搅拌均匀，于30℃发酵12h后，再加入适量面粉和市售酵母，揉匀，30℃进行二次发酵1h，发酵后放入沸水锅中蒸至25min，得到馒头成品。酵母对照组处理方法同上，将市售酵母以20％比例溶于纯水中(和菌液同等体积)，加入面粉，搅拌均匀，30℃发酵12h后，再加入适量面粉，揉匀，30℃进行二次发酵1h，发酵后放入沸水锅中蒸至25min，得到馒头成品。
结果见图6。当酸面团中加入低浓度乙醇时，发酵的馒头乙酸乙酯含量也有所提高，另外当加入旧金山乳杆菌时，与酵母发酵对比，酯类物质和酸类物质的种类和含量都有所增加。
Claims (9)
1.一种利用旧金山乳杆菌发酵酸面团高产乙酸乙酯的方法，其特征在于，包括：向旧金山乳杆菌（Fructilactobacillus sanfranciscensis）菌液中加入乙醇，混合后，得到混合物；再将混合物加入至面粉中，揉匀后，进行发酵，得到高产乙酸乙酯的酸面团；
所述旧金山乳杆菌为CCTCC NO: M2022514；所述乙醇在菌液中的终浓度为1~3 mM。
2.如权利要求1所述的利用旧金山乳杆菌发酵酸面团高产乙酸乙酯的方法，其特征在于，所述发酵的温度为29~31℃；所述发酵时间为12~24 h。
3.如权利要求1所述的利用旧金山乳杆菌发酵酸面团高产乙酸乙酯的方法，其特征在于，所述旧金山乳杆菌菌液与面粉的质量比为1：1~2；所述旧金山乳杆菌菌液中菌种浓度为106~107 cfu/mL。
4.如权利要求1所述的利用旧金山乳杆菌发酵酸面团高产乙酸乙酯的方法，其特征在于，所述旧金山乳杆菌菌液的制备方法为：
（1）将旧金山乳杆菌添加至扩大培养基中培养至对数期，离心，收集菌体；
（2）采用生理盐水或纯水冲洗步骤（1）收集到的菌体，再离心，收集离心后的菌体，重悬于生理盐水或纯水中，得到旧金山乳杆菌菌液。
5.如权利要求4所述的利用旧金山乳杆菌发酵酸面团高产乙酸乙酯的方法，其特征在于，以质量百分数计，所述扩大培养基的配方为：1~2% 麦芽糖，0.2~0.4% 酵母粉，0.5~0.7%胰蛋白胨，0.02~0.04% 吐温80，1.0~2.0% 鲜酵母提取物，pH5.6；
其中，鲜酵母提取物的配制方法为：质量分数为15~25％的酵母溶于蒸馏水中，120~122℃高压灭菌12~17min，冷却后于4℃静置过夜，离心取上清，-80℃保存。
6.如权利要求1~5任一项所述的方法制备的高产乙酸乙酯的酸面团。
7.如权利要求6所述的高产乙酸乙酯的酸面团在制备馒头中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述馒头的制备方法为：取权利要求1~6任一项所述的发酵方法制备的酸面团，向酸面团中加入面粉和酵母，揉匀后，进行二次发酵，发酵后放入沸水锅中蒸至20~25 min，得到馒头成品。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述二次发酵的温度为29~31℃，发酵时间为1-2 h。
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